茶多酚对人胚肾细胞（HEK293）作用的实验研究（可编辑）

茶多酚对人胚肾细胞（HEK293）作用的实验研究（可编辑） 大连医科大学 硕士学位论文 茶多酚对人胚肾细胞(HEK293)作用的实验研究 姓名:杨杨 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:李卫平 20050601茶多酚对人胚肾细胞作用的实验研究 硕士研究生:杨杨 教授 指导教师:李卫平 专业名称:药理学 摘 要 目的: 茶多酚 ,是茶叶中所含的一类多酚类化台物 的总称。近年来大量实验研究证实具有清除自由基、抗氧化等生物 活性,在抗癌、降压、降脂、降血糖、抑菌等方面有良好的功效。茶 多酚作为高效清除氧自由基剂,阻止脂质过氧化等作用,本课题旨在 细胞水平上研究茶多酚对人胚肾细胞受损伤后的保护作用,为 茶多酚应用临床器官保护探讨一条思路。 方法: .实验分三部分: 不同剂量、、、、/对正常细胞 存活率的影响。 不同剂量、、、、/对细胞过氧 化氢损伤后的影响。 不同剂量、、、、/对细胞顺铂 损伤后的影响。 .观察指标: 采用微量自动比色法,观察不同处理组细胞存活率。 采用生化分析仪分别测定细胞培养液中乳酸脱氢酶含量和 一羟丁酸脱氢酶含量。 .结果: 不同剂量对细胞存活率有不同影响,小剂量、、 ?。/可提高正常细胞存活率.,但大剂量 /可降低细胞存活率.;不同剂量对 细胞形态学影响与正常细胞比较无明显改变。 与正常组比较,过氧化氢损伤模型组明显降低细胞存活 率,升高细胞和.; 与过氧化氢模型组比较,不同 剂量可提高细胞存活率.,、/明显降低 和.;过氧化氢损伤模型组引起细胞形态学 改变,不同剂量可改善此改变。 与正常组比较,顺铂模型组明显降低细胞存活率,而 和明显升高.;与顺铂模型组比较,、/ 存活率明显提高.,、、、/明显降低 和.;顺铂模型组引起细胞形态学改变,加入不 同剂量可改善此改变。 结论: .过氧化氢和顺铂对细胞的损伤可引起细胞存活率降 低、和升高以及细胞形态学的改变,与国内外文献报道一 致。 .、/对过氧化氢和顺铂所致细胞的损伤有 改善作用,提高细胞存活率,改善细胞形态学变化。 .对细胞存活率有影响,较低剂量、/ 可促进细胞生长,而较高剂量/贝降低细胞存活率;较低 剂量有保护作用,大剂量具有细胞毒性作用。 关键词:茶多酚氧自由基乳酸脱氢酶.羟丁酸脱氢酶 : . : : :. . ,。. : 。凳 . . 。 . : 。 、、/. .;. ... 、 / . ?‘ . ....,..、、、/ . . :. , 。 .. ,. /. /. :?‘茶多酚对人胚肾细胞作用的实验研究 硕士研究生:杨杨 教授 指导教师:李卫平 专业名称:药理学 吾 随着器官损伤疾病发生的增多,人们对器官的保护越来越重视, 尤其在器官移植的方面对器官的保护显得尤为重要。近年来大量实验 研究证实,大多数器官损伤的机制是氧自由基毒性学说和钙离子超负 荷学说【?,两者相互关联。其共同结果是导致细胞膜性结构破坏以及线 粒体功能障碍,生成和储备减少,从而不能修复受损的组织细胞。 近年来从中药中筛选高效低毒的药物应用于器官保护怛。,通过抗氧自 由基,调节血管张力、血压、器官血流量,改善血小板功能,改善微 循环,减少器官缺血再灌注损伤,取得不小进步。 茶多酚 ,是茶叶药效的主要活性成分,占茶叶 干质量的%~%,其主要组分为儿茶素,占其总量的 %左右。茶叶中儿茶素主要为表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯 、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯 等,其中含量最高,占儿茶素的%左右。儿茶素结构中至少 有、、三个环核,是.苯基苯并吡喃的衍生物。其中以表没食子 儿茶素没食子酸酯含量最高,抗氧化能力最强。茶多酚在其 环和环上的酸性羟基具有很强的供氢能力,能中断自动氧化为氢过 氧化物的连续反应,从而阻断氧化过程【】。