【doc】重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

【doc】重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达 重组人卵透明组蛋白在组赤酵母中的ZP3 表达 卷期l96 年月200311 生物工程 ChineseJournalofBiotechnologyVo1.19No.6 November20o3 重组人卵透明组蛋白在组赤酵母中的表达ZP3 唐组组琪璇潘善培肖组娟董组组春雪组彩组 组南大生殖免疫究中心学研广州(,510632) 摘要利用表人卵透明组达蛋白组组特定引物全组从上组增P.pastor/sZP3.hzP3cDNA 含跨膜序列的人卵区 透明组基因片段并在末端接上串组组酸组组序列的重组基因序列氨组增片段插ZP3,N;入表组组达体中pPIC9K; 组性化后的重组组粒组入中用高组度组组高拷组菌株然后甲醇组组目的蛋P.pastor/s,G418,白表达用.SDS- 和表组物达组果组组表的人达蛋白可以分泌到PAGEWesternblot.P.pastorisZP3培组液中并且可溶性好,. 组化前后的重组人蛋白均能抗猪与兔蛋白抗组生交叉反组体组组表的目的达ZP3ZP3,蛋白具有反组原性. 组组组人卵透明组蛋白表达ZP3,P.pastoris, 中组分组号文组组组献文章组号o786A1000—3061(2003)06—0758—05 卵透明组是哺乳组物卵组胞外包被(ZonaPellucida,ZP) 的一组糖蛋白基组它属异在介组组特的精卵组合组组精., 子组反组以及阻止多精子受精等方面起到重要作用…体. 已知在人卵透明组蛋白的组糖蛋白组分里首先参与3,ZP3精卵的组组组程抗的抗可以阻止精卵组组和组体.ZP3 合达到阻止受精的目的也就一直作组制避孕疫苗的研,,ZP3 潜在免疫原但是一存在的组组是无法组得大量天然个]. 的人蛋白用于抗生育究研分子生物的组展组突破学ZP3. 组一障碍提供了有利件条利用基因重组的方法在外表体达, 系组中大量表人卵透明组达蛋白可组免疫抗生育究研ZP3, 提供可而且成本低廉的卵透明组蛋白靠首先在中国.Duin组鼠卵巢组胞中表了人达蛋白等人(CHO)ZP3.Hams…分组在组菌昆组胞和虫组胞中组组表了达,P.pastor/s,CHO 人卵透明组蛋白除在组胞中表出可溶性透明组蛋达.CHO 白外在其他三组系组中卵透明组蛋白组累在组胞内且通,,,组破碎组胞组得的透明组蛋白只能溶于尿素溶液6mol/L中组组分组化组大的困组离来很组于组胞表人达,.CHO 卵透明组蛋白的成本高昂我组期望通组一组组廉价且方便, 的方法组得大量的人卵透明组蛋白通组改组引物组组和. 组组技组我组在巴氏组赤酵母中成功表出了达,(P.pastor/s)可分泌且易溶于培组液的人蛋白ZP3. 方法与1 材料1.1 组粒菌组与和组自公1.1.1:pPIC9KP.pastor/sInvitrogen司含全组人的组粒由本组组室利.ZP3cDNAhZP3/pPIC9K用博士组送的含全组人的组克隆制组HarrisZP3cDNAPBS. 组及生化组组和等限制组1.1.2:EcoRI,NotISacI, 组接组聚合组均组自生物工程宝大组有T4DNA,TagDNA()限公司酵母培组用和组自公司组;PeptoneYNBGibco;G418自州威佳公司广蛋白组组自上海生物化究所学研;ma~er;兔抗猪抗本组组室自制体羊抗兔组自ZP3;IgG/HRPVector 其组组组组组分析组它国组和组析柱和液相蛋白Laboratories;; 组化系组均组公司组品AmemhamPharmaciaBiotech. 寡核酸引物苷根据的序列组组下列1.1.3:hZP3cDNA, 表组组引物组增第位,第位基酸序列氨(1)hzP323408.组便于蛋白的分和组化离在目的蛋白的端引入了rhZP3,N组组个氨组组酸的基因序列且中分组加入6,Pl,P2EcoRI和组切位点由上海生工生物工程有限公司合成NotI().表引物序列1 Table1PrbnerSequencesPrimerSequences 一P2(3primer)5'-AYI'GCGGCCGCAACCAGGATAACAGCAGTCAGAGTC3 方法1.2 目的基因片段的组增以的组1.2.1hzP3:hZP3cDNA, 和组引物组行组增组增件条组性P1P2PCR.:94~Clmin; 退火延伸重组个循组组增组物在54~C30s;72~C2min.3O. 组脂糖凝中分胶离用组组盒组品操l%,(OmegaBio-tek,Inc,作按组明组组行回收). 构建重组组粒组组的上下游引物中1.2.2pPIC9K-rhZP3:, 分组含有和组切位点因此用上述组限制两oRINotI, 收稿日期修回日期:2003—06-05,:2003—09-08.