蛹虫草液体的深层发酵

第 37 卷第 6 期 2006 年 12 月 　 　　　　　　　 中南大学学报 (自然科学版) J. CENT. SOUTH UNIV. ( SCIENCE AND TECHNOLOGY) 　　 　　　　　　　 Vol. 37 　No1 6 Dec. 　2006 蛹虫草液体的深层发酵 周洪波 , 肖升木 , 阮承超 , 邱冠周 (中南大学 资源加工与生物工程学院 , 湖南 长沙 , 410083) 摘要 :以菌丝体质量浓度 (干重)和发酵液中甘露醇浓度为指标 , 研究温度、初始 p H 值、培养时间等因素对蛹虫草 液体培养的影响 , 得到蛹虫草摇瓶液体培养的最佳温度为 25. 0 ℃, 初始 p H 值为 6. 10 , 培养时间为 5 d ; 蛹虫草液 体发酵最适培养基的组成为 : 20 g/ L 蔗糖 + 5 g/ L 蛋白胨 + 1 g/ L MgSO4 ·7 H2 O。在此基础上进行小型分批式发 酵罐实验 , 研究有利于蛹虫草生长及活性物质生成的 p H 控制策略。研究结果表明 , p H 分段控制的液体深层发酵 对蛹虫草生长最为有利 , 菌丝体质量浓度为 17. 31 g/ L , 甘露醇质量浓度达 43. 47 g/ L 。 关键词 :蛹虫草 ; 液体发酵 ; 甘露醇 ; 菌丝体 中图分类号 :Q939. 5 文献标识码 :A 文章编号 :167227207 (2006) 0621098205 Submerged fermentation of Cor dyce ps milit a ris ZHOU Hong2bo , XIAO Sheng2mu , RUAN Cheng2chao , Q IU Guan2zhou (School of Minerals Processing and Bioengineering , Central South University , Changsha 410083 , China) Abstract : The influences of cult ure conditions such as temperat ure , initial p H value and cultiva2 tion time on biomass and t he p roduction of mannitol of Cord yceps mi l i t aris were investigated. The optimal conditions were obtained as follows : 25. 0 ℃, p H 6. 10 and cultivation time of 5 d. The optimum medium in submerged fermentation for Cordyceps militaris was also investigated. The optional medium composition is as follows : 20 g/ L sucrose + 5 g/ L peptone + 1 g/ L MgSO4 ·7 H2 O. In addition , t he batch fermentation in a 12 L fermentation tank was used to st udy t he effect of p H value. The result s show t hat a two2stage p H cont rol st rategy is best for biomass and mannitol p roduction in t he batch fermentation of Cord yceps mi l i t aris . The concent rations of biomass and mannitol in the solution reach 17. 31 g/ L and 43. 47 g/ L , respectively. Key words : Cord yce ps mil i t aris ; submerged fermentation ; mannitol ; biomass 　　蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草 , 属于子囊菌 亚门 ( A scom ycoti na) , 麦角菌科 ( Cl avici pi t aceae) , 虫草属 ( Cord yceps) 的模式种 , 学名为 Cord yceps mi l i t aris。蛹虫草在世界性分布天然资源数量很 少[1 ] 。蛹虫草含有 30 多种元素 , 主要活性物质包括 虫草素及甘露醇等 , 其含量与冬虫夏草含量类似。 