人心肌干细胞的体外改良培养

[文章编号] 1000-4718(2013)02-0381-04 [收稿日期] 2012-07-03 [修回日期] 2012-12-27 ![基金项目]国家自然科学基金资助项目 No.6590000029 "通讯作者TeI 025-83272038 E-maiI magenshan@hotmaiI.com ~实验技术~ 人心肌干细胞的体外改良培养! 胡圣大! 马根山"! 姚玉宇! 陈中噗! 严凤梯 东南大学附属中大医院心内科 江苏 南京 210009 [摘 要] 目的: 用改良的培养基培养人心肌干细胞 并筛选鉴定 方法: 通过心脏外科手术取下右心耳组 织 用组织,培养法来获得原代心肌干细胞 用改良的心肌干细胞培养液培养 增殖传代后进行心肌干细胞表面标 志物的鉴定 再用免疫磁珠筛选以获得较纯的目的心肌干细胞 结果: 培养约 2 周后 贴壁良好的心肌组织,周围 可见有小 圆 亮的细胞爬出 用Accutase 细胞消化液 短时间消化后冲洗细胞 培养增殖传代 其增殖能力与传统 心肌干细胞培养液培养的细胞比较无显著差异 用流式细胞术鉴定 c-kit 干细胞表面标志物 其阳性率 6.8 1 2.1 % 之后用含抗c-kit抗体 anti-c-kit 的磁珠进行分选 即得较纯的 c-kit阳性 c-kit+ 心肌干细胞 它们可以 分化为心肌细胞 结论: 通过心脏组织,贴壁培养法 用改良后的心肌干细胞培养基培养 再借助免疫磁珠的分 选 同样可得到较纯的c-kit+心肌干细胞 [关键词] 心肌干细胞 流式细胞术 磁珠分选 [中图分类号] R542.2 +2 [文献标志码] A doi 10.3969/j.issn.1000-4718.2013.02.035 Cultureofhumancardiacstemcellswithimprovedcardiosphere-growing mediuminvitro ~Usheng-da MAGen-shan YAOYu-yu C~ENzhong-pu YANfeng-di DepartmentofCardiology thefffiliated Zhongda Hospitalofsoutheastuniuersity Nanjing 210009 China.E-mail ma- genshan@hotmail.com ABSTRACT AIM Topreparean improved mediumforcuIturinghuman cardiacstemceIIs.METHODS The heartsampIesoftherightauricIeobtained fromthepatientsaftercardiacsurgerywereminced intopieces about1 mmx1 mmx1 mm digested and cuItured.TheprimaryceIIsobtained werecuItured with improved cardiosphere-growingmedium CGM forproIiferation and theceIIswereidentified byfIowcytometry.finaIIy purerc-kit+ceIIswereobtained bythe method ofmagneticbead sorting.RESULTS Afterabout2 weeksofcuIture smaII round and phase-brightceIIsmigrated fromtheweII-adherentexpIantsoveraIayeroffibrobIast-IikeceIIs.TheseceIIswerecoIIected byabriefdigestion with Ac- cutase washed and cuItured with improved CGM.NosignificantdifferenceoftheproIiferativecapacitybetween usingtradi- tionaICGMand improved