茶多酚的抗氧化作用明显优 于公认的抗氧化剂维生素和维生素。近年来大量实验研究证实, 上述作用在抑菌、抗病毒、防癌抗癌、抑制肿瘤等方面具有明显功 效母。本实验利用茶多酚清除氧自由基和抗氧化能力,在细胞水平上 研究茶多酚对人胚肾细胞受损伤后的保护作用,为茶多酚应用临床器官保护 提供一定的实验依据。 材 料 .药物 茶多酚,江西茶场茶多酚分厂批号,由大连理工大学李楠 教授提供,生理盐水溶解配成/,用时以细胞培养液稀释 所需浓度。 .细胞株 细胞株,由大连医科大学附属二院细胞室友情赠送 .试剂 噻唑兰一,一?, 公司,批号:; ?, 溶液的配制:称取溶于预热至。的,并用磁力搅拌器使其 完全溶解,溶解后用.滤膜过滤除菌,配制成浓度为/的 贮存液,?避光保存。,公司,批号:; 小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;过氧化氢,丹东塑料 助剂厂,批号:用稀释成/溶解后用. 滤膜过滤,密封避光保存备用;顺铂,’德州德药制药有限,批号: 用稀释成/溶解后用.滤膜过滤,密封 避光保存备用;其余试剂均为市售分析纯。 .仪器 .型超净工作台,苏净集团安泰公司;型二氧化碳培 养箱,美国 公司;型倒置显微镜,重庆奥林巴斯公 . 司;型全自动酶标仪,芬兰公司; 型微量振荡器;型高速低温离心机,德国公司; ?型离心机,北京医用离心机厂;.型电光分析天平,上 海天平仪器厂;低温冰箱,韩国公司;日立全自动生化分 析仪,日本日立公司。法 方 .细胞准备 取正常培养细胞,用细吸管反复轻轻吹打成细胞悬液, 移入离心管中,/离心分钟,去上清液,加入含小牛血清 的培养基并将细胞数调至.个/,接种于细胞培养板 孔板接种./孔每组设复孔,置于。,%培养箱中培 养小时。 .对正常细胞的影响 .:细胞存活率的测定??微量自动比色。 取培养小时细胞,加入已配制好的/终浓度 为、、、、/继续培养小时,于终止培养前小 时加入% /:,置于。,%培养箱中继续培养小时。 弃去上清液,加入二甲基砜./孑,振荡分钟,待甲躜 结晶充分溶解,酶标仪设测定,参比九测定,记录值, 计算细胞存活率。 给药组 ×% 细胞生存率 正常组 .:细胞形态学观察 将细胞培养板放置倒置光学显微镜下,观察细胞形态学变化。 .对过氧化氢损伤后细胞的影响 .分组 正常组,过氧化氢损伤模型组,过氧化氢损伤模型、、 、、 /组,每组设复孔。 .过氧化氢损伤模型制备 取前培养小时的细胞,加入已配制好浓度的过氧化氢 .//孑,置于。,%:培养箱中培养小时。 .给药 造模前小时将已配制好的/孔加入于细胞培养液中终浓度为、、、、 /。 .细胞存活率的测定??微量自动比色 ,于?,%。培养 细胞经上述处理后,每孔加入% 箱中继续培养小时,弃上清液,加入二甲基砜./孑溶 解甲躜,置微量振荡器上振荡分钟,待甲躜结晶充分溶解后,用酶 标仪标测其值,检测波长为,参比波长为。 细胞生存率?蓄蓍器争×,% . 和测定 小心吸取细胞培养液,采用生化分析仪测定细胞培养液中和 的含量。 .细胞形态学观察 将细胞培养板置于倒置显微镜下,观察过氧化氢对细胞形态学影 响。 .对顺铂损伤后细胞的影响。 .分组 正常组,顺铂损伤模型组,顺铂损伤模型、、、、 /组,每组设复孔。 .顺铂损伤模型制备 取前培养小时的细胞,加入己配制好顺铂 //孔,置于?,%。培养箱中培养小时。 .给药 造模前小时已配制好浓度的/孔加入于细胞培养液 中终浓度为、、、、 /。 .细胞存活率的测定 细胞经上述处理后,每孔加入% ,于?,%:培养 箱中继续培养小时,弃上清液,加入二甲基砜./孑溶 解甲臌,置微量振荡器上振荡分钟,待甲躜晶充分溶解后,用酶标 仪标测其值,检测波长为,参比波长为。细胞生存率?参喜君争×。。% . 和测定 小心吸取细胞培养液,采用生化分析仪测定细胞培养液中和 的含量。 .