国家自然基金成功申请范本

国家自然基金成功申请范本1 (一)立项依据与研究内容 1．项目的立项依据 心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，现认为其与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。心肌纤维化是一种连续变化的过程，根据有无心肌细胞缺失、坏死和瘢痕形成可分为反应性纤维化和修复性纤维化，前者根据病变特点又分为间质纤维化和血管周围纤维化，引起心脏结构重塑（remodling），并由此引起舒张、收缩功能不全，最终导致心力衰竭；后者主要表现为心肌细胞坏死和瘢痕形成，并可有心脏功能的异常。基于心肌纤维化已成为慢性心功能不全难以逆转的原因之一，常导致严重的后果，因此研究切实有效的防治措施受到高度关注。心肌纤维化是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果，如心衰时心肌细胞及心肌间质细胞的丢失、心肌成纤维细胞活化包括增殖及表型转变、心肌成纤维细胞合成和分泌的胶原蛋白成分改变引起的I型和III型胶原含量的比值变化等因素，均促进了心肌胶原的大量沉积，再加上促胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶的表达和活性下降，共同作用导致胶原的合成大大增加而降解大大降低，导致心肌纤维化的发生。心肌纤维化的形成机制非常复杂，长期的压力过负荷、炎症反应、氧化应激等都参与了心肌纤维化的形成，而上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁/自分泌系统的调控紊乱，其中研究较清楚的包括内源性的肾素－血管紧张素－醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosteron system, RAAS）、内皮素（endothelin，ET）－一氧化氮（nitric oxide，NO）系统、血小板衍生的生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）－血栓素2（thromboxane, TxA2）系统等，心脏的这些旁/自分泌系统不仅诱导心肌损伤，也是心肌纤维化的促进因子，但至今为止内源性的抗心肌纤维化防御体系则研究甚少，作用尚不清楚，近年来引起了高度关注。 近年来研究发现一种古老的多肽，松弛素，是迄今发现的最强的内源性抗纤维化物质之一，是最具前景的内源性抗纤维化物质。松弛素（relaxin，RLX）是1926年，Hisaw从怀孕的猪黄体细胞中提取的妊娠相关激素，能松弛耻骨韧带、软化宫颈，促进分娩。Relaxin是胰岛素样生长因子超家族的一员，在人及其他一些高等灵长动物体内有3种类型，分别为H1，H2，H3，其中H2是组织储存及血液循环中存在的主要形式；在啮齿动物存在两种RLX类型，分别为RLX-1（相当于H2）和RLX-3（相当于H3）。后来研究发现，在非妊娠期的妇女及男性体内多种组织都有relaxin的表达，推测relaxin不仅是一种生殖激素，可能还具有多种生物学效应。但直至2000年，人们利用同源的方法发现并克隆了孤儿受体LGR7（leucine rich repeat containing, G protein coupled receptors, LGR），随后证实RLX为其内源性配体，这一发现使relaxin的功能研究进入了一个崭新的阶段，就此2002年，Science杂志就曾发表社评文章，指出对relaxin功能的重新认识有着深远的影响。Relaxin是体内广泛分布的多功能活性多肽，不仅调节生殖系统功能，还参与神经垂体激素的分泌、大脑发育和心血管系统功能稳态等广泛生理过程的调节，在肿瘤的发展和转移及其心血管疾病发病中均具有重要的病理生理意义， 其中relaxin强大的抗纤维化效应尤为受人关注。 在relaxin基因敲除的小鼠及其受体LGR7基因敲除的小鼠全身各脏器均出现严重的纤维化，早期补充使用relaxin可阻止肺纤维化、肺泡实质化、支气管上皮肥厚等病理变化发生；在溴化乙胺诱导的小鼠出现肾脏间质纤维化、肾小球滤过率下降及蛋白尿，补充relaxin有效的抑制了间质纤维化，改善肾功能。在肝脏，relaxin同样减弱了I型胶原的合成。既往的研究认为在心肌细胞relaxin及其受体的表达很低，心肌局部旁/自分泌的relaxin在心肌纤维化中的作用不被关注。2005年，我们课题组首先在国外杂志上报道了relaxin对心血管疾病的保护作用：在亚急性异丙肾上腺素（isoproterenol, ISO）(Peptides，2005 Sep；26：1632-1639)诱导的大鼠心肌坏死、纤维化的模型上，心脏内源性的relaxin表达、合成显著增加，外源性给予relaxin可以明显改善心功能，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌纤维化，据此我们认为relaxin是一种内源性的心脏保护物质。我们的工作虽然发表时间不长，但已受到了学术届的高度关注，当年即被SCI文献引用。但relaxin的抗心肌纤维化的机制远未阐明。 目前研究认为relaxin可能是通过下列途径发挥作用的：1、relaxin能显著的抑制纤维母细胞的增殖；2、relaxin抑制胶原的合成、分泌及在组织中的沉积；3、relaxin抑制纤维形成过程中其他基质成份的表达上调，如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白－2及氨基葡聚糖等；4、relaxin刺激多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的表达和活性，抑制金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs)的表达和活性。但在不同的种属、不同的组织器官、不同病因诱导的纤维化中，relaxin抗纤维化的作用及机制均不相同。