基金组目广学组省自然科基金组目广划组省科技组组目组:(No.31883),(No.2003B30501) 助. 通组作者*.Tel:86—20—85220235;Fax:86—20—85220468;E-mail:txqx@jnu.educn 期唐组等重组人卵透明组蛋白在组赤酵母中的表达6:ZP3759组组切组化回收的目的基因片段组粒也用组组两.pPIC9K组组行组切组切组物用组组盒组化按目的基因片段的.. 摩组组度倍于的比例混合组片段两在l0pPIC9K,T4DNA组接组作用下组接反组以上组接组物组组l6?12h.1% 脂糖凝组胶泳组定组接组物组入感受组大组杆菌在.,AmD 平板上涂布组性克隆组行阳快速组定组组出+LB,PCRj,正确插入目的基因片段的组化子挑出组组的菌落在培.LB组液中组培组瓶按常组方法提取组粒组粒组序上海生,.( 工生物工程有限公司组序). 重组组粒组入用限1.2.3pPIC9K.rhZP3P.pastor/s:SacI制组组性化重组组粒组组组入组pPIC9K.rhZP3,P.pastoris(打孑组组公司组品操作按照组器组明组组行LBio-Rad,). 组组基因的整合在平板上挑出组1.2.4PCRrhZP3:MD 化子按公司操作作组组组增引物组,Invitrogen"PCR, 和PlP2. 组组高抗性组化子从板上挑出1.2.5C,418P.pastor/s:MD 组化子划涂组组布在组度组的,C,4182.5mg/mLYPD.C,418板上培组至组菌落出组将划涂组出的组菌落组组布,29?; 在组度组的平板上培组至C,4184mg/mLYPD.C,418,29?组菌落出组. 工程菌的组增和组组表达从组度组1.2.6P3:C,418 的平板上挑取组菌落到液中4mg/mLYPD-C4185mIYPD, 组培组瓶离将体心后菌接组到培组29~Cld;lOmLBMCY液中组培组瓶离将体心后菌组入培,29?1d;2OraLBMMY组液中组培组瓶期组每小组组充一次甲醇,29?4d.24 组组度组取培组液组行分析(1%).SDS-PAGE. 表组物的达分析离体心去除菌后1.2.7P3SDS-PAGE: 的培组液取透析组干溶解于组品溶解液后取,lmL,,40/IL, 在组度组的分中组行离胶组泳分析20/IL10%SDS.PAGE.考组斯亮组染色后用凝分析组件胶公,QuantityOne(Bio.Rad司组品分析表蛋白的分子量达含量和组度),. 兔抗猪多克隆抗的制组体按照本组组室的方1.2.8ZP3: 法分组化猪离蛋白免疫新西组白兔制组抗血清ZP3,,. 表组物的反组原性组组达完成组泳的表1.2.9:SDS.PACE达组物组组移到醋酸组组素膜膜上用配制的(NC),PBST 封组膜洗组次加入兔抗1%BSANC,37,lh;PBST?3;1:100猪抗体洗组次加入的ZP3,37,4h;PBST?3;1:10000HRP-羊抗兔底物组色IgC,37,lh;DAB-4HC1-H2o2?. 表组物的组化及反组原性组组达将清培组上液组1.2.10: 行组和组析培组上液组清膜组组后上组和组析.0.45/1m, 柱用酸组液磷冲含洗去.(0.02mol/L,0.5mol/LNaC1,pH7.4)未组合蛋白然后用个体柱组的含咪磷组的.l00—0.5mol/L酸组液组行组性冲脱洗分组收集穿透峰和洗峰脱组分用,, 脱脱组柱组组干后组行和分G25.,SDS-PAGEWesternblot析. 组果2 组增基因片段2.1rhZP3 从全组上用引物和组增出的基hZP3cDNAPlP2rhZP3因片段组组组片段组组位基酸的氨基1.2kb.23408hZP3 因片段即去掉了末端的前组组序列而保留了大部,hZP3N 分的末端跨膜序列区组增组物在组脂糖凝中组胶c.1% 泳组果如组中第泳道里的核酸组组组条即基,Fig.1.2rhZP3因片段. 组引物和组增1P1P2hZP3 Fig1TheresultofamplifyinghZP3fragmentbyPCR 1.DNAmarker;2.ThearnpedrhZP3fragment usingP1andP2as~mers 重组组粒的建构2.2 和双并组切组化后的和片RINotIrhZP3pPIC9K 段在组接组作用下组接成重组组粒将组接组物组T4DNA, 入感受组大组杆菌用快速方法组定平板上的组化.PCRLB 子将瓶成功组入了重组组粒的大组杆菌组组培组后提取. 组粒因组组粒的分子量组重组组粒.pPIC9K9.3kb, 的分子量组组从组脂糖凝上可胶pPIC9K.rhZP310.5kb.1% 以看出的迁移率稍组于将重pPIC9KpPIC9K.rhZP3(Fig.2).组组粒和组粒作组切组果如pPIC9K.rhZP3pPIC9K,Fig.3. 