基因测序在人类腺病毒分型中的应用

基因测序在人类腺病毒分型中的应用 国际流行病学传染病学杂志年月第加卷第期 , ,.加.. ?综述? 基因测序在人类腺病毒分型中的应用 王旌朱剑锋童晓维 【摘要 人类腺病毒可引起呼吸道、胃肠道和眼部的感染。不同类型的腺病毒引起的疾病类型及表现不 尽相同。因此,腺病毒的分型具有重要的临床研究价值。在基因学上,编码六邻体蛋白,五邻体蛋白和纤维蛋 白的区域是腺病毒基因组中变异最大的区域,通过对其编码区的测序,尤其是六邻体蛋白编码区的测序,是 快速可靠的确定腺病毒类型的重要方法之一。此文主要对基因测序在腺病毒分型中的优势、应用现状,在腺 病毒突变重组、种系发生学中的鉴定检测等作一综述。 【关键词】腺病毒,人;基因测序;六邻体蛋白;五邻体蛋白;纤维蛋白. , . 【】 ,.,.. , . 【 】,; ;;; 人类腺病毒可引起呼吸道、胃肠道和 血凝抑制实验可作为附加的判定。 一、六邻体蛋白编码区测序与腺病毒分型 眼部的感染,分为、、、、、六种,不同类型的 腺病毒引起的疾病类型及表现不尽相同。? .六邻体蛋白结构特点 经常在眼部引起急性结膜炎和咽结膜热,但是 六邻体蛋白以三聚体形式聚合在一起,是病毒 ?中的、、三种血清型常常引起流行性 与外界交互作用的重要结构之一。在不同的组群 角结膜炎。因此,腺病毒的分型分类不仅具有科学 中,六邻体蛋白单体的氨基酸数量为不 研究价值,同样具有临床意义。为二十面体无 等,编码区约 ,位于腺病毒的基因区域内。 包膜病毒,其表面有种主要的囊膜蛋白,包括六 氨基酸序列研究显示,六邻体蛋白中有个高度变 邻体蛋白、五邻体蛋白和纤维蛋白,是构成囊膜的 异区,其中 位于襻上,位 重要成分,也是用于诊断的重要抗原。在基因学上, 于襻上。这些高度变异区覆盖了病毒表面% 以上的区域,是区分不同血清型腺病毒的重要标 编码这三类蛋白的区域是病毒基因组中变异最大 的区域,是腺病毒基因研究的热点区域?『。腺病毒 志,也是血清中和实验中特异的抗血清识别表位 研究协会在年明确提出腺病毒的鉴定和分型 决定簇。血清中和实验的局限 性在于,如果与已 应该以全基因组测序分析为基础,血清中和实验和 有的抗血清不能中和,则 需要通过复杂的交叉中和 实验来确定新的腺病毒类型,与全基因组序列分析 比较有时会出现错误】。 :./...... .六邻体蛋白测序在腺病毒分型中的应用 作者单位:上海市眼病防治中心眼科王旌、童晓 维,防治科朱剑锋 等通过对种已知血清型的腺病毒进 万方数据 , ,.,. 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期 大,并且血凝抑制实验不能涵盖所有血清型的腺病 行六邻体蛋白编码区的测序,揭示不同血清型病毒 毒,纤维蛋白的编码区不是基因测序以检测病毒分 保守区的变异为.%~.%,高变区的变异为 型的热点区域,单纯依据对纤维蛋白编码区的测序 .%~.%,并对保守区和高变区分别进行了种 以进行腺病毒的分类被认为并不可靠。 系发生学分析,为针对六邻体蛋白的基因测序在分 五邻体蛋白的编码区位于病毒基因组的区 子诊断和分类方面的工作奠定了基础。等” 域内,约. ,编码约个氨基酸。五邻体蛋白 也证实对包含六邻体蛋白个高变区的 长 编码区同样属于病毒基因组中变异很大的区域,这 度的基因片断的巢式扩增和测序可以对腺病 可能与五邻体蛋白需要与不同的纤维蛋白和六邻 毒进行快速的分型。等?通过全基因组测序 体蛋白连接有关。五邻体蛋白基底上高度保守的三 和血清学研究证实,对六邻体蛋白的个,五 肽??区域与细胞表面的结合素 邻体蛋白和纤维蛋白的编码区测序可以确定病毒 的血清分型。研究同时指出,在不同的血清型中 或第二受体相结合,协助病 毒的内吞。 因此针对五邻体蛋白的测序尤其是区域的测 也是高度变异的,也许可以成为新的基因测序目 序也是研究病毒毒力和致病性的热点。但是因为没 标。