HBZ在人类T 淋巴细胞白血病1型病毒（HTLV-1）致癌机制中的作用

HBZ在人类T 淋巴细胞白血病1型病毒（HTLV-1）致癌机制中的作用 现已证实HTLV-1为成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)的致病原。HTLV-1前病毒的反义链编码一个含有碱性亮氨酸拉链结构域（basic region leucine zipper domain，bZIP）的蛋白，将其命名为HBZ（HTLV-1 bZIP factor）蛋白。在HTVL-1的调节及编码基因中，在致病性上起关键作用的有tax和HBZ基因，tax基因有时会因为表观遗传的改变或5’-LTR的缺失而灭活，而HBZ却是唯一一个在所有成人T细胞白血病（ATL）病人样品中都完整稳定表达的基因。HBZ基因通过其 mRNA形式促进ATL细胞的增殖，在体实验还发现，HBZ还可以诱导T细胞淋巴瘤和全身性炎症反应的发生。HBZ主要是通过调节HTLV-1 5’-LTR转录，控制一系列与细胞生长、免疫反应和T细胞分化等相关的细胞信号通路来发挥其作用的。因此，HBZ的多重功能使得它在ATL发病机制中占有极其重要的作用。 关键词：人类T 淋巴细胞白血病1型病毒；成人T细胞白血病发病机制；HBZ；Tax 1、引言 人类T 淋巴细胞白血病1型病毒（HTLV-1）是第一个被发现与人类疾病相关的逆转录病毒。感染该病毒可引起ATL和HTLV-1相关性脊髓炎/热带痉挛性瘫痪（HAM/TSP）等相关疾病[1~2]。HTLV-1与HTLV-2、HTLV-3、HTLV-4；猴T淋巴细胞白血病病毒I型(STLV-1)、STLV-2、STLV-3；牛白血病病毒(BV)等同属于丁型逆转录病毒属[3]。与其它逆转录病毒一样，HTLV-1前病毒基因组含有结构基因gag、pol、env 3个结构基因以及位于两端的长末端重复序列（LTR）（图1[4]），其中位于3’LTR和env之间的pX区是HTLV-1的特有结构，该区域可编码一系列调节基因Tax、Rex、p12、p21、p30、p13和HBZ等[5~6]。在HTLV-1感染细胞中，HBZ是首先被证实与CREB-2(cAMP-response element binding protein-2)互作的一种反义链蛋白[7]。我们发现所有ATL细胞中HBZ基因均有持续表达，它是HTLV-1编码产物中唯一一个不存在无义突变的基因，在前病毒整合前由APOBEC3G诱导产生。同时，HBZ基因还促进了ATL细胞的增殖。因此，HBZ基因在ATL发病机制中占有重要的作用。本文将HTLV-1近年来的研究成果作以综述，并重点讨论HBZ在HTLV-1致癌机制中的作用。 2、HBZ的结构 1989年发现HTLV-1可以通过前病毒基因组负链的形式转录，随后，酵母双杂合系统发现了一种病毒性蛋白可绑定到CREB-2（cAMP-response element binding protein）上，这种蛋白随后命名为HBZ。5’RACE技术发现HBZ基因转录的起始点位于3’LTR的U3和R区之间。在ATL病人样品中，发现5’LTR常常缺失或甲基化，而3’LTR则相反，不仅不会缺失并保持未甲基化，这或许与所有 ATL病人样品中均能检测到HBZ的表达有关。HBZ基因被证实有两种形式的转录产物，拼接型(sHBZ)和未拼接型(usHBZ)，这两种HBZ转录的启动子都是由无TATA框启动子，起始子及下游启动子等元件构成。对sHBZ基因启动子的进一步研究表明，Sp1是转录的关键位点。位于HTLV-1前病毒基因两端LTR内的U3区都含有Tax应答元件(TRE)，是HTLV-1病毒转录的增强子。