CGMwasobserved.AftersubcuItureand proIiferation theidentification resuItbyfIowcytometry showed thatthepositiverateofc-kitsurfacemarkeron theseceIIswas 6.8 12.1 %.bythemethod ofanti-c-kitmag- neticbead sorting purerc-kit+cardiacstemceIIswereobtained and differentiated intocardiomyocytes.CONCLUSION Purerc-kit+cardiacstemceIIsareisoIated with theimproved CGMcuIture. E ORDS CardiacstemceIIs fIowcytometry Magneticbead sorting 一直以来的传统观念都认为哺乳动物的心脏是 终末分化器官 心肌细胞是永久性细胞 正常情况下 心肌细胞的寿命与个体寿命相同 不能分裂增殖 伴随着疾病和衰老 部分成年心肌细胞丢失 只能通 过剩余心肌细胞的肥大和结缔组织的增生纤维化来 进行重构代偿 然而 近年来这一观点正逐渐被动 摇 认为成年心脏虽是终末器官 但心肌组织中含有 可以再生的细胞 称之为心肌干细胞 它可以分化为 心肌细胞 内皮细胞及平滑肌细胞 1 在人的一生 中 成年心肌细胞不停地衰老死亡 同时由心肌干细 胞不断增殖分化为新的心肌细胞 维持心肌细胞数 目的动态平衡 保持心脏功能 2-3 病理情况下心肌细胞的丢失量超过其增殖代偿 能力 便会出现前述传统观念的变化 因此如何进一 183 中国病理生理杂志 ChineseJournaIofPathophysioIogy 2013 29 2 381-384 万方数据 步促进心肌干细胞的增殖归巢分化便成为当前研究 的热点O 而这些研究的基础在于心肌干细胞的培养 获得,本研究旨在探索一条简便实用的培养方法,为 心肌干细胞的进一步研究打下基础O 材 料 和 方 法 1 Trypsin和 coIIagenaseV 粉剂购自 Biosharp;Ac- cutase购自 MiIIipore;无菌磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saIine,PBS)~胎牛血清~L-谷氨酚胺~青霉素 链霉素双抗~IMDM和DMEM/Fl2 培养液均购自Hy- CIone;B-琉基乙醇购自 Sunshine;血管内皮生长因子 (vascuIarendotheIiaIgrowth factor,VEGF)和碱性成纤 维细胞生长因子(basicfibrobIastgrowth factor,bFGF) 购自 Sigma;anti-c-kitmicrobeads和 anti-c-kit-PE购 自MiItenyiBiotec;恒温细胞培养箱购自Thermo;恒温 振荡仪购自太仓市科教器材厂O 2 方法 2.1 取村和培养 心脏外科手术过程中(患者年龄 2 ~72 岁;心脏疾病有Z冠心病~瓣膜病和先心病),在 情况许可的条件下,取右心耳组织数克O 用不含钙~ 镁的无菌PBS冲洗掉血液,去掉脂肪组织后剪成大 小 l mmXl mm Xl mm左右的小块,然后移入离心 管加入适量 0.2%胰蛋白酶和 0.l%胶原酶 IV的混 合液,37 C振荡消化 5 min,移去消化液,重复 3 次O 处理后的组织块用完全组织块培养液(compIeteex- pIantmedium,CEM;以IMDM为基础,含 20%胎牛血 清~2 mmoI/LL-谷氨酚胺~l Xl05 U/L青霉素~l00 mg/L链霉素和 0.l mmoI/LB-琉基乙醇)冲洗 l ~2 次后移入到 6 孔板中并使其均匀分散O 加入少量 CEM(约 0.5 mL左右),保持组织块湿润即可,置于 37 C~含 5%CO2 的恒温培养箱中贴壁O 8 ~l2 h 后 加入 l ~l.5 mL的CEM,继续前述条件培养,2 ~3 d 换 l 次培养液O 2.2 心肌干细胞的收集培养 通常 3 ~7 d 