细胞形态学观察 将细胞培养板置于显微镜下,观察顺铂对细胞形态学影响。 .数据处理 计量资料数据用?表示,统计处理用.软件作方差分 析?程序,组间作检验。 结 果 .不同剂量丁对不同处理细胞存活率的影响 . 、、、/对正常细胞存活率有 明显影响.,其中、、/使正常细胞 存活率提高.,/使正常细胞存活率降低 .。见表卜图卜 表:茶多酚不同剂量对细胞存活率的影响 璺型里兰主苎 竺里壹翌兰竺正常组 ::】 ‘ / 一 ? 一 / .. ?.‘ / / ? ? / ?. 与正常组比较,.叭 ?与/./相比,.舯 ? ? 拿 糌 蚝 ? 灶 蚰 聂 卸 止鞲组 荆量/ 图?:茶多酚不同剂量对细胞存活率的影响 与正常组相比,. ?与/、/相比,. ..对过氧化氢损伤后细胞细胞存活率的影响 与正常组比较,过氧化氢./可明显降低细 胞存活率.;不同剂量、、、、/ 可减轻过氧化氢所引起细胞存活率的降低.,不同剂 量之间均有明显差异.。见表卜,图卜。 表?:茶多酚对过氧化氢损伤后细胞存活率的影响 组别 细胞存活率% 若盏 ? : ??毛再再?????蕊五面两甄广???丽五瓦???????一 损伤模型组?? ..。 .? ‘ 模型给药组 ..? . .? 。‘ ?.一 ?.‘ . 一 .? 。‘ .?.一 ? 。‘ 一? . .?.‘‘ 注:?与正常组比较,. ?与过氧化氢损伤模型组比较,, ? 鲫 奎一脊蛭毕鐾再 蚰 ? 『 『? 々 “ 【??『, 组别 图.:茶多酚对过氧化氢损伤后细胞存活率的影响 ?与正常组比较,. ?与模型组比较,. ..对顺铂损伤后细胞存活率的影响 与正常组比较,’顺铂模型组细胞存活率明显降低 .; 、/可提高顺铂损伤模型细 胞存活率.,、、/无此影响.。 见表卜,图卜。 表?:.茶多酚对顺铂损伤后细胞存活率的影响 纽别 缅胞存活率% / ;?. 难常组?? ? . ? ? . 顺铂模型组?? ? 摸型绘药组 ? ?.。 】? . ? ? .?? 。‘ ? ?.‘ 川.??. ?与正常组比较,. ?与顺铂模型组比较,.?《 。??? 。? 。???? 。?? 。 ??? ??????? 一 一 一 一 一 一 晨模? ?口舢 模 艟型 模女?什四 ?不: 组别 图?:茶多酚对顺铂损伤后细胞存活率的影响 ?与正常组比较,,, ?与顺铂模型组比较,. .对不同处理后细胞培养液中含量的影晌 . 对过氧化氢损伤模型培养液中含量的影响: 与正常组比较,过氧化氢损伤使细胞明显增加 .; 、/明显降低过氧化氢损伤的升 高.。见表?,图?。 表:茶多酚对过氡化氢损伤后细胞培养液中 含量的影响;? ?与正常组比较,. 与模型组比较,.?;?伯??们?? 模型组 模型模型模本模型 正常组 组别 图::茶多酚对过氧化氢损伤后细胞培养液中含量的影响 与模型组比较,. ?与正常组比较,. . 对顺铂损伤后细胞培养液中含量的影响 与正常组比较,顺铂损伤细胞培养液中明显增 加.:与模型组比较、、/明显降低 的升高.。见表,图。 表?:茶多酚对顺铂损伤后细胞培养液中含量的影响圭三 ?与模型组比较,. ?与正常组比较,. 一/一靛埔鼙链酥 ?帅?伯??蚰如?? 图?:茶多酚对顺铂损伤后.细胞培养液中含量的影响 ?与正常组比较,. ?与模型组比较,..对不同处理损伤模型细胞培养液中含量的影响 .对过氧化氢损伤后细胞培养液的影响 与正常组比较,过氧化氢损伤模型组细胞培养液中明 显增加..与模型组比较、/组明显降低 .。见表一,图?。 表.:茶多酚对过氧化氢损伤后细胞培养液中 含量的影响?。; 与模型组比较,. ?与正常组比较,. / 鼓啼噻鞋『锲 ?????? 。。..。,。,。...。 ??? ?卜???? 舯???? 舯? ?? 伯??蚰??如 一 一 一 正常组 模型组 摸型 模型 攥型 模型 组别 图.:茶多酚对过氧化氢损伤后细胞培养液中含量的影响 ?与正常对照组比较,. 与模型组比较,. . 对顺铂损伤后细胞培养液中含量的影响 与正常组比较,顺铂损伤组细胞培养液中明显 增加。