麻疹病毒分子流行病学监测

麻疹病毒分子流行病学监测 了解2006年河北省流行的麻疹病毒基因型特征。方法 对2006年分离的30株麻疹野病毒进行分子流行病学研究。结果 30株麻疹野病毒均为H1a基因亚型，其核蛋白（N）基因碳末端456个核苷酸同源性为99.7%～98.0%之间，氨基酸同源性为96.0%～100%之间；与S191株核苷酸同源性为91.4%～92.3%之间，氨基酸同源性在86.7%～89.4%之间。2006年分离到的30株麻疹病毒存在3个分支（传播链）。结论 H1a基因亚型为2006年河北省优势流行基因型，H1b基因亚型可能已经终止，麻疹野病毒与现行疫苗株S191之间变异仍在加大。 麻疹是由麻疹病毒引起的一种传染性非常高的急性发热出疹性呼吸道传染病。尽管麻疹疫苗推广应用多年，麻疹发病率下降明显，但在疫苗可预防的传染病中，麻疹的发病数和死亡数仍居首位[1]。为弄清麻疹病毒遗传物质的变化情况，在以往的分子流行病学研究基础上，2006年继续在河北省开展麻疹病毒分子流行病学监测。现将结果分析如下。 1 材料和方法 1.1 标本来源 由全省各市疾病预防控制中心（CDC）采集麻疹疑似患者的咽拭子标本，省CDC麻疹实验室提供标本采集用品，标本保存在含5%牛血清、终浓度2000U/ml青霉素、200µg/ml链霉素和25U/ml制霉菌素的DEME病毒运输液中。低温条件下运输标本，-70℃保存标本。 麻疹病毒分离和初步鉴定 采用vero-slam细胞，当细胞长成单层或85%覆盖底面时接种标本，吸附1.5hr后，弃上清，换维持液37℃培养。每代培养7～8d，细胞病变（cytopathic effect，CPE）达85%以上时收获，再扩毒。对出现CPE的毒株使用麻疹单克隆抗体中和试验进行初步鉴定。 1.3 麻疹病毒再鉴定和序列测定 由中国CDC病毒病预防控制所国家麻疹实验室采用Trizol法提取病毒悬液中的病毒RNA，采用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）对病毒RNA进行扩增，扩增后的产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增后的PCR产物用QIA PCR purification kit试剂盒纯化，纯化后的产物再Perkin Elmer公司ABI3100测序仪上，自动完成序列测定和校对分析。 1.4 序列分析 调出我国1993-2004年分离的部分麻疹病毒代表株、世界卫生组织（WHO）疫苗参考株、中国麻疹疫苗沪191（S191）株N基因碳末端456个核苷酸序列，使用BioEdit 7.0、MEGA3.0软件对这些参考株和2006年河北省分离到的30株麻疹野毒株N基因碳末端的456bp序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析和基因亲缘性关系分析。 2 结果 2.1 麻疹病毒分离和鉴定 2006年河北省麻疹实验室共收到麻疹疑似患者咽拭子标本167份，标本接种到vero-slam细胞后，有31份发生细胞融合病变，经中和鉴定共分离到30株麻疹野病毒株。将31株毒株送往国家麻疹实验室，经RT-PCR和凝胶电泳再鉴定，结果同样是30株麻疹病毒株，1株为其他病毒。30株麻疹病毒分别来自全省8个市的16个县区，其中以承德市分布最多。30株麻疹病毒在各市县的分布见表1。 2.2 麻疹病毒的命名 分离到的30株麻疹病毒经核苷酸序列测定和分析，基因型均为H1a亚型，30株麻疹病毒的统一编号和标准命名见表2。 2.3 基因亲缘性关系和病毒流行特点分析 将30株麻疹病毒N基因碳末端456bp的序列与我国H1参考株、WHO疫苗参考株和S191株的对应序列做基因亲缘性关系分析（图1）。2006年河北省分离到的30株麻疹病毒分成3个亚支，均为H1a基因亚型。 