Tax 和CREB 可以通过3’LTR增强HBZ基因的转录，Tax还可以通过结合位点来调节反义启动子的活性，但Tax对3’LTR的激活能力要弱于其对HTLV-1正链的转录。 sHBZ和usHBZ分别由206和209个氨基酸残基组成，HBZ蛋白的这两种形式都同样包含三个结构域：N-末端激活结构域（AD)，中央结构域（CD）和C-末端的碱性亮氨酸拉链结构域(bZIP）。HBZ的AD结构域含有两个LxxLL基序，该基序是p300/CBP的重要结合位点。HBZ蛋白以斑点型定位于核内，已证实三个核定位信号有两个区定位于CD和bZIP结构域内，核散斑的聚集重要要素即蛋白序列的完整性。HBZ特异性定位于核的染色质上，却并未与之直接绑定。（The HBZ protein is localized in the nucleus with a speckled pattern. Three nuclear localization signals (NLSs)were identified to two regions in theCD of HBZ and a basic region of the bZIP domain (Hivin et al., 2005). Moreover, the integrity of HBZ protein sequence was necessary for its accumulation in nuclear speckles. HBZ specifically distributed in the nucleus to heterochromatin, while it is not associated with heterochromatin (Hivin et al., 2005). ） sHBZ和usHBZ这两种蛋白形式的唯一区别在于它们N-末端的7个氨基酸残基，但这直接导致了两种蛋白的显著性差异。usHBZ蛋白的半衰期要更短于sHBZ，在所有ATL细胞中，只能检测到sHBZ。因此，sHBZ基因比usHBZ基因占有更重要的作用。 3、 HBZ基因的转录 HTLV-1病毒感染的特征即该病毒基因可以进行转录，而在所有的转录活动中，tax基因由于其多重功能被认为在白血病发病机制中起到了重要作用。但是，研究发现ATL病例样品中大约有60%丧失了Tax的表达，这可能是因为HTLV-1基因5’LTR的缺失或甲基化，导致正链转录难以进行，也可能因为tax基因自身发生无义突变、缺失、插入等。Tax的缺失常发生在癌基化进程中，这表明Tax的表达对于ATL来说可能并非必要。不同于5’LTR的3’LTR，它不会缺失并保持未甲基化，而所有 ATL和HTLV-1感染者病例样本中均检测到持续表达的HBZ基因，并且该基因以前病毒形式表达。还有报道证实，HBZ除引起ATL外，还可以导致HTLV-1相关性脊髓炎/热带痉挛性瘫痪（HAM/TSP）等相关疾病。 ATL细胞中HBZ基因两种形式的表达量并不相等，在ATL和HTLV-1感染者病例样本中检测到sHBZ基因表达量是usHBZ的四倍。 HTLV-1感染兔后，其外周血单核细胞内tax基因的表达量迅速增高到最大量，随后逐渐降低直至稳定到低水平，而HBZ基因在感染后先处于低水平，而后逐渐增大直至稳定。感染8周后解剖，HBZ基因的mRNA含量在所有检测的mRNA浓度最高。有研究发现，HTLV-1感染细胞里HBZ mRNA和HBZ蛋白含量并不一致，表明不同细胞类型的HBZ基因前转录调节方式不同。也有研究称HBZ mRNA和HBZ蛋白在感染细胞里始终保持高表达。HBZ还可调节细胞内信号转导，促进T细胞分化。