的时间 内,贴壁良好的心肌组织块周围可见到先有长梭形 的成纤维细胞爬出,之后数天即可见在其上面爬出 的小~圆~亮的细胞,当有较多的此类细胞时,即用 Accutase消化(约 2 min即可),之后加入少量改良的 心肌干细胞培养液 (improved cardiosphere-growing medium,improved CGM;以 DMEM/Fl2 为基础,含 l0%胎牛血清~2 mmoI/LL-谷氨酚胺~l Xl05U/L青 霉素~l00 mg/L链霉素和 0.l mmoI/LB-琉基乙醇, 较之传统的CGM,减少了VEGF和 bFGF2 种细胞因 子),轻柔地冲洗数次,将冲洗后的混合液移入 6 cm 的培养皿中培养,置于 37 C~含 5%CO2 的恒温培养 箱继续培养传代增殖,2 ~3 d换 l 次培养液O 2.3 心肌干细胞的鉴定及纯化 待 3 ~6 d后,培养 皿中的细胞基本上生长融合,且为单层细胞,用 Ac- cutase消化 3 ~5 min,取适量样品,加入anti-c-kit-PE 孵育后行流式细胞术分析,剩余细胞用 anti-c-kit抗 体吸附的磁珠进行分选[4-5] ,即可得到较多较纯的 c-kit+心肌干细胞O 2.4 心肌干细胞的增殖和分化测定 利用 CCk-8 (CeIICountingkit-8)来测定细胞增殖能力,细胞接 种于 96 孔板,每孔约 3 Xl03 细胞,分别用传统的 CGM和不含 VEGF和 bFGF的 CGM进行培养,3 d 后各 l6 个孔在 450 nm处测定 A 值,所得数据间接 表示细胞的量,所有步骤严格按试剂盒说明进行O 开胸结扎前降支制作裸鼠心梗模型后,经心外膜注 射心肌干细胞,4 周后取心肌组织进行组织免疫荧光 染色鉴定心肌干细胞的分化情况O 3 统计学处理 采用 SPSS l8.0 软件分析,数据以均数1标准差 (mean 1SD)表示,组间比较采用 I检验O 结 果 1 组织块的培养 贴壁好的组织块周围,早的 3 d后即可看见周围 有梭形的成纤维细胞爬出,最晚的 l 周左右也可以 爬出,否则通常不再会有细胞爬出O 成纤维细胞爬 出后 3 d左右在其上面即可以出现小~圆~亮的细胞, 以后逐渐增多,见图 lO Figurel.PrimarycardiacstemceIIscuItured fromtissuebIocks ( Xl00 ).LowerIeftcornerZ myocardiaItissue bIocks.ThearrowsshowsmaII, round and brightpri- marycardiacstemceIIs,whiIethetriangIesrefertothe fibrobIasts. 图 1 组织块培养的原代心肌干细胞 2 心肌干细胞的获得’培养及纯化鉴定 待小~圆~亮的细胞出现较多后即可消化冲洗下 ~283~ 万方数据 来移入培养皿培养增殖,此时部分卜肌干细胞贴壁 后空间不受约束,胞质会向外伸展而形成梭形~多边 形或不规则异形等形状,见图 2O 不同年龄及疾病患 者细胞的c-kit阳性率是不一样的,总体上未分选细 胞c-kit的阳性率约 2% ~18%(6.8% 12.1%>,见 图 3O 经磁珠分选后即可得到一定量的较纯的c-kit+ 卜肌干细胞,c-kit阳性率可超过 80%O 所得细胞可 于-80 C较长时间保存(更长时间保存应保存于液 氮中>,且复苏后仍具有干细胞活力O 3 心肌干细胞的增殖和分化 利用 CCk-8 法我们测定了细胞的增殖能力,均 直接用C值表示细胞的量,传统CGM培养组和不含 VEGF及 bFGF的CGM组C值分别是 0.156 10.013 和 0.149 10.011,两组间差异无统计学意义(D> 0.05>O 体内卜肌干细胞的分化实验明确其可以分 化为卜肌细胞,见图 4O Figure2.thesecond generation ofcardiacstemceIIs( X200>. 图 2 传至第 2 代的呈球形的心肌干细胞 Figure3.FIowcytometricidentification ofcardiacstemceIIs.A: controI; B: IabeIed with anti-c-kit-PEfIowcytometryantibodyand thec-kitpositiveratewas8.44%. 