脑蛋白水解物溶液（供注射用）质量标准

附件 2： 脑蛋白水解物溶液（供注射用） Naodanbai Shuijiewu Rongye Cerebroprotein Hydrolysate 本品系自健康猪脑经酶水解得到的溶液。每 1 ml 中含总氮（N）不得低于 5.49mg；含 总氨基酸（以氮计）应为总氮的 85％～100％，含肽（以氮计）应不低于总氮的 20％。 【制法要求】 见附一。 【性状】 本品为浅黄色澄清液体。 【鉴别】 （1）取本品 2ml，加双缩脲试液（取硫酸铜 0.75g 和酒石酸钾钠 3.0g，加 水 250ml 使溶解，在搅拌下加入 10%氢氧化钠溶液 150ml，加水至 500ml）4ml，应显紫红 色。 （2）在肽含量测定项下记录的游离氨基酸色谱图中，供试品溶液色谱图中各氨基酸峰 的保留时间应与相应对照品峰的保留时间一致。 （3）取本品适量，加水制成约含总氮 6mg 的溶液，作为供试品溶液，另精密称取脑蛋 白水解物对照品适量，加水溶解并稀释制成每 1ml 中约含总氮 6mg 的溶液，作为对照品溶 液。照高效液相色谱法（中国药典 2010 年版二部附录 V D）测定。以十八烷基硅烷键合硅 胶为填充剂（如：柱长 250mm，内径 4mm，粒径 5μm）；以 0.1%三氟醋酸溶液为流动相 A； 以 0.085％三氟醋酸乙腈溶液-0.1%三氟醋酸溶液（80:20）为流动相 B，按下表进行梯度洗 脱；流速为每分钟 0.8ml；检测波长为 276nm。 时间（分钟） 流动相 A（%） 流动相 B（%） 0 100 0 40 50 50 45 0 100 53 0 100 55 100 0 65 100 0 精密量取供试品溶液与对照品溶液各 20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按中 药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品溶液的色谱图与对照品溶液色谱图的相似度 （扣除色氨酸峰后）不得低于 0.9。 【检查】 pH 值 应为 6.5～7.5（中国药典 2010 年版二部附录Ⅵ H）。 蛋白质 取本品 5ml，加 20%磺基水杨酸溶液 2ml，混匀，溶液不得出现浑浊。 高分子杂质 照分子排阻色谱法（中国药典 2010 年版二部附录 V H）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用亲水高效体积排阻硅胶为填充剂（如： TSK GEL 2000SWxl，柱长 300mm，内径 7.8mm，粒径 5μm；或性能相当的色谱柱）；以三氟乙酸- 乙腈-水（0.05：40：60）为流动相，流速为每分钟 0.7ml；检测波长为 214nm。理论板数按 核糖核酸酶 A 峰计算不得低于 5000，各相邻峰之间的分离度按峰高与峰谷之比计算均不得 小于 3.0。 标准曲线的制备 取核糖核酸酶 A(分子量 13700)、胰岛素(分子量 5808)、胸腺肽 α1(分 子量 3108)、生长激素释放抑制因子(分子量 1638)各适量，分别用流动相溶解并定量制成每 1ml 中约含 1mg 的溶液作为分子量标准溶液。取上述标准溶液各 20μl，分别注入液相色谱 仪，记录色谱图，重复进样的保留时间相对偏差不得大于 2.0%。以各峰的保留时间为横坐 标，分子量对数为纵坐标进行线性回归，相关系数不得小于 0.99。 测定法 取本品适量，加流动相稀释制成每 1ml 中约含总氮 1mg 的溶液，取 20μl 注入 液相色谱仪，记录色谱图。以面积归一化法计算，供试品溶液色谱图中分子量大于 5000 道 尔顿的高分子杂质的峰面积不得过 1.0%。 活力测定 取本品适量，加 10%小牛血清培养液制成每 1ml 中含氮量为 60µg 的溶液。 照活力测定法（见附 2）测定，修复率不得低于 100%。 细菌内毒素 取本品，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录Ⅺ E），每 1ml 中含内 毒素的量应小于 1.0EU。 微生物限度 取本品至少 200ml(待定)，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 XI J），本品 1ml 中细菌总数不得过 100cfu（待定）。 【含量测定】 总氮 取本品适量，稀释至适宜浓度，作为供试品溶液，精密量取适量， 依法测定（中国药典 2010 年版二部附录 VII D 第二法）。 