这两个研究成果的差异可能是因为不同的实验条件和不同的HBZ抗体所产生的。 4、HBZ的生物学功能 4.1 Tax介导的病毒转录抑制 HBZ是首先被证实可与CREB-2绑定并从5’LTR开始抑制HTLV-1转录的蛋白。进一步研究发现，CREB-2/CREB直接与HBZ蛋白bZIP结构域结合，而HTLV-1 5’LTR内的TRE以及细胞内启动子上的CRE也可与CREB-2/CREB结合，后者阻止了前者的结合，最终抑制了从5’LTR起始Tax介导的转录。另外，Tax从5’LTR的转录还可以抑制HBZ与CBP/p300辅激活因子的结合。HBZ-AD结构域里的两个LxxLL基序与CBP/p300 KIX结构域结合后阻止了CBP/p300结合到HTLV-1启动子上。进一步研究发现HBZ-AD是与KIX结构域上的MLL模序结合。 4.2 ATL细胞的增殖 研究发现，HBZ的稳定表达维持了Kit 225细胞的生长，运用siRNA方法将HBZ基因沉默后，ATL感染细胞MT-1和TL-Om1的增殖能力显著下降，表明HBZ的持续表达在ATL发病机制中有着重要的意义。通过细胞转染方法使T细胞系表达HBZ基因后发现，HBZ通过其mRNA方式促进了T细胞的增殖，且抑制了Tax介导的病毒转录。HBZ基因突变实验表明HBZ RNA通过形成二级茎环结构促进细胞增殖，还可激活E2F1及其靶基因的转录，促进G1/S期转变。 sHBZ可诱导ATL细胞增殖，而usHBZ则没有此功能，这表明sHBZ第一个外显子的转录对于此功能尤为重要。HBZ第一个外显子与HTLV-1 3’LTR上的Rex应答元件RxRE相对应，而已有实验表明Rex促进了病毒RNA的输出。于是我们推测，sHBZ RNA不同于usHBZ RNA可形成茎环结构，由此促进ATL细胞的增殖。 ATF3，一种HBZ绑定蛋白，可以在ATL细胞内高表达，它的表达对于ATL细胞的增殖与存活具有正反两方面影响。而HBZ可以削弱ATF3的负面影响，增强其促增殖能力，实验发现ATF3可下调CDC2及周期蛋白E2的表达，促进ATL细胞的增殖。 4.3 调控AP-1(Activator protein-1)信号通路 早前研究发现bZIP蛋白间的相互作用可影响它们的细胞内定位及转录活性，AP-1是一种包含Fos家族(c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2)和Jun家族(c-Jun, JunB, JunD)的bZIP蛋白杂合二聚体转录复合物。HBZ与c-Jun/JunB结合后解除后者DNA结合力，抑制c-Jun/JunB介导的信号通路。HBZ通过蛋白酶体介导方式诱导c-Jun蛋白降解，然而这种途径并不依赖于泛素化。另外，HBZ通过捕获c-Jun核内抗体来抑制AP-1信号通路。与此相反的是，HBZ可以通过形成JunD异二聚体方式激活JunD介导的转录，HBZ/JunD异二聚体可与Sp1转录因子相互作用，增加端粒酶逆转录酶（hTERT）的转录活性。端粒酶活性被认为与肿瘤恶性程度密切相关，因此被HBZ增加活性的hTERT在ATL发病机制中起到了重要作用。 4.4 抑制经典NF-κB 信号通路 在ATL细胞中，Tax介导的核转录因子NF-κB 的激活在ATL细胞增殖与HTLV-1转化活性中至关重要。Tax可激活NF-κB 经典及选择性两种通路，而HBZ却只能选择性抑制由p65介导的NF-κB 经典通路而非选择性通路。这种选择性抑制与两种机制有关，一种是HBZ通过与p65直接结合的方式抑制p65绑定于DNA的能力，另一种是HBZ增加了以p65为目标的一种E3泛素连接酶PDLIM2的表达，增加了p65的泛素化降解。