图 3 消化下的第 2 代心肌干细胞的流式细胞术鉴定 Figure4.identification ofthedifferentiation ofcardiacstemceIIs usingtissueimmunofIuorescencetechnigue( X200>. Red fIuorescenceshowsstainingofmyocytecytopIasm bysarcomeric!-actin antibody; bIuefIuorescence showsnucIei; green fIuorescenceshowsIocaIization of mitochondria. 图 4 心肌干细胞的分化鉴定 讨 论 常用于鉴定卜肌干细胞的表面标记有 c-kit~isI1 和 Sca-1 等 6-8] ,本实验室测得 Sca-1 阳性的细胞数 比例仅 1.4%(由于市面上暂无用于测人干细胞的 Sca-1,考虑到可能的交叉反应,遂试用抗小鼠的anti- Sca-1,同时测得小鼠卜肌干细胞的 Sca-1 阳性率 1.8%,较之人无显著差异>O 而用anti-isI1 则几6无 阳性表达,加之文献报道认为从人卜肌组织中分离 的c-kit+细胞即为卜肌干细胞 6] ,故我们实验室最 终确定选定c-kit为卜肌干细胞的待测表面标志O 本研究采用 Messina等 9]的组织块培养法获取 原代细胞,该方法避免了长时间多次酶消化对细胞 造成的损伤,在大大减少了杂细胞的同时也最大限 度地使用了卜肌组织块,可以反复多次地从组织块 周围消化下所需的细胞O 对于小~圆~亮的细胞采用 Accutase短时间消化后用改良的 CGM轻柔冲洗 2 ~ -383- 万方数据 3 次 用力较大则会将组织块冲下 其获取细胞的效 率比Tang等[10]报道的D-hanks液冲洗法要高很多 而且Accutase作用较温和 对所得细胞的活性及表 面标志影响均不大 c-kit的阳性率与国外文献报道 的一致[1] 本实验室前期的细胞培养液 CGM中均 加入了 EGF和 DFGF 在本研究的细胞培养中 我们 尝试着使用未加 EGF和 DFGF的改良 CGM 发现细 胞的增殖活力在通常情况下并没有发生明显的改 变 用于培养细胞的培养皿 3 ~6 d即需传代分瓶 之 后的流式细胞术分析鉴定 c-kit的阳性率没有明显 的差异[1] 实验中还有几个关键点:首先是组织块的初次 加液量与贴壁时间的掌握 时间短加液过多均导致 组织块未贴壁好 细胞无法爬出 时间久加液少 培 养液干涸组织块细胞死亡;其次是初次消化细胞时 间的掌握 过短细胞消化不下来 过久会消化下贴壁 较牢的成纤维细胞 致使杂细胞过多 为后续的实验 增加工作量 甚至影响心肌干细胞的增殖分化 由 于所得原代细胞数量较少(若是单用 D-hanks冲洗 所得细胞数量更少) 若直接用磁珠分选细胞 首先 会浪费磁柱的利用率;其次加之操作过程中丢失及 破坏的细胞 最后所得目的细胞已所剩无几 故而 本实验室在取得原代细胞后 先经 3 ~6 d 的增殖后 再进行磁珠分选 得到目的细胞的数量大大增加 总之 本实验室采用组织块贴壁培养法 成功地 获得原代心肌干细胞后 未加 EGF和 DFGF的改良 细胞培养液也成功地运用于心肌干细胞的培养 这 种改良的细胞培养液对干细胞的增殖分化能力及 c-kit的表达未产生明显的影响 但却大大减少了细 胞培养的实验费用 培养获得的心肌干细胞可用于 进一步的研究 以期最终能够解决临床问题 (y z 感谢东南大学附属中大医院心胸外科刘志勇 教授和何伟博士提供的人心肌组织块D) 参 考 文 献 [1] BearziC RotaM hosodaT etai.human cardiacstem ceiis[J].ProcnatiAcad SciUS A 2007 104(35): 14068-14073. 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