组定组化子2.3PCRP.pastor/s 组性化后的重组组粒组人后pPICgK.rhZP3P.pastor/s, 涂布在板上板是缺乏组酸的培组基氨MD.MD.P.pastor/s含有突组的组酸组组基因氨脱组组突组阻止了(his4),P. 合成组酸氨组上含有体氨脱氨野生型组酸pastorL~.pPIC9K 组基因它与能互组因此组入了重组组粒(HIS4),his4. 的能在组酸氨缺陷的培组基pPIC9K.rhZP3P.pastort~(MD 板上生组随机挑取个组化子用和作).3P.pastofis,PlP2 引物酵母基因组从中组增并体且用整合有组DNArhZP3, 的酵母作组照组增组果如组中可以看出pPIC9K,Fig.4.3 个组化子中整合有目的基因而组照菌无(1ane2—4),(1ane5) 组增组条. 生物工程卷76019 2 组组粒和重组组粒的组泳分析2pPIC9KpPIC9K.rhZP3 Fig.2AnalysisofplasmidpPIC9KandrecombinantplasmidpPIC9K.rhZP3 ThemolecularweishtofpPIC9K(1ane2)wassmallerthanthatofpPIC9K-rhZP3(1ane1) I2345 组组定整合有基因的口4PCRrhZP3P.astor/s Fig.4PCRanalysisofrhZP3geneintegratedintoP.pastor/sgenome ,1.DNAmarker;24.rhZP3fragmentswereamplifiedusingPIandP2asprimer8fromtherecombinantplasmidpPIC9K-rhZP3transformed intoP.pastor/s;5.TherewasnohZP3fragmentamplifiedfrompPIC9KtransformedintoP.pastor/s 表组物的达分析2.4rhZP3SDS-PAGE 从组度组的平板上随机挑出G4184mg/mLYPD.G4188 株工程菌在同组件下培组条培组组束后培组液心离去除. 菌体均取组透析组干后组行组泳分,lmL,10%SDS.PAGE 析组中第二泳道是组照表组达即体整合了组(Fig.5)., 的的表组物达它与它其个整合有重pPIC9KP.pastoris.8 组组粒的酵母在完全相同的件下培组条从组中看出在., 以下的组分里第菌株有组照表组所有的达没43kD,3,5—10 特表蛋白异达其中第三株工程菌的特蛋白表异达.3,5,9 量组高而第株工程菌蛋白表组达不同于其他工程菌,4. 组表蛋白的达分析5rhZP3SDS.PAGE Fig.5SDS-PAGEofexpressedrhZP3protein 1.Proteinmolecularweightmarker;2.ControlP.posur/sexpressedproteins; ,310.TransformedP.pastorisbyrhZP3geneexpres~drhZP3proteins组重组组粒的组切分析3pPIC9K.rhZP3 Fig.3RestrictionanalysisofpPIC9K?rhZP3recombinantplasmid1.DNAmarker;2.pPIC9K-rhZP3digestedbyEcoRIandNotI:3.pPIC9K(rhZP3digestedbyEcoRI; 4.pPIC9KdigestedbyEcoRI:5.TheamplifiedrhZP3fragment 兔抗猪多克隆抗人卵透明组的交叉反组体与2.5ZP3 将兔抗猪蛋白的抗血清与人卵巢组组切片组行反ZP3 组可以看到组抗人卵透明组组生了免疫反组体与,(Fig.6). 组中箭组所示的深色部分组透明组上的免疫即沉淀组组明, 兔体与抗猪透明组蛋白的抗可人卵透明组组生免疫交叉反 组可用于组组人卵透明组抗原我组用游的人卵所离做的,. 组组也得到相似的组果组片未组示(). 组兔抗猪蛋白抗血清与人卵透明组反组6ZP3 Fig.6Cross-reactivityofanti-pZP3antibodieswithhumanZPThealTowsshowtheimmune-precipltationofhZPandanti-pZP3antibodies 表组物的反组原性分析达2.6rhZP3 组了组组凝上的特蛋白组是胶异蛋SDS.PAGErhZP3 白组行了组组从看出除第株工程菌,Westernblot.Fig.54 以外其余个工程菌第菌株的表组物相达同,7(3,5—10), 但是第株工程菌的特蛋白表量异达最高因此只组取第3. 株工程菌和第株组照菌的表组物作达组3,42Westernblot 组取与中相同组品量上组完成后将所.Fig.5,SDS-PAGE, 有蛋白组组条移到醋酸组组素膜上封组后用抗兔;1%BSA, 猪抗和羊抗体兔分组完成一抗和二抗反组ZP3IgG/HRP. 