HBZ的激活能力以及bZIP结构域都与这种选择性抑制能力直接相关，HBZ选择性抑制了NF-κB 经典通路或许证明了另一条选择性信号通路在ATL发病机制中占主导地位。PDLIM2被报道可以引导Tax定位于核基质发生蛋白酶体的降解从而抑制了Tax介导的肿瘤发生，而HBZ可以激活PDLIM2，这或许解释了ATL细胞内Tax的部分缺失。最新研究表明HBZ还可抑制p65的乙酰化，这或许与HBZ抑制p65介导的NF-κB 经典通路机制相关。 研究显示许多先天性免疫和炎症反应的分子都与经典NF-κB通路有关，在不同的病毒里，抑制NF-κB通路的情况很常见，表明这些分子活性在病毒的存活与感染方面具有重要作用。HTLV-1可能通过HBZ抑制经典NF-κB通路逃脱宿主免疫反应。 4.5 增强TGF-β信号促进Treg细胞分化 成人白血病T细胞与自然调节性T（Treg）细胞一样具有CD4+CD25+表型，2/3的ATL病例中发现有FoxP3的表达，表明感染HTLV-1病毒后的ATL细胞可能起源于Treg细胞。最近我们发现，转基因表达HBZ可以增加Treg细胞FoxP3和效应记忆T细胞的表达，导致T细胞淋巴瘤和全身性炎症反应的发生。TGF-β 信号被认为在Treg细胞成熟分化中起到重要作用，我们的研究表明HBZ可以依赖p300方式增强TGF-β信号。HBZ、Smad3和p300形成一个三元复合体，后二者的结合可以增强HBZ的存在。HBZ可以克服Tax在TGF-β通路上的抑制效从而增强TGF-β信号，导致Treg细胞内Foxp3表达量下调，这或许可以解释在体实验中发现感染HTLV-1后，Treg细胞的数量增加。有趣的是，HBZ甚至在缺失TGF-β时仍然可以维持细胞生长，并且并不影响细胞周期及增殖相关基因的表达，这表明HBZ选择性调控TGF-β/Smad信号通路。通过增强TGF-β通路和Foxp3表达，HBZ帮助HTLV-1将感染后T细胞转变为Treg细胞，这对于病毒持续感染能力非常关键。 4.6 HBZ的致病功能 Tax被认为是癌蛋白，因为它可使初级T细胞永生化，并使HTLV-1感染细胞具有无限增殖能力。尽管如此，仅40%左右ATL细胞可检测到Tax基因。在Tax转基因鼠中，癌症被使用的启动子诱发，为更好的理解HBZ的致病功能，我们将HBZ基因克隆于鼠CD4启动子和增强子下，HBZ转基因鼠(HBZ-Tg)的表型及免疫特点和ATL病人相似。HBZ转基因鼠脾细胞总数中，CD4+ T细胞百分比有所上升。另外，HBZ还可促进胸腺细胞的增殖，超过三分之一的HBZ-Tg鼠在经过长期潜伏期后，发生T细胞淋巴瘤。为研究可能的分子机制，我们分析了T细胞的表型和功能，并且发现CD4+Foxp3+ Treg细胞和效应记忆CD4+ T细胞的增加。HBZ-Tg鼠中Foxp3+细胞占高百分比，这种情况也存在于人ATL病例的淋巴瘤组织中。但HBZ-Tg鼠中增加的CD4+Foxp3+ Treg细胞发生了功能性缺失，由于HBZ可以与Foxp3和NFAT相结合，因此削弱了Treg细胞的抑制功能。另外，大多数HBZ-Tg鼠皮肤和肺发生免疫损伤，CD3+CD4+T细胞还浸润至表皮和真皮层。这些发现与人ATL病例类似。 4.7 T细胞介导的免疫损伤 病毒可逃避宿主免疫攻击，有利于病毒的复制和扩散。HTLV-1的复杂感染由机会感染引起，其引起的免疫缺陷是未知的。最近我们发现HBZ-Tg鼠比对照鼠更容易感染2型单纯疱疹病毒（HSV-2）和单核细胞增多性李斯特氏菌(LM)，并且HBZ-Tg鼠可抑制Th1细胞因子例如IFN-γ、IL-2及TNF-α等生成，而ATL病例初级CD4 T细胞中也检测到IFN-γ的减少，证明HBZ可以通过抑制NFAT和AP-1信号通路来抑制IFN-γ启动子的活性。