鼻咽癌细胞对HA的粘附作用及微丝的共聚焦显微镜观察

　第6卷第1期 　1997年3月 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY Vo l. 6. No . 1 Mar . 1997 　 鼻咽癌细胞对 HA 的粘附作用及微丝的 共聚焦显微镜观察* 张钦明　廖新波　唐慰萍　孙　宁 (广东医学院病理学教研室, 湛江　524023) 　　摘要　本文研究了人鼻咽癌上皮细胞系 CNE-2Z 对透明质酸 ( HA) 的粘附作用及其粘附后微丝 的改变, 结果表明, 鼻咽癌细胞粘附的 OD 值随 HA 浓度的升高而升高, 300Lg / ml、1250Lg/ ml 组与 对照组比较有极显著性意义, P< 0. 01; 癌细胞粘附的 OD 值随培养时间延长而升高 , 240min 组及 120min 组与60min 组比较有极显著性意义 , P< 0. 01。LSM 观察HA 浓度为300Lg/ m l时培养4 h 和24 h 的癌细胞微丝的分布明显不同, 培养4 h 的癌细胞呈圆形, 微丝均匀地分布于胞浆内; 培养24 h 的 癌细胞呈不规则形, 微丝主要分布于与 HA 的粘附面上。上述结果提示 HA 可促进鼻咽癌细胞粘附, 癌细胞与 HA 结合后可诱导 MF 重组。 　　关键词　鼻咽癌　粘附　透明质酸　微丝　共聚焦显微镜 *　广东医学院青年基金项目并受国家自然科学基金资助 肿瘤浸润转移过程中, 细胞移动及浸润与细胞骨架及相关结构关系密切。肿瘤细胞与正常 细胞的胞质骨架差异明显, 骨架的改变有可能反映恶性生物学行为, 特别是微丝束和粘着斑 的破坏及 F-肌动蛋白小体重组的出现与转化细胞和动物肿瘤的高转移性明显相关[ 1, 2]。我们 过去的研究发现鼻咽癌细胞表达 CD44S与鼻咽癌转移有关。CD44分子膜外部分能与细胞外 基质透明质酸 ( Hyaluronic Acid, HA) 结合, 膜内部分与肌动蛋白微丝连接, 调节微丝的重 组装与分布, 为细胞内外信息传递提供分子桥梁, 从而控制细胞形态、运动、增殖等生物效 应[ 3]。本文观察了人鼻咽癌上皮细胞系 ( CNE-2Z) 对 HA 的粘附作用, 并用激光共聚焦显微镜 ( Laser Confocal Scanning Microscopy, LSM) 观察了癌细胞粘附后微丝的变化。 材　料　和　方　法 1. 材料　CNE-2Z癌细胞由本研究室提供, 透明质酸为山东正大福瑞达制药有限公司产 品; F ITC-Phalloidin、及 RPMI1640培养液等均为美国Sigma公司产品; 结晶紫为德国产品; 全自动酶标仪为美国BIO-RAD公司产品( M 450型) ; 96孔及24孔培养板为美国CORNING 公 司产品; 激光共聚焦显微镜为德国 Zeiss公司产品 ( LSM -410型)。 2. 细胞培养及粘附　用 PBS将透明质酸配成浓度为3Lg / ml、15Lg/ ml、50Lg/ m l、300Lg/ ml、1250Lg / ml。( 1) 分别取20Lg / ml孔包被96孔板 ( 5% CO 2 , 37℃, 24 h) , 每组浓度12孔。 CNE-2Z 癌细胞置入含15%小牛血清的 RPMI1640培养液 (加青霉素100U/ m l和链霉素 100Lg / ml ) 中。在含有5%CO 2的培养箱内培养, 细胞长满瓶后用胰酶消化脱壁, 调成1×105个 / ml , 每孔加入100Ll, 同时设空白及对照组, 在含有5%CO 2的培养箱内孵育。孵育时间分别设 30m in、60min、120min、240m in 四个时间组, 孵育后弃去生长液, 用结晶紫染色5分钟, 再 用温PBS 洗4次, 加50Ll/ m l醋酸酒精提取, 以空白组调零, 用酶标仪测量每孔在579nm 波长 处的 OD值, OD 值越高反映粘附的癌细胞数目越多[ 4] , 比较不同浓度及时间点粘附的细胞 OD值。( 2) 将盖玻片剪至24孔板孔径大小, 置入孔中, 选择在粘附实验中作用较好的透明质 酸浓度, 按上述方法包被玻片 ( 100Ll/孔) 及加入癌细胞 ( 2×104个) , 分别于4、24 h 取出玻 片, PBS冲洗, 冷丙酮甲醇固定备用。 3. 荧光染色　将 FITC-Phallo idin ( 1÷10) 滴加在固定的细胞上, 湿盒孵化 (室温) 1 h, PBS冲洗后封片。 4. 激光共聚焦显微镜观察　在荧光显微镜下观察贴壁生长4 h 和24 h癌细胞的二维形态 结构, 选好视野后于第二通道处对 FIT C-Phal loidin 标记的细胞进行断层扫描成像, 选用 Laser 488/ 514nm 波长, 观察细胞微丝不同光切面的形态结构的变化。扫描图像于 File/ store 下贮存, 并在输出设备 Video-Printer 下对所贮存图像进行全屏幕摄影 [ 5]。 5. 数据统计　采用医学统计软件POMS 作 t或 tq检验。 结　　果 1. CNE-2Z癌细胞对透明质酸的粘附作用 癌细胞粘附的 OD值随透明质酸浓度的升高而增加, 在30m in时癌细胞的粘附作用最明 显, 透明质酸浓度从15～300Lg/ m l组癌细胞粘附 OD 值都显著高于对照组, P< 0. 