【doc】马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切分析

【doc】马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切 马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶 切分析 7,7 J一 江苏农学院JOURNALOF.IIANGSUAGRICULTURALCOLLEGE1992,I3(2):1,5 马立克病病毒糖蛋白 酶切分析. 崔治中段玉友 ——一—/ B抗原基因克隆的 5, 擅要用狄可辛标记的马立克腐病毒(MDv】基因组DNA的BamHI—lx,片断为撵针,从建于 putts质粒中的GA株MDV感染细煎基因组DNA的基因文库中.筛选到MDV糖蛋白B抗原基因 REICT10NENZYMEANALYSIS0FMAREKDISEASE VIRUSGLYC0PR0TEINBANTIGENGENECL0NE CUlZbi-zhongandDUANYu-you (Dept.ofAnita.Set.andVet.Med.,JiangsuAgrlc.Col1.,Yangzhou225001) ABSTRACTWiththedigoxigenin-labeledBamHI—K3fragmentofMarek%di~aseviru(MDv) pnomkDNA"Itprobe,itMDVglycopro~inBantigen尽cneclonew88screenedfromtheGAstrain MDV-infcctedcellgenomicDN^liabrarybuikledinpUC18.Therestrictionenz'ymean~yus indicated thattheBantigengenedoneofGAstra~MDVshowednodifferencefromthatoftheRBIBf~'ai nMDV intheEcoRI.BamHI.SalIandHind?cut~tcs. KEYWORDSMDV;GlycoproteinBantigen;Geneclone;Re~icdonenzymeana~sm3o~~- 鸡马立克病病毒(MDV)是在分子生物学水平上研究得比较深入的为数不多的几个兽医 病毒Z--.目前.已有3个MDV基因被克耋并完全定序.它们是:释放到感染细胞外的A 抗原基因,与中和反应有关的糖蛋白B抗原基因及一个与肿瘤发生有关的38K磷蛋白 基因.在建立抗MDV的重组DNA疫苗时,这个B抗原基因及38K磷蛋白基因均是 需考虑采用的候选基因.鉴于笔者"已完成对38K磷聋白基因的克隆及Ross耽al已发表 的B抗原基因的全部核甘酸序及有关情报.本研究试图以利用已发表的情报为捷径.从基因 文库中筛选出这个B抗原基因克隆.从而为我国研制抗MDV重组DNA疫苗提供必要的条 件. 0奉研究为茸蕈自蒜抖学基盘及江苏省教委自然科学基盘受助理目 收穰日期:I孵1—11. 2江苏农学院第l3卷 1材料和方法 I.1在pUC18质粒中建立MDV基因组DNA基因文库 将GA株从MDV感染的成纤维细胞提取的基因组DNA,用限制性内切酶EcoRI 和SalI消化后,置于0.8%琼脂糖中屯泳(35V,12h).在用溴乙锭染色后,以噬菌体 DNA的Hind?消化物作为DNA片断大小的标志,从加有MDV感染细胞DNA样品 的条带中切下相当于3.9Kb的琼脂糖凝胶作电洗脱.将从琼脂糖中浸出的DNA与经 EcoRI和SalI消化的pUCI8质粒DNA作连接反应.用由此得到的重组pUCI8质粒 转化JM109株大脑菌.在古有Ampicilin,.X—gal和IPTG的LB琼脂平板上接种培养经 转化的大肠菌.在37?下培养约24h后,将所有可能古有外来DNA的重组质粒转化的 大脑菌个体形成的每个白色菌落转移接种到两块相同的仅古有Ampicilin的LB琼脂平板 上.一块用作菌落核酸分子杂交反应,另一块作菌种保存.以上过程原则上按Maniatis !ctal的方法进行. I.2探针DNA的制备及苗落分子杂交反应 MDV的GA株基因组DNA的BamHI—K片断在质粒中的克隆"用来制备探针 DNA.该质粒DNA在用BamHI消化并电泳后,切下古Kl片断的凝胶作电洗脱.用 非同位索DNA标记和检测试剂合(MolecularBiologyBochringcrMannhcim)提供的试 剂和方法将浸出的K,片断DNA标记上Digoxigenin.为了筛选与KJ片断有同源性的重 组pUCl8质粒.在将所有白色菌落转移至硝酸纤维膜后,按Maniatisetal的方法. 经1%SDS,0.5tool/L氢氧化钠变性及lmol/LTris(pH8.0)中和等处理后,在8O?下 焙烤2h.