与其他组织器官的纤维化的发病不同，心肌纤维化的发生与其自身的旁/自分泌活性物质AngII、醛固酮的功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随心肌AngII、醛固酮基因表达和活性的增强。Relaxin是一种心血管活性物质，心肌能合成和分泌relaxin－1、relaxin－3，并且在心室和心房均富含LGR7受体。有文献报道在中枢系统，relaxin抑制AngII的表达，参与中枢渗透压的调节，但内源性的relaxin对心肌旁/自分泌的AngII及醛固酮有何影响及相应的作用靶点尚未见报道。我们的假说是relaxin可能通过作用于心脏旁/自分泌的AngII及醛固酮系统，拮抗心肌纤维化，是机体抗纤维化的内源性防御体系。 本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin－1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统――血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。 参考文献： 1 Hisaw FL: Experimental relaxation of the pubic ligament of the guinea pig. Proc Soc Exp Biol Med 1926, 23:661-663. 2 Samuel CS. Relaxin: antifibrotic properties and effects in models of disease. Clin Med Res. 2005 Nov;3(4):241-9. 3 Samuel CS, Zhao C, Bathgate RA, Du XJ, Summers RJ, Amento EP, Walker LL, Mc Burnie M, Zhao L, Tregear GW. The relaxin gene-knockout mouse: a model of progressive fibrosis.Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:173-81. 4 Sherwood OD. Relaxin's physiological roles and other diverse actions. Endocr Rev. 2004 Apr;25(2):205-34. 5 Bennett RG, Kharbanda KK, Tuma DJ. Inhibition of markers of hepatic stellate cell activation by the hormone relaxin. Biochem Pharmacol. 2003 Sep 1;66(5):867-74. 6 Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides. 2005 Sep; 26(9):1632-9. 7. Lekgabe ED, Kiriazis H, Zhao C, Xu Q, Moore XL, Su Y, Bathgate RA, Du XJ, Samuel CS. Relaxin reverses cardiac and renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats.Hypertension. 2005 Aug;46(2):412-8. 8. Mookerjee I, Tang ML, Solly N, Tregear GW, Samuel CS. Investigating the role of relaxin in the regulation of airway fibrosis in animal models of acute and chronic allergic airway disease. Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:194-6. 9. Bennett RG, Mahan KJ, Gentry-Nielsen MJ, Tuma DJ. Relaxin receptor expression in hepatic stellate cells and in cirrhotic rat liver tissue. Ann N Y Acad Sci. 2005 May;1041:185-9. 10. Richard Ivell. This hormone has been relaxin too long. Science 2002; 295: 637-638.   2．项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键问题 研究目标：本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin－1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统――血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。 研究内容： 1、以ISO诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰分别作为修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型，分别观察心脏内源性的relaxin－1/3的mRNA表达和放免活性、LGR7的mRNA和蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别外源性的给予relaxin－1或relaxin－3后，对心肌血管紧张素II、醛固酮表达和活性、对它们的受体表达和亲和力的影响；及心肌羟脯氨酸含量、I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白－2及氨基葡聚糖等的表达、心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达及活性的变化，以确定relaxin的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。 