肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆、表达及活性鉴定

中华流行病学杂志2013年5月第34卷第5期ChinJEpidemiol，May2013，v01．34，No．5 肠道病毒71型外壳蛋白VPl基因克隆、表达及活性鉴定 黄学勇 李幸乐 胡晓宁杜燕华许玉玲卫海燕 陈豪敏许汴利 【关键词】肠道病毒71型；外壳蛋白VPI；原核表达；抗 原性 Cloning，expremionandactivitydeterminationofcapsid proteinVPIofenterovirustype71HUANGXue-yong，LI 尉昭一le，HU施∞-ning，DUYan-hua，XUYu—ling，WEIHai-yan， CHENHao-min．XUBian-li．InstituteforInfectiousDisease ControlandPrevention，HenanProvincialCenterforDisease ControlandP㈣ention．Zhengzhou450016．China Correspondingauthor：XUBian4i，Email：xubl@hncdc．com．ca Th／sworkwa$supportedbygrantsfromtheScienceand TechnologyBureauofHenanProvince(No．122102310268)， thettenanProvincialMedicalScienceProject(No．201001015) andtheYoungMedicalScienceandTechnologyInnovation TalentsProjectofttenanProvince． 【Keywords】Enterovirustype71；CapsidproteinvPl； Prokaryoticexpress；Antigenicity 肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型 (CoxAl6)是引起手足口病最为常见肠道病毒，其中EV71是 引起当前我国手足口病的病原优势株⋯。目前临床对EV71 感染以对症治疗为主，尚无有效的抗病毒药物，研制安全有 效的疫苗和早期诊断试剂是预防控制手足口病疫情的经济 有效地，为此进行以下相关研究。 1．材料与方法： (1)材料：Ev7l／H∞a“106／2009分离株(HQ998852．1)由 本实验室从郑州市手足口病患儿粪便标本中分离并保种。 手足口病患儿急性期血清和健康儿童血清标本采集于郑州 市儿童医院。 (2)方法： 0)vel基因克隆：参照EV71／Henan／106／2009河南分离 株序列，利用生物学软件Primer5．0EV71的VPl基因 PCR引物：上游5’一CGGGATCCATGGGAGATAGGG TGGCAG一3’；下游5’一CGCCTGCAGTTAAAGAGT GGTGATCGC一37。分别在上、下游引物引入BamHI和 DOI：10．3760／cma．j．issn．0254—6450．2013．05．029 基金项目：河南省科技攻关(122102310268)；河南省医学科技 重大攻关项目(201001015)；河南省卫生科技创新型人才工程中青 年科技创新人才项目 作者单位：450016郑州，河南省疾病预防控制中心 通信作者：许汴利，Emal：xubl@hncdc．com．cn ·541· ·疾病控制· ／'stI酶切位点。常规培养人横纹肌肉瘤细胞生长成单层后 接种EV71，待细胞病变效应达到+++以上收集细胞，用病 毒基因组RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，以 cDNA进行PCR扩增，使用1．2％琼脂糖凝胶对PCR产物 进行电泳分析，特异性扩增片段经DNA纯化试剂盒回收后 克隆至pMD@18一TVector，转化JMl09感受态细胞，重组克 隆载体经特异性PCR和测序鉴定。 ②VPl表达质粒构建：质粒提取试剂盒提取重组载体 pMDl8-EV71一VPl和表达质粒pMAL—c2X，分别用BamHI 和ntI双酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒纯化回收目的 片段。VPl与pMAL-c2X酶切产物以6：l的mol比例混合， T4DNA酶16℃过夜连接，转化TBl感受态细胞，于含x．gal 和IPTG的LB氨苄青霉素固体培养基上培养。挑选白色菌 落，接种于LB液体培养基中培养，提取质粒进行单、双酶切 和PCR扩增鉴定。 ③目的基因的诱导表达与SDS．PAGE分析：将已鉴定为 阳性表达克隆的2ml菌液加入到200mlLB液体培养基中， 37oC，240r／min，摇菌1．5h，加入终浓度为0．4mmol／L的 IPTG，诱导表达5h。取菌液样品1ml离心，弃上清，加入 1001112×SDS—PAGE上样缓冲液，于100℃水浴5min，离心 后取10¨l上清加样。采用0．5mg／L的浓缩胶和1．2mg／L的 分离胶电泳，凝胶用考马斯亮蓝R250染色。