用Digoxigcnin标记的DNA探针对菌落作核酸分子杂交反应仍按非同位索 DNA标记和检测试剂合提供的试剂及步骤进行,最后在加入底物NBT和磷酸盐后根 据星色反应来判定阳性菌落. I.3重组~ucls质粒的酶切图分析 经K1片断探针筛选到的菌落,将其大量培养后分别提取相应的重组质粒DNA.将 各重组质粒DNA分别用EcoRI,BamHI,Hind?及SalI或其组合消化后.在0_8% 琼脂糖中电泳,以分别确定各可疑阳性重组质粒DNA的酶切图,并与已发表的 RBIB株 MDV的B基因的酶切图进行比较. 2结果 2-I筛选与MDV的BamHI-K3片断同源的置组质粒克隆 MDv基因组DNA的EcoRI-SalI消化物在pUCI8中建立的基因文库,其转化的 大肠菌在古有Ampicilin,X—al和IPTG的LB琼脂平扳上培养后,共得到470个白色 菌落.在用x片断探针做杂交反应筛选后得到4个有同源性的重组质粒克隆,即 pMGB99,181,211和212. 2.2用比较分析质粒DNA酶切图确定含完整B基因的质粒克隆 根据Rossetal的B基因的核苷酸序及其它资料,他们的完整B基因克隆DNA 结构如图I-A所示.所以,本研究用MDV基因组DNA的EcoRI-$alI消化物建立 于pUCI8质粒中的包含该完整的B基因的重组质粒应表现为图卜B所示的酶切图.为 第2期崔治中等:马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切分析3 了确定所筛选到的与K片断有同源性的重组质粒克隆是否还包括除K,以外的这个完整 B基因的其它DHA序列.分别分析了4个有同源性的重组质粒DHA的酶切图.图2表 明,只有重组质粒pMGBI81表现出与图)-B所期待的相同的酶切图.表1分别列出了 在用EcoRI,BamHI,HindIU和SalI或其组合消化时,图I-B表示的含B基因重组 质粒应该显示的DHA条带及重组质粒pMGBI81实际显示的DHA条带. (a) (c) CK,LE EcoRI一058n472舟5SaiI Sa!I HindJ【lBamHI AB 圈1MDV的B抗原基因在病毒基因组DNA酶切圈上的位置及 建于pUCi8中的该基因的重组质粒克隆的酶切圈 (图中数字的单位是Kb,A根据Ross吐al,1989) n0ILoeslloltheBantl~ugen?tk~MDVgemomJ~DNArestrictlomenz-$measptheRE atsitesoftherceomblasatpl~|dIt]oDeoftheBsntlg~a霉elhpUCIS (Theunit:SKb,Fig.IAisaccordingtoRosscta1..1989) 圈2重组质粒DNA的酶切分析 n2Restrlctlosenzyme?HlyBoftk~recombilsmtph~mld]DNA -{, 4江苏农学院第13卷 A从左到右,槽1—4分别是BimHI-Hind]1I诮化的pMGB212,21I,181和99;槽5,6,9, 1O分别是EcoRI-HindIT[诮化的pMGB212.2Il,99和181;槽8,Il,l2.13分别是EeoRI - BamHI诮化的pMGB212,211,181和99.槽7和14是土噬菌体DNA的Hind~诮化物作为DNA 片断大小的标志. AFromthelefttotheri~ht.Lines1,4:BamHI-HindmdigestedpMGB212.211.18land99; lanes5,6,9|l0=E~oRI—HindmdigestedpMGB21211,99and181;lanes8.l】,I13:EeoRI-BamHI diSestedpMGB212.211,]81and99;lanes7and14:inmbdaphageDNAHind?digest~a5markers. B从左到右,槽I,4分别是pMGBIS!经Hind~.E~oRI及EcoRI-Hindm消化的产物和噬 菌体DNA的Hind~诮化产物作DNA片断大小的标志. BFromthe]eRtotheright.La?B1,4:pMGBIS1digestedbyHind?,EcoRIandEeoRI—H_山d ?,andinmbdaphageDNAHind?digest勰markers. 表1重组质杖pMGBI81限制性内切酶分析比较 "raid一1Ceml~'tmaInrestrktlueitzymeanalysisoftherecombinantplasmlclpMGB181 ?根据皤la;0期特羊.到的3.26Kb厦3.34Kb两务带已挂鬻在一起:0不 电津后B越出蠢帔. 3讨论 固片断太小, 虽然马立克病疫苗已成功地控{ii了该病在鸡群中的流行.但由于该病毒为细胞结合病 毒,疫苗的有效保护率有鞍于使用保存于液氮中的活细胞疫苗,这大大限箭了它的应用范 围.