木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶的固定方法 摘要：木瓜蛋白酶[ EC 3. 4. 22. 2 ]是一种重要的生化产品，在食品、医药工业中有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域[ 1 ] 。 由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。此研究始于20世纪60年代初, 至今已有许多文献报道[ 2 ] 。酶的固定化方法主要有：包埋法、吸附法、共价键结合法、交联法等,这些方法各有利弊[ 3 ] 。 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 一、木瓜蛋白酶的固定方法 1　包埋法固定 包埋法:将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法。凝胶包埋法是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。 1. 1 　海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶( Immobilized papain on sodium alginate - chitosan,IPSAC) 海藻酸是从褐藻提取的,是甘露糖醛酸以β -1, 4键相连接的多糖类物质,它是包埋酶较为理想的载体,其固定化方法较为简单,条件温和,操作可在室温下进行,酶很少失活。但是,海藻酸钙凝胶在含多价阴离子(磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐等) 的溶液以及高浓度电解质( K+ , Na+ ) 溶液中不稳定,Ca2 +离子易脱落,凝胶变软,甚至溶解。何平等[ 4 ]在研海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶时一方面在制作凝胶时使用Tris盐酸缓冲液,减少Ca2 +子的脱落,保持凝胶的稳定;另一方面首次通过加入壳聚糖粉末来提高凝胶硬度,壳聚糖上的正电荷( - NH+3 )与海藻酸的羧基相互作用,起到稳定凝胶的作用,适用于装柱使用,与不加壳聚糖粉末的固定化酶酶活性相同。在何平等[ 4 ]的研究中, PA与IPSAC的最适pH值均为7. 2,在70℃以下活性稳定;经包埋的PA空间结构没有发生变化,故最适pH值及热稳定性基本没变。IPSAC半衰期为59 d 。海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶( IPSAC) ,其热稳定性好, 半衰期长, 凝胶硬度较高,可用于装柱使用, 便于工厂中自动化生产。 2　吸附法固定 吸附法:利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。吸附法制备固定化酶,操作简便、条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价廉易得,而且可反复使用。由于靠物理吸附作用,结合力较弱,酶与载体结合不牢固、易脱落,所以在实际生产中运用较少,这方面的研究也较少。 2. 1　冷冻- 真空吸附法在介孔材料中固定木瓜蛋白酶 介孔分子筛孔道里组装功能材料的方法有多种, 常见的有气相吸附、浸渍法等, 与普通吸附方法相比, 冷冻- 真空吸附法是一种新的方法, 其优点为: 一是驱动力大, 吸附蛋白量会更大; 二是在低温状态下可保持酶蛋白的活性。高波等[ 6 ]以介孔材料SBA - 15为载体制备固定化木瓜蛋白酶。对固定化酶和溶液酶的特性进行对比,发现木瓜蛋白酶被固定后最适温度由60℃提高到70℃。酶被固定后最适pH值为7. 0, 最适pH值没有改变, 这可能是介孔分子筛SBA - 15的表面电荷性质接近中性所致。取一定量固定化酶和溶液酶, 在30～90℃水浴条件下保温30 min, 迅速冷却至室温后, 再在37℃下测定酶活力。将木瓜蛋白酶组装进分子筛后其热稳定性明显增强, 即使在90℃保温30 min仍保留70%的活力, 而溶液酶在90℃已经失活, 说明酶组装进分子筛后可以提高热稳定性。由于高温不仅可以提高反应速度, 降低细菌的污染几率, 还可以提高底物的溶解度, 从而提高产率, 因此以介孔材料SBA - 15为载体制备的固定化酶所具有良好的热稳定性将更有利于生产应用。 实验结果表明, 在合适的真空度下, 用冷冻-真空吸附法可以制备出组装量高的固定化酶, 而且酶的活性仍然保持良好, 稳定性高,因此冷冻- 真空吸附可以作为一种新方法用于固定酶蛋白。 3　共价偶联法固定 共价偶联法:利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法,也叫共价结合法。共价结合法是目前研究最活跃的固定化方法之一。它的优点在于酶与载体结合牢固,不易脱落,可以连续使用较长时间。但也存在以下缺陷: (1) 在固定化过程中酶分子与载体分子之间发生直接(刚性) 碰撞,易使酶的构象改变,使酶失活; (2) 载体一般是疏水性物质,当酶直接被固定在疏水载体上时会改变酶的微环境,使酶蛋白构象发生折叠、失活; (3) 传统共价结合法得到的固定酶自由度低,酶分子和底物之间存在较大空间位阻,不利于保留酶游离态的均相催化活性。故称之为"刚性固定化"。 共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。这里重点介绍几种比较新的共价偶联法固定木瓜蛋白酶。 3. 1　双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶 针对共价偶联法存在的问题,有人想到了在载体表面接上短链(手臂分子) 进行酶的"手臂固定化"。但由于这种手臂链是分子量较小的短链,而且有些是碳链构成的疏水链,所以在固定化过程中,酶分子仍会受到较大的冲击力,使构象改变而失活。汪海萍、魏荣卿等[ 7 - 8 ]提出"柔性固定化酶"模型,即:在固定化载体上,接上一些有足够长度且是亲水的分子链,即所谓的"柔性链" ,而后再将酶结合到柔性链上,采用以下实现木瓜蛋白酶的柔性固定化,见图1。 采用酶柔性固定化模型,选用壳聚糖、双醛淀粉制得的柔性载体(Chitosan - DAS50) ,对木瓜蛋白酶进行柔性固定化,所得的固定化酶活力回收率达72% ,相当于采用壳聚糖- 戊二醛(Chitosan - GA)手臂载体的3倍,柔性固定化木瓜蛋白酶使用7～8批次后仍保留一半的活力,储存稳定性也远远高于游离酶。 结果表明, "柔性固定化"方法不仅可减少酶在固定化过程中的失活,而且使所得到的固定化酶仍具有游离酶较高的均相催化活性。 