大量研究结果表明 : 蛹虫草与冬虫夏草类似 , 具有 多种功能 , 对人体具有明显的保护作用 , 可以作为 冬虫夏草的替代品[ 229 ] 。 目前 , 蛹虫草生产仍以固体栽培为主 , 液体深 层发酵研究的时间不长 , 许多培养条件如培养周期 等的研究还不成熟[7 ] , 但是 , 液体发酵具有许多如 培养周期短、活性物质易于提取的优点 , 很多药用 真菌液体发酵的活性物含量远高于人工栽培的药用 收稿日期 :2006204207 基金项目 :国家自然基金创新研究群体科学基金资助项目 (50321402) ; 湖南省青年骨干教师基金资助项目 (2001 年) 作者简介 :周洪波 (1969 - ) , 男 , 湖南湘潭人 , 博士 , 副教授 , 从事微生物工程研究 通讯作者 :周洪波 , 男 , 博士 ; 电话 : 073128877216 (O) ; E2mail : zhouhb @mail . csu. edu. cn 真菌的活性物含量 , 所提取的活性物含量约为人工 栽培活性物含量的 10 倍多[10 ] 。为此 , 本文作者研 究蛹虫草的液体深层发酵条件。在单因素优化实验 的基础上 , 进行小型分批式发酵罐实验 , 研究有利 于蛹虫草生长及活性物质 (甘露醇) 生产的 p H 控制 策略。 1 　与 1. 1 　菌种 蛹虫草 ( Cord yceps mi l i t aris ) 菌种由中南大学 生物冶金教育部重点实验室提供。 1. 2 　培养基 固体斜面 PDA 培养基组成为 200 g/ L 马铃薯 (去 皮) + 20 g/ L 葡萄糖 + 15 g/ L 琼脂 , p H 值不控制。 液体种子培养基组成为[11 ] : 20 g/ L 蔗糖 + 20 g/ L蛋白胨 + 0. 5 g/ L MgSO4 ·7 H2 O , 1 g/ L KH2 PO4 , p H 值不控制。 发酵培养基组成为 : 20 g/ L 蔗糖 + 10 g/ L 蛋白 胨 + 0. 5 g/ L MgSO4 ·7 H2 O + 1 g/ L KH2 PO4 , p H 值根据不同实验要求进行调节。 1. 3 　实验方法 1. 3. 1 　培养条件及方法 摇瓶培养基本条件 : 摇床转速为 140 r/ min , 温 度为 25 ℃, 培养时间为 5 d。 发酵罐培养基本条件 : 在容积为 10L 的微生物 发酵罐中装入 6 L 液体培养基 , 液体接种量为 5 % (体积分数) , 摇床转速为 150 r/ min , 通气量为 250 ～300 L/ h , 温度为 25 ℃, 培养时间为 5 d。每隔 8 h 取样 1 次 , 每次取样 100 mL , 测定菌丝体质量浓 度和上层清液中甘露醇的质量浓度。 1. 3. 2 　p H 控制 采用自动流加 2mol/ L HCl 或 4mol/ L NaO H 控制 p H 值。 1. 3. 3 　菌丝体质量浓度的测定 取一定量的发酵液分装在离心管中 , 在转速为 4 000 r/ min 条件下 , 离心 20～25 min。倾去上层清 液 , 用蒸馏水洗涤 1 次后 , 将沉淀置于70 ℃烘箱中 烘至恒重再称量。 1. 3. 4 　甘露醇浓度的测定 这里考察的活性产物为甘露醇。分别取稀释至 一定浓度的样品 1 mL 及空白液 1 mL , 置于不同的 比色管中 , 用比色法[12 ] 测定样品的吸光度 , 并计算 样品中甘露醇的质量浓度。 2 　结　果 2. 1 　摇瓶实验 2. 1. 1 　最适宜温度的确定 分别选择 20 , 22 , 25 , 27 和 30 ℃5 种不同的 温度进行 3 组平行实验。在 500 mL 摇瓶中装入培 养基 100 mL , 接种量为 5 % , 摇床转速为 140 r/ min , 培养 4 d , 观察蛹虫草的生长情况。4 d 后 , 测量菌丝体质量浓度 , 结果如图 1 所示。 图 1 　温度对蛹虫草生长的影响 Fig. 1 　Influence of temperature on growth of Cord yceps mi l i t aris 徐桂香等[13214 ] : 蛹虫草在温度为 15～30 ℃时 都能生长 , 但温度明显影响蛹虫草的生长速度 , 且 在 28 ℃其生长速度最快。本实验结果表明 : 蛹虫草 在 20～30 ℃时都能生长 , 且在 25 ℃左右时其生长 情况最好 , 所得菌丝体质量浓度最高 (19. 15 g/ L ) 。 因此 , 选择 25 ℃对蛹虫草进行培养。 2. 1. 2 　初始 p H 值对蛹虫草生长的影响 将培养基的初始 p H 值分别调至 4. 10 , 4. 90 , 5. 30 , 5. 70 , 6. 