近几年来,几个发达国家开始着手利用重组DNA技术来研制抗马立克病的基因 苗,试图将编码与免疫保护反应有关的蛋白质的基因整台进适宜舶载体中,如鸡瘟病毒, 以期得到更有效更方便的疫苗.马立克病病毒的100K60K和49K糖蛋白复合体即所谓 B抗原墨与病毒中和反应有关的,所以这个B抗原基因被认为是建立重组DNA疫苗最 重要的候选基因.Sitholetal和Rosset丑1分别报道他们鉴定出这个B基因),但他 们的B基因在MDV基因组DNA酶蜘图上位于两个相距很远且互不相关的片断上.显 然.二者中有一个是错的.由于Rossetal已完成了该基因的全部定序,并确定基因内没 有剪接过程,由此确定的译读次序也证明能编码相应的糖蛋白.不久前.美国农业部家禽 研究所的一个试验也有力地支持Rossetal的结论(Lee,1989,束发表). 笔者曾鉴定出MDV的一个编码与肿瘤发生有关的38K磷蛋白基因,并完成了该基 第2期崔治中等:马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切分析5 因的全部棱甘酸定序,确定了其译读次序并使基因秆状病毒在一昆虫细胞中表达?. 最近.这个完整的基因已整合进鸡痘病毒并表达出来(Lee.1990,个人通讯).可以设 想.如果我们能得到B抗原基因并将其整合进鸡痘病毒,那么就有可能建立起一个抗马 立克病的基因工程疫苗.Rosseta1虽然已发表了B抗原基因的棱苷酸序,但他们得 到的完整的B基因克隆已申请了专利,将不会向他人提供(-1-人通讯,1989).我们要建 立自己的基因工程疫苗.就必须自行建立和筛选这个B抗原基因克隆.本文则利用B抗 原基因的已发表情报.成功地了一个较易筛选到该基因的途径.鉴于Rossetal的基 因克隆是一个两端分别为EcoRI和SalI牯性末端的3.9Kb片断并与BamHI—K片断 有同源性,我们用通过电泳电洗脱选取MDV基因组DNA经EcoRI-SalI消化产生的 3.9Kb左右片断来建立基因文库.并用K,片断作探针,这大大提高了阳性筛选率. 对于一个用K片断探针筛选到的古有BaraHI切点的重组质粒DNA.其组成只有 两种可能性,郎与K片断的左侧及相连的K:片断(见图IA(a))的右侧相重叠,或与 K片断的右侧及相连的L片断的左侧相重叠.如图1A(b)(c)所示(如Rossetal的 B基因那样).一般来说,由于限制性内切酶特异性高.在两个大小为3.9Kb左右的不同 DNA片断中,同样出现4个相同的酶切点且这些酶切点的相对位置也完全一致,这种机 率极小.鉴于重组质粒克隆pMGB181的酶切片断大小与所期待的B抗原基因克隆(图 lB)完全吻合(表1),显然,这个克隆确实含有完整的B抗原基因.对pMGB188的两 端做DNA序列分析证明.其EcoRI切点端的序列与Rosseta1报道的序列完全一 致.该研究还表明,分男来自RBIB株及GA株MDV的B抗原基因的EcoRH,Hind ?,BamHI和SalI切点完全相同. 参考文献 ICou翻en'PMeta1.L.F.StructureandcomDlerenuc~ofidesequenceoftheMarIdisease herpesvirmgp$7-65ecnc.JVirul,1988;62:2373,2379 2CuiZeta1.Marek'sdiseaseVirusecncclonesencodingvirus-specificphosphowht~lpolyp eptid~ and8crologic~1characterizationoffusionproteins.VirusGc?.1990;S:309,322 3崔治中等.马立克病毒pp38基因的编码序列及泽读框.江苏农学院,1991;I2(?:l,5 4FukuchiKeta1.StructureofMarcksdiseasevirusDNA:detalled船tf;ctiO?ellzylnemap.JVir01, 1984;5l:IO2,109 5Man血Teta1.MolecularCloning:ALaboratoryManua1.Coldspaa~HarborLaboratow,CoM springHarbor,NY,1982 6RolinLJNela1.NucleotideSequenceandcharacterizationoftheMarek,曩d~casevJ2"~llghomologueof mycoprote,inBofherpessimplexvirus.JgenVirol,1989;70:l789,1804 7Si也DleIeta1.Advan~inMarek~Diseas~I~search.Onh,Japan,1988.148,l54 B崔治中等.用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病毒38Kd磷蛋白基因.病毒学杂毒,1992; 7(1):l07,ll3 (嫡辑刘明寿)