2、在上述工作的基础上，分别以血管紧张素II、醛固酮处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察心肌细胞relaxin－1/3的mRNA表达和放免活性、LGR7的mRNA和蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别予以relaxin－1或relaxin－3预处理及心肌成纤维细胞转染表达relaxin的腺病毒，内源性的高表达relaxin后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化，及血管紧张素II受体和醛固酮受体的表达和亲和力的改变，进一步确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。 3、为了进一步阐明relaxin为抗纤维化的内源性防御体系，在血管紧张素II处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察relaxin预处理后，AngII诱导心肌纤维化发生的分子信号如MAPK/ERK、原癌基因C-fos、活素蛋白AP-1、转化生长因子TGF－β的mRNA和蛋白表达及活性的变化；在醛固酮处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察relaxin预处理后，醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号如血管紧张素受体I（AT1）、AP-1、核转录因子NF-ΚB、碱性成纤维细胞生长因子bFGF的mRNA和蛋白表达及活性的变化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。 4、在上述研究的基础上，进一步观察relaxin抑制心肌纤维化的细胞内信号转导机制。在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。   拟解决的关键问题： 确证Relaxin为机体抗纤维化的内源性防御体系，探讨relaxin抗心肌纤维化的机制及分子信号转导通路。（1）在整体、离体的纤维化模型上，观察内源性relaxin及其受体的变化，及外源性补充relaxin的抗心肌纤维化效应。（2）确定relaxin抗心肌纤维化的作用靶点及相应的信号通路。（3）确定relaxin对心肌RAAS系统的影响及其抑制RAAS作用的分子靶点。 3．拟采取的研究及可行性分析 拟采取的研究方案 1、确定relaxin的抗心肌纤维化作用，筛选其作用的靶分子。 大鼠腹腔注射ISO诱导大鼠亚急性心衰，大鼠腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰，分别复制修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型。通过组织切片、天狼星红染色观察心肌纤维化，利用生化方法测定心肌羟脯氨酸含量。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。利用免疫组化及Western Blotd 方法检测α－平滑肌actin（α-SMA）的表达和组织分布；利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白－2及氨基葡聚糖等的表达、心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定MMPs酶的活性。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌AngII、醛固酮及其受体的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织AngII、醛固酮的放免活性，用受体Binding实验，测定AngII、醛固酮受体的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌握。 2、确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。 分别以血管紧张素II、醛固酮处理的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞为心肌纤维化模型，采用3H-胸腺嘧啶（TdR）入测定心肌成纤维细胞的增殖，免疫组化及Western Blotd 方法检测α－平滑肌actin（α-SMA）的表达和细胞定位说明成纤维细胞表型的改变，天狼星红染色观察心肌成纤维细胞胶原含量。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。构建relaxin表达质粒，进行重组腺病毒的包装、克隆化、扩增、纯化和滴定测定后，转染乳鼠心肌细胞，造成relaxin高表达。利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定以确定的靶分子mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定酶的活性。采用Real-Time PCR或Northern Blot方法检测细胞AngII、醛固酮受体的mRNA表达，用受体Binding实验，测定AngII、醛固酮受体的亲和力。上述测定方法本课题组均熟练掌握。 3、确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。 