总氨基酸 取总氮测定项下供试品溶液，精密量取适量，置消化管中，加盐酸适量，充 氮封口，置 110℃水解 20 小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸发至干，加水使残留物 溶解并稀释至合适浓度，作为总氨基酸供试品溶液。用氨基酸仪或适宜的高效液相色谱 仪进行测定。另取相应的氨基酸对照品（见下表），精密称定并稀释制成合适浓度，作为对 照品溶液，同法测定。按外标法或以合适的氨基酸为内标以峰面积计算各氨基酸含量（以氮 计，色氨酸除外）。 氨基酸对照品 门冬氨酸(C4H7NO4) 甘氨酸(C2H5NO2) 缬氨酸(C5H11NO2) 苯丙氨酸(C9H11NO2) 谷氨酸(C5H9NO4) 苏氨酸(C4H9NO3) 甲硫氨酸(C5H11NO2S) 亮氨酸(C6H13NO2) 丝氨酸(C3H7NO3) 丙氨酸(C3H7NO2) 色氨酸(C11H12N2O2) 赖氨酸(C8H714N2O2) 组氨酸(C6H9N3O2) 精氨酸(C6H14N4O2) 异亮氨酸(C6H13NO2) 脯氨酸(C5H9NO2) 肽 取总氮测定项下供试品溶液，精密量取适量，加水稀释至合适浓度，作为游离氨基 酸供试品溶液，用氨基酸分析仪或适宜的高效液相色谱仪进行测定。另取总氨基酸项下对照 品溶液，同法测定。按外标法或以合适的氨基酸为内标以峰面积计算游离氨基酸含量（以氮 计，色氨酸除外），以总氨基酸减去游离氨基酸并计算其在总氮中的含量。 【类别】 同脑蛋白水解物。 【贮藏】 密闭，在低温处保存。 【制剂】 （1）注射用脑蛋白水解物 （2）脑蛋白水解物注射液 （3）脑蛋白水解物氯 化钠注射液 附 1： 猪脑蛋白水解物溶液（供注射用）基本制法及要求 基本制法（具体以国家食品药品监督管理局批准件为准）： 制法基本要求： 1、本品生产应有完善的原辅料和中间品质控，应采用检疫合格的猪脑和药用 级的酶水解。 2、本品为动物来源，应有有效去除病毒或病毒灭活的方法和措施。 3、本品生产过程中不得非法添加非水解产物如各种氨基酸。 4、本品生产、贮运过程中应有有效防止变质的条件和措施。 5、本品生产均应符合现行版《药品生产质量管理规范》的要求。 附 2： 活力测定法 本法系通过损伤 PC12 细胞后加入本品，采用 MTT 法测定细胞修复率作为活力测定指 标。 试剂 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3） 取氯化钠 8.0g、氯化钾 0.2g、无水磷酸氢二 钠 1.15g 及磷酸二氢钾 0.2g，加超纯水 1000ml 溶解后，湿热灭菌（中国药典 2010 年版二部 附录ⅩⅦ）。 10%小牛血清培养液 取 RPMI－1640 培养液 90ml，加已灭活的新生小牛血清 10ml。 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液 取胰蛋白酶 0.25g 及乙二胺四醋酸二钠 0.02g，加 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 100ml 溶解后，用 5.6%碳酸氢钠溶液调节 pH 值至 7.2， 滤过除菌（滤膜孔径为 0.22μm），-20℃保存。 0.5mmol/L 过氧化氢溶液 取过氧化氢浓溶液 1.0ml 加水稀释至 100ml，再取 28.3µl 加 10%小牛血清培养液稀释至 5.0ml。 噻唑蓝（MTT）溶液 取 MTT50mg，加 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3）10ml 溶解 后，滤过除菌（滤膜孔径为 0.22μm），2～8℃保存，使用不超过两周。 测定法 用 10%小牛血清培养液培养 3～8 代的 PC12 细胞至对数增长期，用 0.25%胰 蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加 10%小牛血清培养液稀释至每 1ml 中含（0.8～1.2） ×10 5个细胞，将上述细胞混悬液在 96 孔细胞培养板上铺板，每孔 100µl，以 10%小牛血清 培养液 100µl 作为空白对照组，置 37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养 24 小时。供试 品组，每孔加供试品溶液 100µl，正常细胞组、损伤细胞组、空白对照组每孔分别加 10%小 牛血清培养液 100µl，每组设 3 个复孔。