01, 其中 300Lg / ml组癌细胞粘附 OD值呈峰值升高, 而1250Lg / ml组癌细胞粘附 OD值则不能测出; 在60min、120min和240m in 时仅表现为300Lg/ ml及1250Lg / ml浓度下癌细胞粘附OD值明显 升高, 比较有显著意义, P< 0. 01; 余浓度组间比较无显著性意义, P> 0. 05。在同一浓度下, 随着孵育时间延长, 癌细胞粘附的 OD值逐渐升高, 300Lg / ml浓度组30min、60min、240m in 组间比较有显著性意义, P< 0. 01; 1250Lg/ ml浓度组240min与60min、120min间比较有显著 性意义, P< 0. 05。余不同时间组间比较无显著意义, P> 0. 05。上述结果表明透明质酸在 300Lg / ml及1250Lg / ml浓度下对癌细胞的体外粘附促进作用较好 (见附表)。 附表　鼻咽癌细胞对透明质酸的粘附 OD 570nm ( x-±s) 时间 ( min) 浓　　度 (Lg / ml) 0 3 15 50 300 1250 30 60 120 240 0. 047±0. 021 0. 096±0. 033 0. 230±0. 067 0. 265±0. 060 0. 072±0. 035 0. 118±0. 038 0. 245±0. 089 0. 305±0. 051 0. 184±0. 038 0. 113±0. 032 0. 251±0. 095 0. 320±0. 054 0. 101±0. 022 0. 119±0. 039 0. 233±0. 091 0. 360±0. 190 1. 286±0. 381 0. 190±0. 203 0. 242±0. 070 0. 455±0. 066 - 0. 898±0. 707 1. 264±0. 336 1. 783±0. 454 2. 激光共聚焦显微镜观察 在共聚焦荧光显微镜下见贴壁4 h后癌细胞大部分仍为圆形, 有少部分细胞不规则, 有胞 质突起, 胞质微丝荧光均匀分布于胞质内。贴壁24 h 后癌细胞大部分伸展贴壁较好, 细胞呈不 83第1期　　　　　　　张钦明等. 鼻咽癌细胞对 HA 的粘附作用及微丝的共聚焦显微镜观察　　　　　　　 规则形, 有胞质突出, 微丝荧光呈丝状分布于胞质, 并沿胞突伸展。 单层扫描: 贴壁4 h后的癌细胞胞质微丝单层扫描见伪彩呈细颗粒状较均匀分布于胞质 中 (图1) ; 贴壁24 h 后癌细胞单层扫描显示胞质微丝伪彩呈颗粒状不均匀分布于胞质中 (图 2) , 许多颗粒成串排列, 有一定方向性, 并沿胞突伸展, 内散在一些较粗的颗粒。 细胞 “CT”: 在 Z 轴方向从细胞粘附面至游离面扫描, 步进为0. 25～0. 4Lm, 共作16个光 切面, 可清晰地观察到整个癌细胞胞质微丝的分布情况。贴壁4 h 癌细胞做步进为0. 4Lm 扫 描, 16个光切面显示胞质微丝伪彩呈细颗粒较均匀地分布在细胞中央, 从HA粘附面至游离 面伪彩分布减少幅度较小(图3)。贴壁24 h癌细胞做扫描步进为0. 25Lm, 16个光切面显示胞质 微丝伪彩呈颗粒状, 并明显向胞质粘附面聚集, 部分呈较粗的颗粒, 且16个光切面显示细胞 微丝荧光颗粒的分布极不均匀, 从 HA粘附面至游离面伪彩分布顺序减少幅度大 (图4) , 第 12 ( 2. 75Lm 处) 切面始细胞微丝荧光颗粒逐步消失。从步进数据显示, 贴壁24 h 癌细胞比贴 壁4 h 癌细胞明显变薄。 讨　　论 肿瘤转移是一个复杂的生物学过程, 整个过程中存在着瘤细胞与瘤细胞、内皮细胞及细 胞外基质粘连与解粘连的问题。粘附受体以表达的上调、下调和它们在细胞膜上分布的变动影 响着癌细胞的侵袭表型[ 6]。侵袭是癌细胞转移的前提和关键步骤, 因而, 细胞对细胞外基质 ( HA) 的粘附是转移的重要方面 [ 7]。本实验进一步观察了人鼻咽癌细胞 ( CNE-2Z) 对透明质酸 的粘附作用, 结果显示, 随着透明质酸浓度升高, 癌细胞粘附作用增大, 其中, 在透明质酸 浓度为300Lg/ m l和1250Lg/ m l时癌细胞体外粘附作用较好且稳定。在同一浓度下, 培育时间 延长, 癌细胞粘附增多。有研究发现, CD44作为粘附分子可介导淋巴细胞归巢到外周淋巴样微 环境里, 还能与细胞外基质如透明质酸及胶原结合, CD44可在不同水平被调节, 参与肿瘤侵 袭和转移[ 7]。提示鼻咽癌细胞可能通过 CD44与透明质酸粘附, 促进癌细胞侵袭和转移。 单纯培养的癌细胞胞浆内微丝相对集中于核周围, 质膜周边较稀疏 [ 8]。本实验表明, 癌细 胞与透明质酸共育4 h 后, 大多数癌细胞的微丝分布在细胞核周围, 少部分出现聚集现象, 胞 质有突起, 微丝呈细颗粒状, 大小较一致, 呈向细胞粘附面集聚趋势, 说明细胞内微丝蛋白 出现重排, 偏向细胞粘附侧, 这种改变在作用24 h后尤为显著。这些结果提示鼻咽癌细胞可与 细胞外基质 ( HA) 结合, 进而调节微丝的重组装与分布。有实验显示 CD44介导前列腺癌细胞 粘附到透明质酸上, CD44胞内肽链特异地结合到 Ankyrin上。