: 与顺铂损伤模型组比较,、/明显 降低.。见表,图。 ?表?:茶多酚对页损伤后细胞培养液中 ?与正常组比较,. 与模型组比较,. ? 四 柚 帅 ? 一/一避珂鬻碰涮 ? 《日 ??自 ?? 女”? &?? 组别 图茶多酚对顺铂损伤后细胞培养液中含量的影响 ?与正常组比较,. 与模型组比较,. .细胞形态学变化 正常组细胞培养小时后,胞体呈锥形或梭形, 细胞之间可见突起相互连接,胞体折光性强,光晕明显,经 染色,可见细胞表面针状甲媵结晶长而密集,未见颗粒样杂质, 见图。 经过氧化氢或顺铂处理后,细胞数量明显减少,胞体缩 小呈椭圆形或圆形,细胞突起明显回缩,折光性下降,经染 色后,可见细胞表面针状甲膦结晶明显缩短稀疏,出现大量破损 细胞碎片和颗粒样杂质,见图、、。 给予不同剂量可见明显改善损伤细胞形态变化,见 图、。论 讨 .体外培养技术从年代起逐渐成为药物筛选、细胞毒性检测和 活性检测中极为重要的手段。利用体外培养细胞的方法研究诸多因素 对细胞的损伤及药物的保护作用,可以将检测药物直接加到培养系统 中,使之直接与效应细胞相接触,准确控制药物作用的对象、作用的 时间和剂量以及细胞的生长条件。从细胞形态和生化改变等多方面直 观观察细胞的变化,避免在体研究时效应细胞针对性不强、体内药物 代谢反应等诸多复杂因素的影响,是一种既经济又简单,方便的方法。 目前该方法已成为药理学领域研究常用的手段之一?。 .细胞人胚。肾细胞比较稳定,无抗原性,易于培养。该 细胞对实验环境要求较低,比较适用于大规模的实验,因此在某些药 理学研究中该细胞系可以作为实验细胞模型。 .过氧化氢对细胞损害,机制为过氧化氢可以释放一:、一等 自由基,引起生物膜中各种脂质过氧化作用来完成,导致细胞膜性结 构破坏以及线粒体功能障碍,生成和储备减少,细胞受损。 .顺铂是治疗实体肿瘤最有效和最常用的药物之一“, 其疗效与用药剂量成正比,但其剂量的增加却受肾毒性的限制。 从细胞生物学机制上来看,与氧化应激有关的氧化性损伤是顺铂引起 肾功能损伤的主要原因,氧化应激是指自由基等强氧化物质所引起的 助氧化能力超过抗氧化能力的一种失平衡状态。在机体内产生氧 。 自由基,启动氧化性损害线粒体,使线粒体空泡化,从而产生肾损害 顺铂致肾损伤还涉及脂质过氧化,巯基耗竭及细胞内钙稳态失调等机 理 。顺铂进入机体后可生成大量羟自由基和活性氧自由基,它们与生 物膜上不饱和脂肪酸反应,引起膜脂质过氧化,导致膜通透性和膜脂质 流动性的改变,同时产生多种有毒的降解产物。脂质过氧化主要产物丙 二醛既是其结果,又是继发损害的毒性产物,其含量交化可反映体内自 由基代谢的异常及脂质过氧化速率。 .是糖无氧酵解和糖异生的重要酶系之?,存在于人体各组织 器官中,是机体能量代谢中的一种重要酶,质与量的改变,直接影响到机体的 能量代谢,当机体各组织器官病变时,其组织器官本身 的要发生改变,并且可引起血液中改变。人体内肾脏含量 最高,心肌、骨骼肌、肝和红细胞依次减少““。当肾脏缺血、缺氧或 肾毒素作用卜,均可通过损伤的细膜入血而引起血清总活性的变 化。在肾小管坏死小时内可出现廓活性升高“?,?天可达高 峰,并保持较高水平达周之久。慢性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、 糖尿病肾硬变、膀胱及‘肾脏恶性肿瘤病人尿中活力升高达正常人 的倍。育实验证明在肾脏受损的诊断中是一种非常有价值的酶 学检查。增高还见于急性心肌梗塞、病毒性肝炎、肝硬化、肺梗 塞、某些恶性肿瘤、骨骼肌病、有核红细胞骨髓内破坏、白血病尤其 是急性淋巴细胞型白血病、恶性贫血。 .肾皮质部分含最丰富。在发生肾损伤后小时开始升 高,可保持?天。较其他同工酶对一酮丁酸有更大的亲和力, 因此常用来测量血清中.同工酶,的活性。有实验证明损 伤时和有高度正相关系.,在特异性上比总 活性变化高,对临床肾功能状态有重要意义,而且可以做为缺 氧严重程度和估计预后的客观指标“。 .比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法,其显色原理是 活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的显色剂四甲基偶氮唑盐 还原成为蓝紫色的结晶甲躜,甲躜的产量与活细胞数成正相关。 甲躜可用溶解,在酶标仪上以波长进行比色分析,从而 计算出细胞存活率。 本实验结果显示: .低浓度、、、/有利于细胞生长 .,但高浓度/可降低细胞存活率。此结果 与已有研究相似,有认为这有可能与较高浓度的在某些金属离子存 在下有助于氧化作用,产生自由基有关“附 . 过氧化氢使细胞存活率有明显降低.,使 细胞和明显升高.,细胞形态发生明显改变, 不同剂量、/可改善这种变化.,这与过氧化氢易产生大量氧自由基对细胞线 粒体造成损害有关,因具有清除氧 自由基的作用、抗氧化、抗脂质化作用,稳定细胞线粒体,使受损伤 的细胞破碎减轻,释放的和降低“?。 .顺铂使细胞存活率明显降低.,增加 细胞和释放.,与既往文献报道顺铂具有‘肾毒性观 点一致,不同剂量、/可改善这种变化., 这与清除氧自由基、抗氧化、抗脂质化作用有关。 本研究从细胞水平证实了茶多酚对人胚肾细胞损伤具有保护作 用,为探讨茶多酚药物的应用临床器官保护提供了实验依据。结 论 .过氧化氢和顺铂对细胞的损伤可引起细胞存活率降 低,和升高以及细胞形态学的改变,与国内外文献报道~ 致。 .对过氧化氢和顺铂所致细胞的损伤有保护作用,提 高细胞存活率,改善细胞形态学变化。 .对细胞存活率有影响,较低剂量、/ 可促进细胞生长,而较高剂量,则可降低细胞存活率;较低 剂量有保护作用,大剂量具有细胞毒性作用。参考方献 方允中,郑荣梁。自由基生物学的理论与应用】。北京:科学出版社,, ~,~,~。 孙备,姜洪池,赵金鹏.月?参对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用?.中华实 验 外科杂志.,:~ 许平丹参在心脏保存中应用的研究【.广东医学.,:~ 周洪澜,那万里,王伟华.人参提取液在离体’肾脏低温灌注损伤的影响】. 白求恩 医科大学学报.,:~ 高永贵,杨贤强,周树红.试论茶多酚清除生物自由基的高效性】.天然产物研 究 与开发., :~ 杨贤强,沈生荣,贾之慎等,茶多酚清除自由基和抗氧化作用的机理及应用 基础研究】中国茶叶加工,,: 何皎.茶多酚的药理学研究概况】擞理医药学杂志,,:. 朱旗,施兆鹏,袁伟健。茶在防治胃癌中的作用【】.茶叶通讯,,:.】, , .,, ,., .:~. 薛庆善等,体外培养的原理与技术,北京科学出版社. ,., .,, ...,:?. 卢永科,川岛明,崛井郁夫等,谷胱甘肽对顺铂致大鼠肾毒性中和作用的实 验研究,沈阳医学院学报,,:. 刘桂香,李清钊,姚林等,硫代硫酸对顺铂所致肾毒性中和作用的实验研究, 中国职业医学,:. 黄广优,藤炳祥,潘辉林等,大剂量维生素减轻顺铂肾毒性的临床观察, 右江民族医学院学报,,:.。 .王淑娟主编,实验诊断学,北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社出 版,... . ,,:? .., , .,,:, .张国营,孙玉萍等,茶多酚对人胚肺细胞和猴肾细胞毒性的实验研究安徽农 业大学学报,,:. .周凌,麦根荣,李祥民茶多酚对急性肾毒性保护作用的实验研究【.幅床儿科 杂 志.,:~综述 中药对器官的保护的作用 审校 杨杨综述 李卫平 器官的采取和保存是器官移植的一个重要方面。所采取和保存的 器官优劣不仅直接影响移植近期效果的好坏,而且还影响病人有无长 期存活的机会。 从同种移植免疫学机理来看,一个质量不好的器官被移植后,不 仅仅在移植当时被移植的器官功能低下或无功能,从而使移植初期处 理病人复杂化,而且它还影响整个移植后的全过程。