10 , 6. 40 和 6. 80 , 进行 3 组平行实 验。培养 4 d 后测定菌丝体质量浓度 , 结果如图 2 所 示。 刘丽丽等[15 ] 的研究结果表明 : 菌体生长速度随 着初始 p H 值的升高而加快 , 在发酵起始 p H 值为中 性时生长最好。但本实验结果表明 , 当液体培养基的 初始 p H 值为 6. 10 时 , 菌丝体质量浓度最高 (10. 63 g/ L) ; 当 p H 值为中性时 , 不利于菌丝体生长。 2. 1. 3 　培养时间的确定 在培养时间分别为 1 , 2 , 3 , 4 , 5 和 6 d , 培养 温度为 25 ℃, p H = 6. 10 时进行 3 组平行实验 , 测 ·9901·第 6 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　周洪波 , 等 : 蛹虫草液体的深层发酵 定蛹虫草发酵液的菌丝体质量浓度 , 结果如图 3 所 示。可见 , 在前 5 d 的培养过程中 , 菌丝体质量浓度 逐渐增加 , 尤其是第 2～3 d 菌丝体质量浓度呈直线 上升。随后菌丝体质量浓度增长减慢 , 基本处于稳 定期 , 生长第 5 d 即培养时间为 120 h 达到最大 (17. 13 g/ L) 。继续培养 , 产生菌丝体自溶现象 , 且 菌丝体质量浓度开始下降 , 开始进入衰退期。 图 2 　初始 p H 对蛹虫草生长的影响 Fig. 2 　Influence of initial p H on growt h of Cord yceps mi l i t aris 图 3 　培养时间对蛹虫草生长的影响 Fig. 3 　Influence of cultivation time on growt h of Cord yceps mi l i taris 2. 1. 4 　不同营养配方对蛹虫草生长的影响 通过不同碳源、氮源及无机离子配方 , 确定蛹 虫草的最适宜发酵培养基。 按表 1 配方配制 9 种培养基 , 250 mL 摇瓶装液 量 50 mL , 调节初始 p H 至 6. 10 , 25 ℃培养 5 d , 测 定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的浓度。 以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为指 标进行极差分析和方差分析[ 15 ] 。 由分析结果可知 , 碳源、氮源及无机离子的最 佳配方为 : 20 g/ L 蔗糖 + 5 g/ L 蛋白胨 + 1 g/ L MgSO4 ·7 H2 O。 表 1 　蛹虫草培养基配方 Table 1 　Component s of cult ure medium Cord yceps mi l i t aris ρ/ (g ·L - 1) 　 编号 碳源及含量 氮源及含量 无机离子及含量 1 葡萄糖 20 N H4 NO3 1 K2 HPO4 1. 00 2 葡萄糖 20 蛋白胨 5 MgSO4 0. 50 3 葡萄糖 20 酵母提取物 5 FeSO4 0. 05 4 蔗糖 20 N H4 NO3 1 MgSO4 0. 50 5 蔗糖 20 蛋白胨 5 FeSO4 0. 05 6 蔗糖 20 酵母提取物 5 K2 HPO4 1. 00 7 麦芽糖 20 N H4 NO3 5 FeSO4 0. 05 8 麦芽糖 20 蛋白胨 5 K2 HPO4 1. 00 9 麦芽糖 20 酵母提取物 5 MgSO4 0. 50 2. 2 　小型发酵罐分批发酵实验 发酵液 p H 对微生物的生长和代谢具有重要影 响。因此 , 在摇瓶发酵实验结果的基础上 , 考察蛹 虫草在小型发酵罐中发酵的 p H 控制策略。 2. 2. 1 　不控制 p H 发酵 在实验中不控制 p H , 每隔 8 h 取样 1 次 , 每次 取样 100 mL , 测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘 露醇的浓度 , 结果如图 4 所示。 1 —p H ; 2 —甘露醇质量浓度 ; 3 —菌丝体质量浓度 图 4 　不控制 p H 条件下发酵液 p H、甘露醇浓度 及菌丝体质量浓度随时间的变化 Fig. 4 　Variation of p H , biomass and mannitol concent ration with time wit hout p H in cont rol 由图 4 可得 : a. 菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正 相关关系 , 即随着菌丝体的生长 , 甘露醇质量浓度 随之增加 ; 由此可以初步判断 , 甘露醇为生长偶联 型代谢产物。 ·0011· 中南大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 37 卷 b. 接种约 80 h 后 , 甘露醇质量浓度和菌丝体 质量浓度均达到最大值 , 比陈晋安等[16 ] 报道的菌丝 体质量浓度达到最大值时间 (144 h)大大缩短。 c. 在不控制 p H 发酵条件下 , 发酵液的 p H 先 下降而后上升 ; 当 p H 约为 5. 5 时 , 菌丝体质量浓 度和甘露醇质量浓度均达到最大。 p H 值出现这种变化 , 可能是随着菌丝体的生 长 , 分泌胞外活性物质如有机酸和甘露醇等 , 使得 发酵液的 p H 值下降 ; 当菌丝体质量浓度和甘露醇 质量浓度达到最大后 , 由于培养基中养分耗尽 , 菌 丝体开始自溶 , 开始利用有机酸及甘露醇等作为碳 源 , p H 上升。 2. 2. 2 　恒定 p H 发酵 由以上实验结果可知 , 初始 p H 为 6. 10 时最适 合菌丝体生长。运用自动流加酸碱的方法控制 p H 恒定在 6. 10 , 其他实验条件不变进行发酵实验。实 验结果如图 5 和图 6 所示。可见 , 将初始 p H 控制 为 6. 10 在发酵初期有利于菌丝体生长 , 但一直恒定 控制 p H 为 6. 10 并不利于菌丝体的生长和甘露醇 的生成。 2. 2. 3 　分段控制 p H 发酵 上述实验结果表明 : 当菌丝体质量浓度和甘露 醇质量浓度达到最大值时 , p H 维持在 5. 5 左右。发 酵初期将培养基 p H 控制在 6. 10 左右有利于菌丝 体生长。因此 , 2 阶段控制 p H 策略 , 即开始控 制 p H 恒定在 6. 10 , 接种后 50 h 左右再将 p H 恒定 控制为 5. 5 , 其他实验条件不变。实验结果如图 5 和 图 6 所示。可见 , 分段控制 p H 与不控制 (自然) p H 和恒定控制p H = 6. 10相比不仅菌丝体生长速率加 快 , 且菌丝体最大质量浓度也明显增加。甘露醇产 1 —分段控制 p H ; 2 —恒定 p H = 6. 10 ; 3 —不控制 p H 图 5 　3 种分批发酵条件下菌丝体质量浓度 Fig. 5 　Mass concet rations of biomass under t hree different batch fermentation conditions 1 —分段控制 p H ; 2 —恒定 p H = 6. 10 ; 3 —不控制 p H 图 6 　3 种分批发酵条件下甘露醇的质量浓度 Fig. 6 　Mass concent rations of mannitol under t hree different fermentation conditions 量的变化与菌丝体质量浓度变化一致。分段控制 p H 得到的菌丝体质量浓度与甘露醇质量浓度最大 (菌丝体质量浓度为 17. 31 g/ L , 甘露醇质量浓度为 43. 47 g/ L) , 与恒定 p H = 6. 10 发酵时相比 , 菌丝 体质量浓度及甘露醇的质量浓度分别增加了 87 %和 24 % ; 与不控制 p H 发酵时相比 , 菌丝体质量浓度 及甘露醇的质量浓度分别增加了 32 %和 14 %。因 此 , 在 3 种 p H 控制策略中 , 分段控制 p H 液体深层 发酵策略对蛹虫草生长最有利。 3 　结　论 a. 获得了蛹虫草摇瓶培养最优条件 : 接种量为 5 %(体积分数) , 摇床转速为 150 r/ min , 初始液体 培养基 p H 为 6. 10 , 温度为 25 ℃, 培养时间为 5 d。 b. 菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正 相关关系。以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分 析指标 , 确定了蛹虫草的最适宜发酵培养基组成为 20 g/ L 蔗糖 + 5 g/ L 蛋白胨和 1 g/ L MgSO4 ·7 H2 O。 c. 采用 p H 分段控制发酵策略 , 不但菌丝体生长 速度快 , 菌丝体质量浓度增加 , 同时甘露醇质量浓度 也有明显增加 , 菌丝体质量浓度达到17. 31 g/ L , 甘 露醇质量浓度达到 43. 47 g/ L。选择 p H 分段控制的 液体深层发酵方式对蛹虫草发酵最有利。 参考文献 : [1 ] 　Chang H L , Chao G R , Chen C C , et al. 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