在组色组作用下可以看到第株工程菌的特表蛋白组异达3 呈阳性组色组箭组所示而第和株菌组无性组阳色组(),24 组表明蛋白在中组得表且具有达(Fig.7).rhZP3P.pastor/s 反组原性. 期唐组等重组人卵透明组蛋白在组赤酵母中的表达6:ZP3761 123 组表组物的蛋白达印迹分析7rhZP3 Fig.7WesternblotofexpressedrhZP3protein1.OnetransformantwithoutexpressingrhZP3protein; 2.OnetransformantexpressingrhZP3proteinwhichcould reactwithanti-pZP3antibodies:3.ControlP.pastor/s 表组物的组化及反组原性分析达2.7rhZP3 表组物组组和组析组化的组果达如前面组rhZP3g.8, 穿透峰后面组接着就是蛋白的洗峰脱将分组收集,rhZP3. 的穿透峰和洗峰脱组分组行分析组果如SDS-PAGE,Fig.9. 可以看到第二泳道里有组化的蛋白箭组所示将rhZP3(). 它组作免疫印迹分析从组中可以看出只是组化的(Fig.10), 123 组蛋白组化后的分析9rhP3SDS.PAGE Fig.9SDS-PAGEofthepurifiedrhZP3proteins1.Proteinmolecularweightmarker;2.ThepurifiedrhZP3proteins; 3.Theflow?throughfractions; 组组3 解决来研人卵透明组蛋白的源是组行抗生育究的首要 组组之一我组参照等人的组组作了技组改组后.Harris,, 所表的达能组分泌于培组上清且可溶性好易于分rhZP3,, 离有反组原性的组分在组化后的组量也比组可组组组的., 组组组果令人鼓舞也有价组组组用于后组的究中研,. 但在本组组中也出组了一些组组有待于我组去研究和 组组比如相组于等人的组组组果我组的表组物达.Harris, 能溶于培组上清但其切原因组确清不楚只是推组由于我,. 组在组增基因片段组保留了末端的大部分跨膜}lZP3}lZP3C 区序列可能是组跨膜序列个区促成了蛋白的分泌,rhZP3.组比如表的达蛋白分子量不均一且小于组期组rhZP3,.尽管存在以上的一些组组但幸运达的是表的蛋,rhZP3白能被抗猪兔抗所组组体利用抗猪兔抗组组体ZP3.ZP3 人蛋白的主要依据是猪与人有高的很同源性zP:ZP3ZP3,猪的核酸序列人与的同源性组氨基酸同源性ZP3ZP380%, 组由于天然人透明组组得到很更组以分组化出离74%., 蛋白有反组原性穿透峰里组组出有反组没活性的组rhZP3, 分利用凝分析组件和蛋白组化系组组件分胶.QuantityOne 析组化的蛋白的表组分子量组组,表量达rhZP332kD34kD;不低于20mg/L. 组表组物组和组析达8rhZP3 Fig.8PurificationofrhZP3proteinsbyNi-chelating affinitychromatography12 — ' 组蛋白组化后的免疫印迹分析10rhZP3 Fig.10WesternblotofthepurifiedrhZP3proteins 1.ThepurifiedrhZP3proteinswhichcouldnlakean immunereactionwithanti-pZP3antibodies; 2.Theflow-thl~LIghfractions 组分用于免疫制组抗血清而猪蛋白组易组得又与ZP3.zP,人透明组具有免疫交叉反组性所以在得不到人抗体,,ZP3的情况下利用猪抗组组人体具有很强的组用性,ZP3zP.我组分组利用免抗猪抗人卵巢组组切片体与游的人离ZP3, 卵组行免疫反组均组组抗猪兔抗的可人透明组体确与,ZP3 组生免疫反组组明用抗猪兔抗组组人体蛋白是可,ZP3ZP3 行的由于所表的达蛋白能抗猪与抗反组体因.rhZP3ZP3,此可以组组表出的达蛋白具有人卵透明组蛋白的反组rhZP3 原性此外人组在抗生育究中组组组了一研另个令人组组., 的组象即并非只有全组蛋白引起的抗体才能阻止精,bZP3 卵组合它体断的某些小组段引起的抗同组能组阻精卵组, 合因此尽管我组所组得的蛋白可能不是全组.,rhZP3hZP3 蛋白但由于组具有反组原性它可以初步组定组具有用它,, 于后组究的组用价组研. 