这是因为采取的 器官如受严重缺血因素的影响,则使器官的一部分细胞死亡或发生不 可逆的功能性损伤。这些受损伤或死亡的细胞,在移植后释出大量的 抗原性物质,从而引发受者发生加速排斥反应。这类排斥反应又易启 动体液性排斥而导致移植物的死亡,甚至病人的死亡。 理想的器官保存是将器官在体外保存时间尽量延长,器官细胞损 伤尽量越小,移植后器官功能恢复越快越好,免疫排斥发生越少,尽 量形成免疫耐受,目前器官保存研究的进展正向这个方向发展。 移植器官保存需从以下几个方面做系统的处理: 表面冷却处理:长期以来,从.年就认识到,冷却可使肾 组织的新陈代谢持续下降,到?时,其代谢达到轻微水平。作为表面 冷却,保存肾的方法最早由和在年提出的, 他们就证实对肾缺血导致代谢和组织损伤后,经过冷却,则使肾的损 伤得以改善,单纯表面冷却可使肾功能保存小时仍良好。年有 人提出单纯冷保存超过小时就出现超微结构和功能障碍。一般认为 冷却而又不使肾解冰,可使肾的新陈代谢降至最低水平。但是, 年等发现迅速冷却可使糖酵解酶的活性丧失,故可用逐步 冷却法,以防止发生此作用【。目前这种技术对器官保存只是最基本的 处理,对器官的缺血的代谢损伤只是辅助方法,器官的保存还需灌注液,结合 冷却技术用冷灌注液,灌注的目的是迅速逐步冷却,以减少 代谢损伤和去除血液及其凝结因子与同种凝集素,过去多采用细胞外 液成分。等于年用细胞外液以低流量持续灌注肾可使 肾功能迅速衰退,而在用细胞内液成分的灌注液时,则不发生肾功能 衰退。于是,用细胞内电解质成分的溶液灌注肾时,效果优子常用的 细胞外液。此后,许多人报告了在保存兔、猪、犬和人肾时,用细胞 内液成分灌注肾不但可保持其结构良好,而且在保存小时的时候, 仍有良好的功能。低温保存可使肾细胞遭受缺血性缺氧和寒冷两种持 续性作用。由于寒冷或低温可使肾细胞的代谢率显著降低,这在很大 程度上可以减轻缺血性缺氧给肾细胞造成的危害作用。但是,无论如 何,即使在。时,肾细胞的代谢活性也不能完全消失。这就决定了这 种方法对离体肾所能保存的时间有一个最终限度。在细胞产生的能量 中,有相当部分是用于支持细胞膜的主动运转机制,其中主要是钠离 子的排出过程。细胞呼吸水平在一定程度上反映被排到细胞外的钠离 子浓度。在正常情况下,钠离子排出启动氏平衡注:膜平衡, 它使细胞膜两侧的离子处于平衡状态,从而维持细胞膜的稳定性,并 保证了细胞的正常功能】。离体器官对冷的耐受性,部分地依赖于钠泵 对低温抑制的耐受性。 模拟细胞内液成分的灌注液的作用方式可能有:?限制通过细胞 膜的离子交换;?预防细胞肿胀:?能量基质的保存。】等强 调在低温保存器官组织的过程中,预防细胞肿胀的重要性。他们认为 在器官血流恢复时,灌注液中冷却的离子易损失,而在移植器官复温 时,离子损失应被逆转:而且单纯低温即可通过钠离子主动转移消失 而有效地保持细胞能量。但是,其他的报告指出甚至在?时,也 有低水平的钠离子主动转移。另一方面,由于细胞肿胀可引起细胞内 细胞器微器官的功能紊乱,所以这种情况一旦发生就很难完全逆转。 预防细胞肿胀和维持离子交换平衡对冷缺血器官的保护作用是极为重 要的。现在几乎所有器官移植学家都认为这些变化的根本问题是严重 影响移植器官的细胞内能量代谢。此外,受影响的新陈代谢还包括糖 原与葡萄糖的分解过程、磷酸肌酸的生成和腺嘌呤核甙酸代谢水平的持续性 降低。这些代谢紊乱又进一步加重细胞内外的离子交换失去平 衡,细胞肿胀,甚至产生酸中毒。最后,溶酶体被破坏使溶酶体酶释 出,从而导致严重后果。 随着器官移植工作的逐步开展,器官的保存技术越发受到重视, 因为它直接影响着器官移植后的成活率。器官保存中缺血和再灌注损 伤是导致保存器官组织损伤的重要原因,但其机理十分复杂,现在尚 未完全清楚,普遍认为的是氧自由基毒性学说和钙离子超负荷学说, 两者相互关联。其共同结果是导致细胞膜性结构破坏以及线粒体功能 障碍,生成和储备减少,从而不能修复受损的组织细胞。