等【时所有腺病毒标准型的六邻体蛋白 有专门的血清学实验结合五邻体蛋白,因此,针对 高变区和纤维蛋白结节进行种系发生学分析,为病 五邻体蛋白测序无法确定病毒的分型。 毒的分子学分类提供了重要资料。等” 通过 .纤维蛋白和五邻体蛋白测序在腺病毒致病 对已确定血清型的标准腺病毒株进行六邻体蛋白 性判断中的应用 附近区域的测序,扩增区域长度在 , 尽管针对纤维蛋白和五邻体蛋白的基因测序 认为针对该区域的基因测序可以成为鉴定病毒血 清型的有效手段。等研究发现,针对 不是鉴定病毒分型的主要手段,但是针 对纤维蛋白 编码区的测序研究不仅把研究重点放在纤维蛋白 片段的测序在组群判断的正确率为 %,在血清型判断的正确率为%。 结节部,而且也关注纤维蛋白的体部和五邻 体蛋白 的区域。大量的研究显示,纤维蛋白体部和五 二、纤维蛋白、五邻体蛋白编码区测序与腺病 邻体蛋白的变异与腺病毒致病性强弱有关。等 毒分型 通过分子流行病学调查发现一株新的?在 .纤维蛋白、五邻体蛋白结构特点 纤维蛋白体部第个重复单位出现个氨基酸 纤维蛋白与五邻体蛋白在腺病毒进人宿主细 的缺失。等【研究发现纤维蛋白和开放读 胞的过程中发生了重要作用。纤维蛋白端尾部为 码框/的变异与腺病毒的进化与疾病暴发有关。 保守区域,与五邻体蛋白连接,端头部为球状的结 等?通过对全基因组测序的研究, 节,与宿主细胞表面的第一受体??柯萨奇/腺病毒 认为纤维蛋白体部相对较短,也许可以 受体结合,启动病毒内吞,并且其表位是 血凝抑制实验中的凝集素。纤维蛋白的编码区位于 解释该病毒较强的致病 性。等【提出 .的致病性与.和 病毒基因组的尾部的区域内,纤维蛋白基因编 在五邻体蛋白编码区内发生重组有关,导致五邻 码区较为短小,约. ,编码约个氨基酸。编 码区没有固定的保守区和高变区,整个编码区都属 体蛋白两个外部的高变 襻发生变化。等踅 通过对多株.的、、、纤维蛋 于变异性很大的区域,在技术上,设计特异性高的 白结节和五邻体蛋白的测序,发现它的变异极少, 引物相对困难。等?性匕较了和 认为它独特的结构与其在很多组织中都具有致病 的纤维蛋白基因的一致性,试图为纤维蛋白 性有关。 基因分型的应用提供理论基础。但是因为测序难度 万方数据国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期, ,.,. 三、基因测序在腺病毒中间株及种系发生学 .基因测序在腺病毒种系发生学中的应用 分析中的应用 基于基因测序的种系发生学分析,人类可以对 病毒种系问的突变和进化进行研究,也可以了解致 .基因测序在腺病毒中间株分析中的应用 病毒株所关联的突变。等对随机抽样粪 有很高的同种问杂交的能力,甚至偶尔 便样本中的腺病毒进行全基因组测序,发现存在大 出现异种间杂交,这会在临床样本中产生中间株, 量种间杂交的重组腺病毒,这些病毒塑造了种系发 即表达一种血清型的六邻体蛋白表位和另外一种 生学分析的基本形态。等【通过全基因组 血清型纤维蛋白表位的病毒。中间株可使病毒躲避 分析发现和一都是引起流行性角 人类免疫系统的攻击,导致病毒的流行暴发口“。因为 结膜炎的重要病原体,两者在五邻体蛋白和六邻体 中间株的存在,单纯针对六邻体蛋白测序可能会产 蛋白的编码区变异很大,但是在和纤维蛋白编 生误导瞪’必,需要进行全基因组测序,这被认为是 码区相对保守,这为进一步确定腺病毒感染引起角 腺病毒分类的金标准之一。等提出同时 对腺病毒的六邻体蛋白和纤维蛋白进行测序,当两 膜病变的基因决定位点 提供了重要的信息。? 等通过基因测序进行种系发生学分析,发现 者结果不一致时再进行病毒培养和全基因组测序, 引起流行性角结膜炎暴发的同为?病毒, 可以有效的发现两种腺病毒的同时感染和突变产 只有少量的突变。 生的中间株。 四、基因测序在分型中的应用优势 通过基因测序技术发现,的突变与重组 .大规模分型检测 大多与六邻体蛋白和纤维蛋白的编码区有关,往 与传统的血清中和实验、血凝抑制实验相比 往有更强的致病性,可能导致疾病的暴发。 