上部的第一个分支中，主流麻疹病毒株Hebei06-4、Hebei06-5、Hebei06-14、Hebei06-16和Hebei06-18同为隆化县的毒株，与双滦区的Hebei06-13、Hebei06-19、Hebei06-20和滦平县的Hebei06-12均为承德市本地流行的麻疹毒株，为同一传播链引起的病毒循环，病毒传播从时间上可划分为一、二、三代病例，与河北省南部邢台县的Hebei06-7和Hebei06-8毒株也为同一传播链；这些毒株与沧州市青县Hebei06-1和Hebei06-6毒株和邢台市临城县Hebei06-9和Hebei06-10毒株以及承德市围场县Hebei06-26、隆化县hebei06-27毒株虽也属于第一分支中的，但它们又与承德市本地主流行株明显不同，为同一传播链中的细分支，为派生的传播链。沧州市青县2株hebei06-1和hebei06-6和邢台市临城2株hebei06-9和hebei06-10分别为本县同一传播链引起的流行。 在图1H1a的下部有7个毒株构成的另一个分支，在承德市隆化（hebei06-11、hebei06-15）、平泉（hebei06-17）、承德县（hebei06-21）和秦皇岛市昌黎（hebei06-23）、山海关区（hebei06-22）、青龙（hebei06-24）各县引起暴发或流行，属于同一传播链引起的暴发或流行。 第3个分支为位于H1a中间的Hebei06-25（邯郸丛台区）、Hebei06-2和Hebei06-3（唐山市滦南县）、以及Hebei06-29（张家口市宣化区）这4株病毒，虽分布在河北省西、东、南部，亲缘关系较近，但又各不相同。另外，Hebei06-28（承德市隆化县）毒株与承德市流行的2个主分支亲缘关系相差较大，可能为外来毒株。 2.4 核苷酸和氨基酸变异分析 将2006年我省分离的30株麻疹毒株与WHO疫苗参考株、S191株、长春-47株和我国1993-2004年我国部分参考株进行核苷酸和氨基酸同源性分析（表3）。2006年河北省分离的麻疹毒株之间核苷酸同源性在99.7%～98.0%之间，氨基酸同源性为96.0%～100%之间。与S191株之间的核苷酸同源性为91.4%～92.3%之间，氨基酸同源性在86.7%～89.4%之间。与安徽2001年和2002年流行的毒株之间同源性最近，与Anhui01-1和Chin9322之间核苷酸同源性均在98.9%以上，与Anhui02-1之间核苷酸同源性在98.2%以上。 Hebei06-5与Hebei06-30，Hebei06-11和Hebei06-22与Anhui01-1之间氨基酸同源性为100%。2006年河北省分离到的毒株与A基因型（即与S191株）的麻疹毒株核苷酸之间最大差异，最大差异为8.6%；氨基酸最大差异（即与S191株之间）为13.3%（100%～86.7%）【7】。 3 讨论 通过开展麻疹病毒分子流行病学研究，对分析麻疹病毒的基因变异、传播途径、区分疫苗株和野毒株，以及制定区域性消除麻疹都有重要意义。1994-2005年，河北省共分离到26株麻疹病毒，流行的麻疹病毒也经历了由H1c基因亚型转为H1a和H1b混合流行[8]，H1a基因亚型为优势流行株，H1b基因亚型为弱势流行株的趋势。2006年分离到的30株麻疹病毒分别来自该省8个市16个县区，较广泛的分布在全省东、南、西、北各地。2006年对麻疹病毒分子流行病学监测研究表明，H1a基因亚型仍为目前河北省麻疹病毒的优势流行株，仍未发现H1c基因亚型；同时，2006年在2004-2005年H1b株的流行地分离到的麻疹病毒也未发现H1b株，表明，H1b株的流行可能已经终止。 麻疹病毒基因亲缘关系分析表明，2006年河北省分离到30株麻疹病毒分别存在于3个分支，由亲缘关系较近的麻疹病毒传播引起的流行既可在相邻或相近的地区，也可以分布在相互之间较远的地区；在同一地区还存在不同的传播链，比如承德市就存在2个传播链。 2006年河北省流行的麻疹病毒与我国代表株Chin9353、Anhui01-1和Anhui02-1之间亲缘关系最近，可以推测麻疹病毒株在各省之间存在连续循环和传播。这些野毒株与目前使用的麻疹疫苗S191株之间的最大差异为8.6%，氨基酸最大差异为13.3%，这个差异超过以往发现的毒株与S191株之间的差异（最大12%）[7]，表明麻疹野毒株与疫苗株之间的差异可能还在加大。