参献考文REFERENCES() [1]HarrisD,SeidChristopherA,FontenotGregoryK,LiuHuiF.Ex-pressionandpurificationofrecombinanthumanzonapellucidapro- 生物工程卷762l9 [2] [3] [4] [5] reins.teinExpressionandPur/fication,1999.16:298—307BiglerDora,ChenMichelhe,WatersSusan,WhiteJudithM.Amodeforsperm-eggbindingandfusionbasedonADAMsandintegrlns.TrendsinCellBio/ogy,1997,7:220—225 PatersonMargaret,JenningsZoeA,WilsonMartinR,AtikenRJohn.ThecontraceptivepotentialofZP3andZP3peptidesinaprimatemode1.Journa/ofReproductiveImmunology,2002,53:99—107 ,AitkenRJohn.Immunoeontmceptivevaccinesforhumanuse..,anlofReproductiveImmunology,2002,57:2002:273—287VanDuinM,PolmanJEM,deBreetITM,vailGinnekenK.Bun.schotenH,GrootenhuisA,Brin~eJ,AitkenRJ.RecombinanthumanzonapeUucidaproteinZP3producedbyChinesehamsterovary[6] [7] [8] 一cellsinducesthehumanaerosomereactionandpromotesspermggfu— sion.BiolR~rod,1994,51:607—617 SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcn'ng:Al~lbor{l— torymanua1.2ed.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press,1989 InvitrogenCorporation.Amanualofmethodsforexpressionofrt~om— binantproteins.USA 组琪璇组江组组海玲XIEQx(),ZHANGJL(),CHENHL(), 潘善培PANSP().Separationandpurificationof55kDporcinezona 组南pellueidaantigen.Journa/of.~nanUmvers(naturMsc/ence)( 大学自然科学版)(),1998,S1:82—82 ExpressionofRecombinantHumanZonaPellucida.3Protein (rhZP3)inPichiapastoris TANGJianXIEQi-XuanPANShan-PeiXIAOLuan-Juan DONGLuZHANGChun..XueSUNCai..Jun (CenterforReproductiveImmunologyRese~ch,JiannUniversity,Guangzhou510632,Ch/na) AbstractHumanZonaPellucida(ZP),whichisacomplexmatrixsurroundingoocytes,iscompriredofthreeimmunologically distinctglycoproteins(hZP1,hZP2andhZP3).BecausehZP3possessesthespermreceptoractivityandtheacrosome-inducingac- tivity,ithaslongbeenusedasacandida~antigentodevelopanimmunocontraceptivevaccine.However,alargeamountofna- tivehZP3proteinisunavailable.ItisaneffectivewaytoexpresshZP3proteindirectlyinvitro.Nevertheless.ithadbeenreport- edthattherhZP3proteinproducedinP/ch/apastoriswasnotsecretedbutaccumulatedinthecellsandcouldonlybepurifiedaf- terbeingsolubilizedbystrongdenaturants.Moreunfortunately,afterpurificationthefinalproductrequired6mol/Lureatomain- tainsolubility.AnimprovedprojectwasadvancedwiththeaimtoexpresssecretedandsolublerhZP3proteininyeast.Inthis ,study,thefragmentofhZP3cDNAcodingforaa23408,whichtheN- terminalleaderwasremovedandmostoftheC-terminal transmembrane- likedomainwasreserved.wasamplifiedbytwoPCRprimersincludingEcoRIandNotIsitesrespectivelyand aHis6codoncassettewasaddedto5termina1.ThehZP3insertwasincorporatedintoexpressionvectorpPIC9K.Theresulting recombinantyeastexpressionvectorwasdesignatedpPIC9K-rhZP3.LinearizedpPIC9K-rhZP3wastransformedintoP/ch/apasto- r/s.AfterG418selection,therecombinantPichiapastorisstrainswereidentifiedbyPCRandtherhZP3wasexpressedfollowing themanufacturer'sprotoco1.Followinginductionwithmethanol,therhZP3proteinwassecretedanddissolvedintotheculture supematant.SDS.PAGEandWesternblotanalysesshowedthattheapparentmolecularweightoftheexpressedrhP7_3proteinsin yeastwassmallerandalittlesizeheterogeneitythannativeones;afterpurifiedwithNi-chelatingaffinitychromatography,thefi- nalproduct'sapparentmolecularweightwasabout32— 34KDandtheiryieldmorethan20mg/L.WesupposedthattheC-termi' naltransmembrane.1ikedomainbeusefulforsecretionofrhZP3intotheculturesupernatantandtheexpressedrhZP3proteinbe incompletelydigestedbyproteinasesofPichiaintoshorterfragmentswhichallwereglycosylatedinhomogeneously-Fortunately, thefragmentsofrhZP3proteincanberecognizedinWesternblotbythepolyclonalantibodiestoporcineZP3whichhasshowed across.reactivitywithhumanZPinvitro.ItwillbeexpectedthattherhZP3proteinexpressedinP/ch/apastor/snotonlyhasim- munogencity,say,itcanriseantibodiesinvivotopreventspermatozoa- ovumbinding,butalsodoesnotcontainovarianfactors thatmightbethecauseofundesiredsideeffects,e.g.ovaritisandcanbeusedasasafeimmunogeninhumanantifertilityvac' c;neresearch. KeywordshumanZonaPellucida-3Protein,Pichiapastoris,expression 一Received:06O5—2003 Thisw.rkwassurpp0rtedbyGuangdongNaturalScienceFoundation(No.31883)andSeience&Technol.gYProjectofGuangdong(No.2003B30501) *Correspondingauthor.Teh86—20-85220235;Fax:86—20—85220468;E-mail:~gx@jnu?edu-cn