较,基因测序所需样本量小,研究方便快捷,成本更 等报道了株导致流行性角结膜炎的腺病毒 低,因此被大量的应用在分子流行病学调查中。 ?和?,与的基因有.%~ 等丐亟过针对六邻体蛋白编码区中长度为 .%的相似性,但是其六邻体基因的和纤 区域的测序,完成了对巴勒斯坦南部地区儿童呼吸 维蛋白结节与所有种血清型的腺病毒都不相 道腺病毒的分子流行病学调查,发现该地区最常见 似。等?报道了例由变异的,芮毒株 的呼吸道腺病毒为?、?、? 一引起的急性呼吸道感染,通过对区域 和?。等通过针对六邻体蛋白编码 的测序确定该病毒株有涉及.、、.和 区中高变区的测序,从年月至年月 .开放读码框的 的缺失。等俐报 的例流感样疾病患者的咽拭子样本中发现 道了株引起新生儿急性呼吸道感染的病毒具有 例阳性的样本,其中?和? 的六邻体蛋白成分和 的纤维蛋 为最主要的病原体。等【 通过巢式扩 白成分,并命名其为 一。等瞄‘勰 增六邻体蛋白编码区中的片断,对泰国曼谷 通过对.的基因组分析,确定它是一个 等地?年间例门诊患者的咽拭子和 重组病毒,具备一的纤维蛋白初级细胞结合 粪便样本进行检测,咽拭子中最常见的为 部位,.的六邻体蛋白的 决定域, %和?%,粪便样本中最常见的为 .的五邻体的次级细胞结合部位,并且通 ?%。?等对马来西亚 过动物实验,初步证明该病毒的角膜致病性与 例儿童呼吸道感染的患者的咽拭子进行了巢式 .和?的成分有关。等 扩增,通过对 基因片断的测序,在例 分析了? ,发现该病毒株的六邻体 %患儿中发现腺病毒感染,其中例为 蛋白的和结构与?相似,但是其 ?,例为?。 他结构与?相似。 万方数据 , ,.,.国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期, , , . 】 .定量检测 . ,通过?对六邻体蛋白的保守区进行扩 , :?. 增,提高引物的结合效率及反应的稳定性,不仅可 , , , ..? ? 以定性的检测腺病毒,而且可以定量。等网对,:. . 余例骨髓移植后的儿童进行了外周血和粪便 . , , , 中腺病毒六邻体蛋白和纤维蛋白的定量检测,为这 ., . ,:? 类免疫缺陷患者的腺病毒感染检测提供了有效的 , , , . 手段。.等通过基因测序对例患者?的咽拭子和鼻黏液样本以及例结膜拭子样 本.,,:?.? , 】 , , . 中的腺病毒进行了分型,并通过?定量检测 了病毒含量。该研究同时还对例结膜炎患者使用,,:?. .剩余的眼药水进行了腺病毒浓度检测,测出其浓度 , 【】 , . : 大约为..拷贝/,显示了? ,, . ,, 的敏感性以及对低浓度样本测定的优势。 :?. 五、展望 . ? , 】 , ,? 随着技术的进步,基因测序在分型 ,,. 中的应用益完善。通过全基因组测序,新的腺病 :?. 毒不断被分离并定义,如?圜、?、 , , , . 】 ? ?、?等。基于基因测序和腺病,, . , 毒分型,可为开发新的腺病毒载体提供理论基础, , :?. 如等通过种系发生学分析,找到个新 , , , . 片断可能与次级的细胞识别有关,认为改变五邻体蛋白可能逃避人类已存在 的固有免疫反应,从而为 ,,:?. . 构建新的载体提供思路;同样,也为研究腺病毒疫 , , 【 , .. 苗提供了理论基础,如等发现修饰血清 ,,:. 型腺病毒载体的六邻体蛋白高变区可以激发 ., , 【 ,固有的中和抗体,诱导保护性免疫反应,可在此基 ?,,:?, . 础上进行疟疾和疫苗的研究。 , , , . 】 . ,,:参 考 文 献 .. 】 , , , . , . 】 , , ?,. , ,,:一. . ,:?. , , 】 , . ,,?. ,, ,,: ? . :. ?. . , , , 】 , , , ? . .,, . . :?. ,:?. , ’ , . 万方数据