近年来从 中药中筛选高效低毒的药物加入器官保存液中,通过调节血管张力、 血压、器官血流量,改善血小板功能,改善微循环,减少器官缺血再 灌注损伤,国内外做了不少的研究。包括以下几种药物: .丹参;丹参具有抑制血小板黏附、聚集和释放,扩张血管和改 善微循环之功效。丹参中含有丹参酮及其衍生物、丹参素、丹参酚等 多种成分。药理实验证实丹参酮、丹参酮、双氢丹参酮等能抑制 胶原诱导的血小板聚集,显著抑制血小板的释放,丹参的酚类成 分如丹酚酸、丹酚酸等能有效地清除超氧阴离子,抑制缺血脏器 微粒体的脂质过氧化,而氧自由基引起组织损伤主要是通过生物膜中 各种脂质过氧化作用来完成,因此丹参中的酚类成分对氧自由基引起 的移植器官缺血再灌注损伤有保护作用。丹参酮 磺酸钠是一种钙离 子拮抗剂,钙离予引起细胞损伤的主要机制为细胞内钙超载,激活磷 脂酶,直接或间接影响质膜通透性,并导致线粒体的功能损伤。钙离 子拮抗剂能减少钙离子进入细胞内,避免了细胞内钙超载对移植脏器 的损伤。动物实验已证实丹参在肝脏的保存中具有抗氧自由基的作 用,可减轻鼠肝细胞损伤程度,并能改善肝脏微循环【。动物实验也证 实丹参使低温保存的供心恢复良好的收缩、舒张功能;增加冠脉 流量,减轻心肌组织水肿,减少心肌细胞酶的释放,表明丹参对供心 缺血再灌注损伤具有保护作用【】。在保存液中加入丹参低温保存 狗肾脏,电镜超微结构变化显示丹参可以防止肾上皮细胞变性和坏死, 说明丹参有较好的抗缺血性肾损伤的作用盯。.川芎;川芎嗪是川芎的有效成 分之一,化学结构为四甲基毗嗪 ,药理研究证明,其盐酸盐和碳酸盐均具有抗血小板聚集作用, 并对已聚集的血小板有解聚作用,尚能扩张小动脉改善微循环和脑血 流,产生抗血栓形式和溶血栓的作用。已有实验证明川芎嗪具有改善 血液流交性的作用,能增进微循环,提高组织缺血缺氧的耐受力【,进一 步的研究表明川芎嗪能调节类前列腺素代谢,其作用类似于血栓素: 合成酶抑制剂,主要影响血栓素:合成,而对其他花生四烯酸代谢产 物无明显影响。川芎嗪还具有钙拮抗效应,能抑制离体细胞对钙离子 的摄入,避免了细胞内钙超载引起的细胞损伤【。实验证明』芎嗪能提 高保存后心脏的心功能和冠脉流量,降低心肌含水量,减少心肌细胞 乳酸脱氢酶和心肌激酶的漏出,提高心肌细胞超氧化物歧化酶活性并 降低过氧化脂质的含量,说明川芎嗪能提高液的心脏保存效果, 作用机理可能与负性肌力及抗氧自由基损伤作用有关四。同时在胰腺 器官保存动物实验证明川芎嗪可延长胰腺保存时间,机理可能与它抑 制血栓素合成有关?。 .人参皂甙,人参皂甙在心肌缺血再灌注损伤的实验中已被证实 既有抗氧化损伤作用,又有钙通道阻滞作用。动物实验在肾保存 液添加人参提取液对离体犬肾进行低温灌注保存,通过光镜、电镜观 察肾组织结构变化,检测移植前后生化指标,并与液灌注组相对 照,结果表观添加入参提取液组保存的犬肾组织超微结构损伤和盘肌 。。 酐值提示人参提取液对缺血再灌注的肾脏有保护作用【 .另外有研究证实黄芪四、菟丝子‘及防己【均具有减轻器官缺 血再灌注损伤作用。与它们抗自由基损伤及抗脂过氧化作用,对缺血 再灌注有保护作用有关。 近几年人们在对茶多酚研究中,发现茶多酚 , 是茶叶药效的主要活性成分,占茶叶干质量的%~%,其主要组 分为儿茶素,占其总量的%左右。茶叶中儿茶素主要为 表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、 表没食子儿茶索没食子酸酯等,其中含量最高,占几茶 素的%左右。儿茶素结构中至少有、、三个环核,是.苯基 ?‘高效清除自 苯并吡喃的衍生物。它具有以下个方面生物活性, 由基儿茶素类含有多个游离酚羟基,能提供氢质子与体内自由基结 合,达到清除自由基的目的,并且在与自由基反应的过程中,分子内 能形成氢健,生成稳定的自由基中间体,抑制原来的自由基链锁反应。 对:一、一等氧自由基有清除作用,同时对多元不饱和脂肪酸 ‘。 