.卵黄囊抗体制备及其应用研究进展

.卵黄囊抗体制备及其应用研究进展 二手制冷设备 【关键词】 卵黄囊抗体 卵黄囊抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin，IgY)是抗原免疫禽类后由卵黄中分离得到的特异性抗体。与哺乳动物来源的IgG比较，卵黄囊抗体具有取材方便、分离纯化方法简单、产量高，同时具有特异性高、稳定性较好等优点，在疾病诊断、防治等诸多方面得到了广泛的应用，一直是生命科学相关科研领域的研究热点。本文就卵黄囊抗体的分离纯化方法及其应用研究进展作一综述。 1 卵黄囊抗体的基本结构及其性质 与哺乳动物血清免疫球蛋白相似，卵黄囊抗体的基本结构包括2条轻链和2条重链，分子量约为180kD。卵黄囊抗体的疏水性大于IgG。Lee和Kim等〔1,2〕研究明，卵黄囊抗体具有良好的稳定性，对pH及酶等作用引起的失活效应有较强的抵抗力。 2 卵黄囊抗体的制备 21 实验动物的免疫 Schwarzkopf等〔3〕研究结果表明:经皮下注射的方法比肌肉注射能产生更高滴度的抗体，免疫间隔时间对抗体的产生影响较大。通常，初次免疫与第一次加强免疫之间的时间间隔至少4周。另有研究分别于第0d，10周及15周免疫产蛋鸡，获得了高达1?160000的抗体滴度。 22 卵黄囊抗体的分离 从卵黄液中分离卵黄囊抗体的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分(Water Soluble Fraction，WSF)。根据纯度要求、技术工艺以及对环境的影响等因素，可以选择不同的分离方法。常见分离方法包括以下几种。 221 水稀释法 先将卵黄液用蒸馏水稀释10倍，调整pH值至50,52，4?静置6h以上，上清液即为水溶性组分。水稀释法工艺简单，若采用适当的方法进行纯化，可获得较高的回收率和纯度。 222 有机物沉淀法 聚乙二醇(PEG)法是较常用的方法。Bizanov和Normantiene〔4〕用仙台病毒免疫产蛋母鸡，收获高免鸡蛋。以TBS作为缓冲液，将卵黄液稀释4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂类，卵黄囊抗体保留在上清液中。应用这种方法从每毫升卵黄液中获得约45mg的特异性卵黄囊抗体，纯度达95%。 二手制冷设备 223 有机溶剂抽提法 脂类易溶于有机溶剂，可采用氯仿、丙酮等有机溶剂进行分离。用经TBS冲洗过的鸡蛋黄制成15ml蛋黄液，加入40ml TBS充分混匀后加入40ml氯仿，冷冻离心，分三相。弃去氯仿层，保留水层，中间的半固体相用40ml TBS萃取，取水层，与前一步水层合并即为水溶性组分。 一些天然胶如卡拉胶和黄原胶等可用于卵黄抗体分离。将9倍体积的 224 天然胶法 01%(w/v)卡拉胶溶液与卵黄混合，离心得到水溶性组分。也可将卵黄先用双蒸水稀释1倍后再与4倍体积的黄原胶混匀，离心即得水溶性组分。使用天然胶法去除脂类效果较好，获得的水溶液中脂类含量少于04%。 225 中链脂肪酸法 辛酸是用于卵黄囊抗体分离最常用的中链脂肪酸。蛋黄用去离子水稀释75倍，混匀，离心，上清液再用醋酸盐缓冲液稀释2倍，调pH值至50，加辛酸至终浓度为1%，静置分层，卵黄囊抗体在水层中。 226 去污剂分离法 Sriram等〔5〕比较了几种去污剂包括阴离子、阳离子和非离子型去污剂，发现用溴化十六烷基三甲铵进行分离，脂类的残留量不足3%，而用十二烷基磺酸钠分离残留量最高，为14%,35%。用非离子型去污剂辛苯聚醇8(TRITON.RTM.X114)分离时，蛋 95%。Stalberg等〔6〕利用TX100进行分离，蛋白回收率可达97%。 白回收率可达85%, 227 超临界气体提取法 该法的基本原理是在高压下二氧化碳液化，将卵黄中的脂溶性物质溶解在其中，并随气流带走。将卵黄粉末装入超临界气体抽提装置，通入300kg/cm2，40?二氧化碳超临界气体与卵黄粉末混合，在60kg/cm2，40?