常用免疫组织化学染色方法-步骤

常用免疫组织化学染色方法 ( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行) 1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。 2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。 3.无水酒精Ⅰ 30秒。 4.无水酒精Ⅱ 30秒。 5.95%酒精Ⅰ 30秒。 6.95%酒精Ⅱ 30秒。 7.90%酒精 30秒。 8.80%酒精 30秒。 9.70%酒精 30秒。 10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10) 11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 12.水洗。 13.抗原修复。 14.PBS洗3次，1分钟/次。 15.加入血清孵育20分钟。 16.摔干血清，加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次，2分钟/次。 18加入二抗孵育30分钟。 19.PBS洗3次，2分钟/次。 20.加入ABC复合物，孵育30分钟。 21.PBS洗3次，2分钟/次。 22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。 23.PBS洗，水洗。 24.Harris苏木素染核5-10分钟。 25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入SP复合物孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。 (三)真空负压LSAB法 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min. 3.水洗。 4.如果需要，可进行抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入正常血清真空负压处理5min。 7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。 9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。 10.PBS洗3次，每次2分钟。 11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5分钟。 12.PBS洗3次，每次2分钟。 13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 14.PBS洗，水洗。 15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg) (四)Envision TM Systems. 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入一抗体孵育30-60分钟。 7.PBS洗3次，每次2分钟。 8.加入增强剂孵育20-30分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (五)免疫组化双染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入非免疫性动物血清，孵育10分钟。 7.PBS洗3次，每次2分钟。 8.加入第一抗体孵育60分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。 13.PBS洗3次，每次2分钟。 14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。 15.PBS洗3次，每次2分钟。 16.加入双染增强液，孵育10分钟。 17.加入非免疫性动物血清孵育10分钟。 18.PBS洗3次，每次2分钟。 19.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。 20.PBS洗3次，每次2分钟。 21.加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。 22.PBS洗3次，每次2 分钟。 23.加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。 24.PBS洗3次，每次2分钟。 25.加入AEC溶液，孵育5-10分钟。 26.自来水洗。 27.苏木素染核5-10分钟。 28.水性封片。 注： 1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。 2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。 (六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入选用的第一抗体孵育30-60分钟。 7.PBS洗3次，每次2分钟。 8.加入增强剂孵育20-30分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟 13.PBS洗3次，每次2分钟。 14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。 15.PBS洗3次，每次2分钟。 16.加入增强剂孵育20-30分钟。 17.PBS洗3次，每次2分钟。 18.加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。 19.PBS洗3次，每次2分钟。 20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。 21.自来水洗。 22.苏木素染核5-10分钟。 23.水性封片。 (七)细胞培养片免疫荧光染色法。 1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。 2.纯丙酮固定10分钟。 3.PBS浸洗3次，每次1分钟。 4.加入选用的第一抗体孵育120分钟。 5.PBS洗3次，每次2分钟。 6.加入荧光抗体孵育60分钟以上。 7.PBS法3次，每次2分钟。 8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。 9.水洗，蒸馏水洗。 10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。 (八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。 1.将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。 2.纯丙酮固定5-10分钟。 3.PBS浸洗3次，每次1分钟。 4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15分钟。 5.PBS洗3次，每次2分钟。 6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。 7.PBS洗3次，每次2分钟。 8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。 9.水洗，蒸馏水洗。 10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。