免疫荧光双标记和共焦显微镜 分析提示 HA结合诱导 HA 受体形成帽状结构, 提示细胞骨架蛋白如 Anky rin与由HA 诱导 CD44介导的信号转导有关, HA 介导的 CD44与细胞骨架蛋白 (即 Ankyr in) 的相互作用在调 节前列腺癌细胞行为过程中起重要作用[ 9]。因而鼻咽癌细胞是否通过此方式为细胞内外信息 传递提供分子桥梁, 从而控制细胞形态、运动、增殖等生物效应, 有待于进一步研究。 收稿1996-07　修回　1996-11 参　考　文　献 1　Zacha ry JM , Clevuland G , Kow ck L , et al. Actin filament or ganizat ion of the dunning R3327 rat pr o st at- 84　　　　　　　　　　　　　　中国组织化学与细胞化学杂志　　　　　　　　　　　　　　　第6卷　 ic adenocar cinoma system co rr elation w it h m etastatic potential. Cancer Res 1986; 46 ( 2) : 926 2　Lin ZX , Han YL , Wu BQ , et al. A ltered cy to skeleton str uctur es in tr ansfo rmed cells exhibiting obvious- ly m etastatic capabilities. Cell Res 1990; 2: 141 3　Brocks L , Niedo tek G , Agathang G, et al. The expression of v ariant CD44 in nasophar yngeal car cinoma is unrelated to expr ession of LMP-1. Am-J-Pathol 1995; 146 ( 5) : 1102 4　黄瑾等, MT T 比色细胞增殖方法的改良及实验影响因素的观察. 白求恩医科大学学报1992; 18 ( 4) : 395 5　廖新波, 孙宁, 唐慰萍等. 鼻咽癌凋亡细胞核DNA、胞质微丝形态结构的激光共聚焦显微镜观察. 广东 医学院学报, 1996; 3: 6　Aruffo A I, Stamenkov ic L , Melnick M , et al. CD44 is the pr incipal cell sur face r ecepto r fo r hyaluronat e. Cell 1990; 61: 1303 7　Ider za RL , Car ter WG , No ttenburg C, et al. Issolation and DNA sequence o f a cDNA clone encoding a lymphocyte adhesion r ecepto r fo r high endo thslium. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 4659 8　丁彦青. 体外 LAK 细胞杀伤人直肠腺癌细胞时细胞骨架变化. 临床与实验病理学杂志, 1994; 10 ( 1) : 5 9　Welsh CF , Zhu D, Bourguignon LY , et al. I nt eraction o f CD44 variant iso forms w it h hyaluronic acid and t he cy toskeleton in human prostat e cancer cells. J Cellular Physio log y 1995; 164 ( 3) : 605 ADHESION OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELLS TO HYALURONIC ACID ANDMORPHOLOGICAL OBSERVATION OF MICROFILAMENT BY LASER CONFOCAL SCANNING MICROSCOPY Zhang Qinming, L iao Xinbo, Tang Weiping , Sun Ning ( Department of Pathology , Gunagdong M edical Colleg e, Zhanj iang 524023) Adhesion o f NPC to hyaluronic acid ( HA) and the m icrof ilaments ( MF) mor pholog ical changes w ere studied. The OD levels of the adhesion o f NPC cel ls to HA increased along w ith the increasing of HA concentr at ion degree. Ther e w ere signif icant differ ences betw een 300Lg / ml , 1250 Lg / ml gr oup and the control , P < 0. 