自由基、单线态氧、烷基过氧化物自由基等也都有清除效能【 与其他抗氧化剂相比,具有较高的效能。与自由基清除剂超氧化物 、 【相比,具有较高的效能。 歧化酶和强抗氧化剂 抗氧化特性的抗氧化特性是一种综合效应,可通过几种途 径:?清除或抑制自由基;?与金属离子螯合,减少其对氧化反应的 催化;?与其他抗氧化剂产生协同效应【踟。 近年来大量实验研究证实,具有消除自由基、抗氧化等生物活 性,具有在抑菌、抗病毒、防癌抗癌、抑制肿瘤药理作用。诸多研究 也表明,茶多酚是高效自由基清除剂,也是很好的免疫调节剂,还 有益气化瘀、解毒泄浊、抗凝和改善血液流变学等功效”,因此茶多 酚已应用于抑制肾病的诱发、进展和改善肾病症状,证实了茶多酚对 肾病有如下作用: .茶多酚对肾脏滤过功能的作用表现为,茶多酚对正常肾脏在负 荷条件下滤过功能的影响,茶多酚呈剂量效应地增加尿量,且茶多酚 的利尿作用强于氢氯噻嗪,作用时间也较后者持久,表明茶多酚是高 效持久的和尿剂。 .茶多酚可明显改善和?肾炎的肾脏病理变化【。 茶多酚有效抑制肾小球囊壁层细胞增生、肾小球毛细管内皮细胞肿胀 和血管腔扩张充血,减轻近曲小管上皮和肾小球细胞肿胀及细胞增生: 防止远曲小管及集合管上皮细胞变性和间质纤维组织增生,减少炎性 细胞浸润。茶多酚对肾病病理的改善作用效果强于地塞米松.同时茶 多酚对内源和外源抗原性肾炎也具有较好的治疗效果。 .糖尿病肾病是糖尿病长期代谢异常引起肾小球损伤的一种 疾病,是糖尿病的严重并发症,也是影响糖尿病预后最重要的因素之 一,茶多酚可使患者尿蛋白减轻或消失,从而使肾功能得到一定 ?‘改善.茶多酚降低蛋白尿的机制与增加和降低滤过分数有关瞄?。 .茶多酚抑制慢性肾功能不全的脂质过氧化,并改善慢性肾功能 不全的症状【。。 .环胞素是一种强效的免疫抑制剂,每床上主要用于器 官移植及免疫性疾病的治疗,但其严重的肾毒性阻止了临床应用。研 究表明,茶多酚对引起的急性肾毒性有明显的治疗作用弘引.光 镜显示,引起肾的近曲小管出现弥漫性坏死、上皮细胞的内质 网扩张、线粒体肿胀变圆、嵴模糊,细胞核旁可见数个形态不规则、 大小不等的溶酶体,而茶多酚处理后仅局部出现近曲小管上皮弥漫, 绝大多数部位正常。 肾脏做为一个移植器官,在器官保存中需经过缺雪和再灌注损伤, 肾脏却是机体内最易产生活性氧的器官,炎症反应、缺血一再灌注、 糖尿病等均可诱导肾脏产生丰富的活性氧,引发肾脏病变,一旦肾病 发生,凝血与纤溶的正常平衡被打乱,导致血管内纤维蛋白沉积和血 栓形成,从而促进病情发展,肾功能急剧减退,最终导致肾病恶化。 茶多酚通过抑制细胞增生而预防肾功能损伤:另一方面,茶多酚能通 过高效抗氧化作用而预防脂质过氧化产物和活性氧对肾脏损伤引发的 肾病:此外茶多酚还通过直接调节。肾脏的滤过速率而保护肾脏功能.总 之,茶多酚可通过多种途径保护肾脏功能,其中抗氧化作用是关键.目 前人们正在研究将茶多酚应用于器官的保护方面,尤其肾脏的缺血缺 氧的保护,希望取得很好的疗效,人们在拭目以待。参考文献 : :, , : :, . :, , : . 胡旺平,李雪梅,化长林。丹参对应急鼠血液流变性的影响中国微循 环..:~ . 孙备,姜洪池,赵金鹏碉?参对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用【.中华实验外 科杂志,,:~ . 许平.丹参在心脏保存中应用的研究【】.广东医学.,:~ . 陈天垒,赵幼眉,陈正斌.丹参对狗肾脏低温保存时组织及超微结构的影响?福 建医学杂志。,:~ . 李星.川芎嗪注射液对肺心病血液流变性的影响中国微循 环.,:~ . 孙经建,吴盂超,陈汉.川芎嗪对缺血再灌注肝钙含量和线粒体功能的影响【懈 放军医学杂志.,:~ .储利胜,施雪筠,席时芳.川芎嗪提高心脏保存效果的实验研究”.中药新药与临 床药理.,:~ 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