首次证实了HBZ可以抑制CD4 T细胞应答，导致宿主免疫功能的削弱。 5、 TAX和HBZ两种蛋白之间的联系 越来越多的研究表明Tax和HBZ是影响ATL发病的两个重要蛋白，两者之间的交叉与联系相关研究显得尤为重要。Tax可转化鼠细胞并使初级T细胞永生化，还可增强病毒复制，促进细胞增殖，抑制凋亡，削弱细胞周期检验点，诱导DNA损伤等功能。虽然Tax具有上述多种功能，但大约60%ATL病例中检测到Tax的缺失。另外，一些流产abortive基因变化，例如缺失、插入及无义突变等，在所有病毒基因（包括tax基因）中时有发生，在无症状携带者前病毒中同样检测到tax基因的无义突变。与tax基因相反的是，HBZ总是在所有ATL细胞全部发育时期中持续表达并保持完整性。在T淋巴细胞永生化中，Tax起到了关键性作用，而HBZ却是非必要的。在体实验发现，细胞毒性T淋巴细胞(CTLs）的主要靶点也是Tax而非HBZ，但HBZ促进了T细胞增殖，导致了淋巴癌和急性炎症，这些现象与HTLV-1感染人病例中相似，我们认为HBZ在维持HTLV-1诱导的转化过程中起到了重要作用。 令人感兴趣的是，Tax和HBZ在调节细胞内信号通路上有反作用。Tax激活5’LTR转录，增强AP-1和经典NF-κB 信号，抑制TGF-β信号，而HBZ却抑制Tax介导的病毒转录，抑制激活的AP-1和经典NF-κB 信号，增强TGF-β信号。HTLV-1可能正是选择性利用Tax和HBZ这种互补效应中的有利点，以逃避宿主的免疫监控。 5、 逆转录病毒的反义转录 现已被证实的HTLV有四种类型，它们的致癌特性皆不相同。HTLV-1主要感染CD4+T细胞，而HTLV-2主要靶向CD8+T细胞，且极少数案例发现可诱发癌症。不同于Tax1的是，由HTLV-2编码的Tax2蛋白不含PDZ结构域结合基序（PBM），而PBM与转化活性直接相关，这或许导致了HTLV-1与HTLV-2不同的致病能力。据报道HTLV-2可产生一种反义转录蛋白命名为APH-2，APH-2的mRNA与sHBZ基因一样，都是从3’LTR开始转录，拼接和多聚腺苷酸化。APH-2并不含有bZIP结构域，但仍可以与CREB结合从而抑制依赖Tax2的LTR的激活。除此之外，不论是非T细胞还是T细胞，APH-2都定位于核内非核仁区。更为重要的是，APH-2与病毒载量相关，并不会促进细胞增殖和淋巴细胞的增多。 最近的研究表明HTLV-3和HTLV-4都可以产生拼接和多聚腺苷酸化的反义转录，这两种蛋白分别命名为APH-3和APH-4，并且都缺乏bZIP结构域，但它们仍保有抑制依赖Tax蛋白LTR活性的能力，该研究还表明，APH-4仅定位于细胞核，而APH-3却在细胞质和核都有分布。 在HIV-1感染的细胞株中，证实了反义RNA的存在，该RNA可编码一种相对分子量为19kDa的ASP，同时在HIV阳性患者中也检测到该蛋白，但该蛋白的分子机制尚不明确。 6、 展望 自从HTLV-1被发现后，关于该病毒复制及细胞转化特点，特别是ATL的发生等方面进行了大量的研究，然而HTLV-1病毒确切的致病机制仍不明确。近来对HBZ基因的关注成为该机制研究的新热点，HBZ是唯一在所有成人T细胞白血病（ATL）病人样品中都完整稳定表达的病毒基因，而其它病毒基因可能在前病毒整合前发生无义突变。更重要的是，当Tax沉默时HBZ还可维持细胞的存活，这些数据都表明HBZ蛋白在HTLV-1致癌机制中占有极其重要的地位。HBZ在癌基化中的功能，以及在目前已知的HTLV-1分子机制基础上，探索靶向HBZ的ATL新治疗法将是未来研究的方向。