的减压条件下，被抽提出的杂质与超临界气体分开而进入分离室，即可得到去除脂类的卵黄粉末。将去脂的卵黄粉末溶于20倍磷酸盐缓冲液中，搅拌，离心，即可得水溶性组分。 23 卵黄囊抗体的提取方法 提取的目的是将大量卵黄囊抗体从水溶液中分离出来，得到卵黄抗体。目前主要通过超滤法或沉淀法来实现。沉淀法所用的沉淀剂包括无机物、有机物或有机溶剂，也可以采用多种方法联合沉淀，或者沉淀法和超滤法相结合的方法提取卵黄囊抗体。 231 超滤法 超滤法具有浓缩、除盐、分级和纯化作用。卵黄囊抗体的分子量约为180kD，在提取时可采用截流值为100kD的超滤膜。研究表明，在水稀释法分离后经硫酸钠沉淀，超滤，回收率为98mg卵黄囊抗体/ml蛋黄，纯度94%。超滤法具有所需设备较简单、操作方法简便等优点，适合大规模工业化提取卵黄囊抗体。 232 无机物沉淀法 向含有卵黄囊抗体的水溶液中加入无机盐或无机盐过饱和溶液，使卵黄囊抗体在高盐条件下盐析。常用的无机盐有硫酸钠和硫酸铵。Kritratanasak等〔7〕利 二手制冷设备 用硫酸铵盐析法成功获得较高纯度的抗鼠IgG卵黄抗体(IgYantimouse IgG)，每个鸡蛋可收获约40mg卵黄囊抗体。采用无机盐沉淀后所得固体，一般需经半透膜透析以除去残留的盐分。Ko和Ahn〔8〕比较了硫酸铵沉淀法及离子交换法，结果发现，前者所制备的卵黄囊抗体纯度高于后者，而且适合于大量样品的制备。 233 有机物及有机溶剂沉淀法 Polson最初的PEG法采用终浓度为35%的PEG 6000对卵黄进行分离获得水溶性组分，用12%PEG进行沉淀，沉淀物经磷酸盐缓冲液溶解后再用12%PEG沉淀，得到卵黄囊抗体。之后，Polson〔9〕对此方法加以改进，先后经12%PEG和-20?的50%乙醇两步沉淀法获得卵黄囊抗体，蛋黄回收率49mg/ml，纯度89%。卵黄囊抗体的提取一般采用联合沉淀法，即利用不同的沉淀剂对水溶性组分经过2次或多次沉淀，从而获得纯度较高的卵黄囊抗体。 24 卵黄囊抗体的纯化方法 为了满足不同的使用目的，许多情况下需对提取的卵黄囊抗体进一步纯化，除去其中的杂蛋白、盐或其他杂质，获得高纯度的卵黄囊抗体。目前主要采用层析方法纯化卵黄囊抗体，包括凝胶过滤层析、离子交换层析以及亲和层析等。 241 凝胶过滤层析 主要利用具有网状结构的凝胶分子筛作用，可根据被分离物的分子大小不同选择不同的凝胶介质进行层析。卵黄囊抗体纯化时，常用交联葡聚糖作为凝胶层析介质。研究人员对PEG法分离获得的卵黄抗体采用疏水层析(HIC)和凝胶过滤(GF)两步法纯化，产物纯度较高。1ml含58mg卵黄抗体的稀释液，经过PEG分离、HIC和GF处理后，卵黄抗体含量依次为35，47和12mg。 242 离子交换层析 纯化卵黄囊抗体时多采用以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体，磷酸盐缓冲液作为吸附洗脱体系进行分离纯化。用DEAESephacel柱层析可获得纯度为98%卵黄囊抗体，每个鸡蛋黄可收获70,100mg卵黄囊抗体。 243 亲和层析 纯化卵黄囊抗体采用的亲和层析方法包括亲硫层析、固相金属离子亲和层析、合成配体亲和层析以及免疫亲和层析等。 244 方法应用比较 综上所述，经过分离和提取方法通常就可以得到纯度较高的卵黄抗体。衡量一个制备方法的优劣要考虑分离、提取和纯化的全过程，从工艺路线、工艺条件以及回收率和纯度等方面综合评价。从工艺路线上看，水稀释法(WD法)、卡拉胶法(CAR法)、超临界气体提取法(SFE法)和硫酸铵法(AMS法)工艺路线较短，而其他方法需两步或更多步骤获得沉淀;工艺条件方面，AMS法需-20?冷冻,SFE法需要超临界气体抽提设备，对设备要求较高;从原成本看，CAR法采用的是天然胶，成本较高;从回收率和纯度方面看，WD法和SFE法的产品纯度和回收率都较高。综合上述因素，认为WD法和SFE法具有工艺简便、生产成本较低、产品纯度和回收率高等优点，适合于大规模工业化生产。