01. T he OD levels of the adhesion o f NPC cell to HA increased w ith the delaying of cultural t ime. There were signif icant dif fer- ences between 240mins, 120m ins and 60mins, P < 0. 01. Mo rpholo gical observ at ion of M F by LSM technique indicated that there w ere signif icantly dif ferent dist ribut ion betw een 4 h and 24 h culture time. The NPC cells at 4th w ere circle in shape, the M F like small granule distr ibuted irregularly in plasm; T he NPC cells at 24th w ere ir regular in shape, the M F lo- cated chief ly at the bo ttom of NPC cells, i. e. the adhesion point o f NPC to HA. The results suggest ted that HA af fected signif icant ly the adhesion of NPC, and the combinat ion of NPC to HA induced the reorg anizat ion o f MF. KEYWORDS　Nasopharyngeal carcinoma; Adhesion; Hyaluronic acid; Microf ilament ; Laser confocal scanning m icroscopy 图 版 说 明 图1　贴壁4小时后的癌细胞胞质微丝呈细颗粒状 (↑) 均匀分布于胞质中, F ITC-Phallo idin 染色1. 4。×630 图2　细胞 “CT”, 贴壁4小时癌细胞16个光切面微丝呈细颗粒状 (↑) 较均匀地分布在细胞中央, 从细胞粘 附面 ( OLm 处) 至游离面 ( 6Lm 处) 微丝分布减少幅度小。F ITC-Phallo idin 染色。×630 图3　贴壁24 小时后癌细胞胞质微丝呈颗粒状 (↑) 不均匀分布于胞质中, F ITC-Phallo idin 染色。1. 7 ×630 图4　细胞 “CT”, 贴壁24小时癌细胞16个光切面微丝呈颗粒状 (↑) , 并明显向胞质粘附面 ( 0Lm 处) 聚集, 且分布极不均匀, 从细胞粘附面至游离面 ( 3. 75Lm 处) 微丝分布顺序减少幅度大, F IT C-Phallo idin 染 85第1期　　　　　　　张钦明等. 鼻咽癌细胞对 HA 的粘附作用及微丝的共聚焦显微镜观察　　　　　　　 色。×630 EXPLANATION OF FIGURES Fig . 1　After 4 hours cultur e t he MF like small g ranules (↑) distr ibuted regular ly in plasm. F IT C-Phal- lo idin staning 1. 4. ×630 Fig . 2　After 4 hours cult ur e, t her e w ere cell CT 16 slides, the MF like sma ll gr anules (↑) distributed regular ly in plasm , t he distr ibut ion of MF decr eased slowly fr om the adhesion po int t o the surface of NPC cells. F ITC-Phalloidin sta ining. ×630 Fig . 3　After 24 hour s culture, the distribution of the MF like small gr anules (↑) w er e rugged in plasm. F ITC-Phallo idin st aining 1. 7. ×630 Fig . 4　After 24 hour s cultur e, ther e w ere cell CT 16 slides, the distribution o f MF (↑) w ere rugged in plasm. T he MF located chiefly at the adhesion po int of NPC t o HA. T he distr ibut ion of MF de- creased quickly fr om the adhesion point to the surfa ce of NPC cells. FIT C-Phalloidin staining. × 630 86　　　　　　　　　　　　　　中国组织化学与细胞化学杂志　　　　　　　　　　　　　　　第6卷