图1　柔性固定化木瓜蛋白酶合成路线 3.2　金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶 金属螯合亲和层析( Immobilied metal ion affinitychromatography,简称IMAC) ,是利用金属螯合配体与蛋白质表面的供电子氨基酸- 组氨酸的咪唑基,半胱氨酸的巯醇基等(其中以组氨酸最为重要) 以配位作用紧密结合的原理,从而对蛋白质进行分离、纯化。 金属螯合载体对固定到表面的蛋白质构象影响小,且载体可以重复利用,若将这种技术应用于固定化酶,有望克服目前常用固定化载体和方法的一些不足。 刘琳琳等[ 10 ]以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体,利用金属螯合配体( IDA - Cu2 + ) 与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理,定向固定木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Cu2 + 1. 5 ×10- 2 mol/g 载体、固定化时间4h、固定化pH值7. 0、给酶量30mg/g载体。固定化酶的最适反应温度70℃、最适反应pH值8. 0, 固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶,固定化酶活力回收为68. 4% , 且有较好的操作稳定性,载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶的79. 71% 。 结果表明,在使用金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶时,固定化反应条件温和,对酶的高级结构影响小,酶活回收高;固定化酶的热稳定性明显提高;载体的载酶量大;载体的再生、酶的固定化过程操作简单;固定化酶及载体可多次重复利用,固定化酶生产成本低。因此该技术在工业上具有广泛的应用前景。 3. 3　可溶性固定化木瓜蛋白酶 传统方法制得的不溶性固定化酶具有稳定性好、回收方便等优点,但在面对难溶性、高黏度底物溶液时,应用受到限制,催化效率低下。酶催化效率低下的原因是酶促反应发生在固液两相的非均相反应体系中,造成了酶与底物之间的接触几率远不及均相的游离酶反应体系。因此,提高固定化酶的催化效率的重点应放在改善催化反应体系,制备能够形成均相催化反应体系的固定化酶。 李灵玲等[ 11 ]将木瓜蛋白酶( PP)偶联在羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(As - L )上,制备得到水溶性固定化PP,测定游离和水溶性固定化PP最适作用pH值分别为6. 0, 5. 0,最适作用温度分别为60,70℃, Km 值分别为2. 53, 3. 07 mg·mL;可溶性固定化PP在60℃条件下,保温12 h,仍有62%的活性;在4℃条件下, 30 d后活性保留达90%以上;在pH值为6. 0时稳定性最好, pH值在4. 0～7. 0范围内也较稳定(相对活性> 80% ) 。可溶性固定化PP能够在pH值大于5. 5的溶液中完全溶解,最适作用pH值范围变窄,最适作用温度和Km 值升高;热和酸碱的稳定性均明显增强。 可溶性固定化木瓜蛋白酶兼具游离木瓜蛋白酶高催化活性、难溶性固定化酶高稳定和便于回收的特点,在工业应用上有着广阔的应用前景。 二、木瓜蛋白酶在各个行业的应用 　　1.医药工业应用：含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫 、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 　　2.食品工业应用：可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸。用于水解动植物蛋白、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有利于人体的消化和吸收。 　　3.美容化妆品工业应用：将木瓜蛋白酶加入到含有蛋白质和油脂的化妆品中，具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高产品档次。可制成减肥茶、美容护肤品等。 　　4.日化品工业应用：用于香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等，去污力强，除菌消毒、安全放心。 　　5.饲料工业应用：用于饲料添加剂，开发蛋白源，利于吸收，提高饲料的利用率，节约成本，有助于牲畜消化，加速生长。如在猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鱼、虾等饲料中添加。还可以作为蔬菜水果高级复合肥料的添加剂。 　　6.皮革工业应用：利用木瓜蛋白酶制成脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮效果。 　　纺织工业应用：可用于处理羊毛、蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、抗收缩、抗张强度等效果。 3、 总结与展望 制备固定化木瓜蛋白酶的方法很多,从这些大量的研究可以看出,酶经固定化以后,由于受到载体等因素的影响,其特征会发生某些改变。为此,在固定化酶的应用过程中,必须了解固定化酶与游离酶性质之差别,掌握这些性质对固定化酶的应用有重要意义,以适当调整工艺,使其在最适条件下催化反应。由于研究者的实验等不同,所以很难评价各种固定化方法的优劣。不同方法制备的固定化木瓜蛋白酶适用范围不同,应根据实际需要确定,以便让技术能更好地服务生产。 木瓜蛋白酶经各种方法固定后,稳定性增强、最适温度升高、pH耐受范围增宽、酶活力提高、半衰期延长等,这表明采用的固定化方法正确,应循序渐进,寻找更佳的结果。在现有已取得的研究成果的基础上,如何进一步地提高固定化酶的活性和对底物的亲和力是今后研究的重点。 总结近年来对固定化木瓜蛋白酶的研究进展,可以看到随着技术不断进步,固定化木瓜蛋白酶的催化活性、稳定性等令人满意。固定化酶技术能实现酶的反复利用和原料、产物及酶三者间的有效分离, 从而简化分离工艺及设备, 缩短生产周期, 降低生产成本,固定化酶将成为酶在工业上的重要应用形式。酶固定化技术的日益成熟将使木瓜蛋白酶在食品、饮料、医药、化学试剂、饲料、纺织及化妆品等方面发挥出更加巨大的作用。 参考文献 [ 1 ] Jone J G. 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