将诱导TBl (pMAL—c2X—hpaA)菌液离心，弃上清，一80℃冻存过夜， PBS洗沉淀后，重悬于20mlColounbuffer中，冰水浴中超声 破碎，取上清通过蛋白纯化仪(型号：AKTApurifier10／100)、 Amyloss树脂预装柱纯化重组VPl蛋白，紫外分光光度计测 定样品蛋白含量。 ④重组VPl蛋白Westernblot分析：纯化样品进行SDS． PAGE电泳后，凝胶和硝酸纤维素膜于半干式电转印仪中转 印。硝酸纤维素膜经封闭后，与手足口病患儿血清(1：50) 反应2h，再与羊抗人血清(1：2000)反应lh，二氨基联苯胺 显色，同时以健康儿童血清为对照。 2．结果： (1)VPl基因克隆与测序鉴定：重组克隆载体经PCR方 法检测鉴定阳性克隆，进行DNA测序证实获得VPl基因核 苷酸序列与Ev71／Henan／106／2009分离株基因组相应序列完 全一致。 (2)VPl重组表达质粒构建及鉴定：重组表达质粒分别 用BamHI和PstI单、双酶切、以及PCR扩增均获得相应大 小的DNA片段，表明重组表达质粒pMAL—c2X—EV71～VPl 万方数据 ·542。 生堡煎堡疸堂盘查!!!!生!旦箜丝鲞箜!塑堡垒垫!里P!旦!里i!!!M型!!!!!塑!：兰!堕!：! 构建成功。 (3)诱导表达产物的SDS．PAGE：将重组菌TBl (PMAL—c2X—EV71一VPl)和对照菌TBl(PMAL—c2X)以及 TBl诱导后的粗提蛋白进行SDS．PAGE电泳，发现重组细菌 在相对分子质量71500(Da)处出现一条特异蛋白带，是标签 蛋白MBP(42500Da)与VPl(29000Da)的总和(图1)。经 纯化获得重组VPl蛋白，紫外分光光度计测定样品蛋白浓度 约为0．136mg／ml。 1)a 。 ⋯972卅00-；蠢 44300-羹 29I)00一■■—● 20100一豢 14300一毒—I 注：l：proteinmarker；2：EcoliTBI诱导；3：TBI(pMAL—c2X) 诱导；4，5：TBI(pMAC—c2X—EV71一W1)诱导 图1 TBl(pMAL—c2X—EV71一VPl)诱导表达产物的 SDS．PAGE分析 (4)纯化目的蛋白Westernblot鉴定：纯化重组蛋白vPl 与手足口病患儿血清进行Westernblot分析，在约71500Da 处出现单一的反应带，而健康儿童血清对照未出现任何条带 (图2)，证实纯化后获得目的蛋白具有良好免疫活性。 注：l：继康儿童血清；2：手足口病患儿血清 图2纯化EV71重组VPl蛋白与儿童血清Westemblot反应 3．讨论：自2008年我国手足口病呈持续性暴发和流 行n1，其中以EV71引起的疫情和临床症状最为严重，且早期 临床表现与其他肠道病毒引起的手足口病不易区分，由于目 前实验室应用的核酸检测方法操作繁琐、周期较长、操作过 程中有容易出现气溶胶污染等问题，因此目前国内研发快 速、高效、廉价简便易行和准确性优良的血清学诊断试剂是 EV71研究的难点和热点之一。 EV71的VPl可直接决定病毒的抗原性，其主要血清特 异性中和位点也存在于VPl，从病毒外壳蛋白分离的VPl蛋 白可诱导动物产生针对该表位的中和性抗体，提示该外壳蛋 白分子可以成为EV71疫苗和临床诊断试剂研究良好的候选 抗原o‘4】。本研究使用原核表达系统高效表达了EV71外壳 蛋白VPl，经纯化获得具有免疫活性的VPl重组蛋白，可作 为EV71感染患者的早期、快速、可靠的血清学诊断试剂研发 的候选抗原。 参考文献 【lJHuangXY，GuoWS，MaH，eta1．Genomiccharacteristicsof enterovirus71 isolates，Henanprovince，2009．ChinJProvMed． 2010，44(5)：469--471．(inChinese) 黄学勇，郭万申，马宏，等．2009年河南省肠道病毒71型基因组 特征分析．中华预防医学杂志，2010，44(5)：469-471． 【2JSunJL，ZhangJ．Areviewontheadvancementofepidemiologyon hand-foOt—mouthdisease．ChinJEpidemi01．2009．30(9)：937— 945．(inChinese) 孙军玲，张静．手足口病流行病学研究进展．中华流行病学杂志， 2009，30(9)：937—945． 13J LiL，HeY，YangH．eta1．Geneticcharacteristicsofhuman enterovirus7landcoxsackievirusA16circulatingfrom1999to 2004inShenzhen，People’SRepublicofChina．JClinMicrobi01． 2005，43(8)：3835—3839． [4]BaeJY，MoonSH，ChoiJA，eta1．RecombinantDNAandprotein vaccinesforfoot—and—mouthdiseaseinducehumoralandcellular immuneresponsesinmice．ImmuneNetw，2009，9(6)：265—273． (收稿日期：2012—12—22) (本文编辑：张林东) 震 万方数据 Administrator 标注工具 Administrator 标注工具