置 37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养 24 小 时。供试品组、损伤细胞组分别加入 0.5mmol/L 过氧化氢溶液 50µl，剩余孔加入 10%小牛 血清培养液 50µl，置 37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养 48 小时。结束培养前 4 小 时取出培养板，吸去培养液，每孔加入 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3）洗一次，然后再 在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液（pH7.3）100µl 和 MTT 溶液 20µl，继续培养。培养结束后， 吸出培养液，每孔加入二甲基亚砜 100µl，摇匀，放置 5 分钟后，在酶标仪上以 550 nm 的 波长处分别测定其吸光度 A 值。 修复率％= Ag-As Az-As ×100% 式中 Ag 为供试品组平均吸光度－空白对照组平均吸光度； As 为损伤细胞组平均吸光度－空白对照组平均吸光度； Az 为正常细胞组平均吸光度－空白对照组平均吸光度。 附 3 ： 猪脑质量标准草案 本品系采集自法定兽医检疫部门检疫合格的健康家猪的脑部组织，用于脑蛋白水解物生 产。 形状 肉眼观察，猪脑特征明显，鲜品猪脑形态基本完整，呈球状固体外观，血管及沟、 回组织纹理清晰可辨，不得有病变、模糊、液化现象。 色泽 肉眼观察，应色泽鲜明，具备新鲜脏器特征，血管鲜红，皮层、灰质髓质呈白色 灰夹，不得有全部灰色、无血色或任何发黑、发黄现象。 气味 具新鲜血腥味，无臭味或异味。 纯度 不得夹杂其他脏器组织或异物，3000RPM 离心 5 分钟产生可倾液体不得过固形 物重量的 10％(冷冻经解冻后)。 新鲜度 取脑组织适量，用适宜的挥发性盐基氮自动分析仪器或用半微量定氮法（附录） 检测，挥发性盐基氮不得过 0.3mg/g。 包装 离体 4 小时内收集，置于干净食品级塑料袋，每个独立包装不得超过 10kg。 贮存 置 0℃以下贮存并尽快使用；长期应存放于－10℃以下，贮存期不得超过 6个月。 运输 具有贮存条件的运输车。 附 4： 附录 半微量定氮法 1.1 原理 挥发性盐基氮是指动物组织由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生 氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸发出后，用标准酸滴定， 计算含量。 1.2 试剂 1%氧化镁混悬液 称取 1.0g 氧化镁，加 100ml 水，振摇成混悬液。 吸收液 2%硼酸溶液。 甲基红指示液 0.2%乙醇溶液。 次甲基蓝指示液 0.1%溶液。 临用时将上述两种指示液等量混合为混合指示液。 0. 0100Ｎ盐酸标准溶液或硫酸标准溶液。 1.3 仪器 半微量定氮器。 微量滴定管：最小分度 0.01ml。 1.4 操作方法 取猪脑组织适量，切碎搅匀，称取适量（W），置于锥形瓶中，加 100ml 水，不时振摇， 浸渍 30min 后离心，上清液量积后置冰箱备用，为样品液。 预先将盛有 10ml 吸收液并加有 5～6 滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端 插入锥形瓶内吸收液的液面下，吸收 5.0ml 上述样品液于蒸馏器反应室内，加 5ml 1%氧化 镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸气，待蒸气布满蒸馏器内时即关闭蒸气出口 管，由冷凝管出现第一滴冷凝水开始计时，蒸馏 5 分钟即停 止，吸收液用 0.0100Ｎ标准酸 溶液滴定，终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。 1.5 计算 Ｘ1=（Ｖ1-Ｖ2）×Ｎ1×Ｖ3/（W×5ml） 式中 Ｘ1 为样品中挥发性盐基氮的含量，㎎/Kg; Ｖ1 为测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，ml； Ｖ2 为试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，ml; Ｖ3 为浸渍上清液体积，ml; Ｎ1 为盐酸或硫酸标准溶液 1 毫升相当氮的毫克数； W 为样品质量。