在AngII诱导的心肌纤维化组，利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定MAPK/ERK、原癌基因C-fos、活素蛋白AP-1、转化生长因子TGF－β的mRNA和蛋白表达，以同位素32P标记的γATP，放免测定或磷酸化的MAPK抗体进行Western Blot测定MAPK的活性，观察relaxin作用的分子靶点；在醛固酮诱导的心肌纤维化组，利用Real-Time PCR、Western Blot的方法测定AT1、AP-1、NF-ΚB、bFGF的mRNA和蛋白表达，并利用荧光染色共定位的方法测定NF-ΚB的转位，观察relaxin作用的分子靶点。上述测定方法本课题组均熟练掌握。 4、确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。 根据以上研究，以relaxin作用的主要信号转导通路为切入点，如腺苷酸环化酶（adenyl cyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt，利用工具药（阻断剂和激动剂），并且直接采用酶学方法测定酶活性及Western Blot方法观察其表达、活化（磷酸化或去磷酸化），深入研究relaxin作用的信号转导机制。上述测定方法本课题组均熟练掌握。 可行性分析 Relaxin是迄今发现的最强的抗纤维化物质之一，对多种脏器如肝、肺、肾及皮肤的纤维化均有强大的抑制作用。本课题组的前期工作提示relaxin具有较强的心肌保护及抑制心肌纤维化的作用，但relaxin抗心肌纤维化的作用尚不清楚。本项目对relaxin抗心肌纤维化的机制及信号转导通路进行研究，确定内源性relaxin为机体内源性抗纤维化的防御体系是前期工作的深入和延续。本项目中采用的动物模型和刺激因素皆为国际通用的经典模型和药物，本课题组已熟练掌握构建质粒、基因重组及转染、RT-PCR、Northern Blot及Western Blot的技术和方法，并熟悉项目所涉及的生化指标测定和生理功能测定的方法和技术。 4．本项目的特色与创新之处 大量研究表明，Relaxin对皮肤、肝脏、肾脏及肺等多种组织器官具有显著的抗纤维化作用，我们前期工作也报道了relaxin改善ISO处理的大鼠心功能，抑制心肌纤维化，在国际杂志发表后引起了学术界的高度关注和评价，但有关relaxin抑制心肌纤维化的机制尚不清楚。与其他组织器官纤维化的发病不同，心肌纤维化与其自身的旁/自分泌活性物质AngII、醛固酮的功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随心肌AngII、醛固酮基因表达和活性的增强，心脏内源性的relaxin系统是否通过对AngII、醛固酮的调节，实现抗心肌纤维化的作用，尚未见报道。通过此研究，我们将首次证实在心肌纤维化发展中，内源性relaxin系统的变化及relaxin对RAAS系统的影响及作用靶点，确定relaxin是机体内源性抗纤维化的防御体系，并确定relaxin抗心肌纤维化的分子信号转导通路。   5．年度研究计划及预期研究结果 2007.1－2007.8： 在ISO诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰模型上，观察心脏内源性的relaxin－1/3、LGR7表达的变化；研究外源性给予relaxin－1或relaxin－3后，心肌纤维化个指标的变化，以确定relaxin的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。 2007.9－2008.12：在血管紧张素II、醛固酮诱导的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞纤维化的模型上，观察心脏内源性的relaxin－1/3、LGR7表达的变化；研究构建表达relaxin的腺病毒，转染心肌成纤维细胞引起内源性的高表达relaxin，及分别予以relaxin－1或relaxin－3预处理后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化，进一步确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。 2009.1－2009.12：在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用relaxin作用的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。研究relaxin预处理后，AngII及醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号的mRNA和蛋白表达及活性的变化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。 预期结果： 通过上述研究，预计发表SCI 文章2-3篇，培养1-2名研究生。 （二）研究基础与工作条件 1. 工作基础 本课题组一直致力于内源性的心血管活性物质的心血管效应及其机制研究，并首先报道了尾加压素II、肾上腺髓质素、ghrelin及apelin等多种心血管旁自分泌物质在心血管疾病中的作用及可能机制。2003年始，我们室即开始关注relaxin的抗纤维化效应，并跟踪报道了国际上有关relaxin的重大事件，同时2005年，我们实验室首先在国外杂志上报道了relaxin在亚急性异丙肾上腺素 (Peptides，2005；26：1632-1639)诱导的大鼠心肌坏死、纤维化的模型上，心脏内源性的relaxin表达、合成增加，外源性给予relaxin可以明显改善心功能，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌纤维化，据此我们认为relaxin是一种内源性的心脏保护物质。我们的工作虽然发表时间不长，但已受到了学术届的高度关注，当年即被SCI引用，但relaxin的作用机制还有待于进一步深入研究。 已发表与relaxin相关的文章： 1. Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides. 2005 Sep; 26(9):1632-9. 2. 张靓，唐朝枢。松弛素的心血管调节作用，国外医学生理病理科学与临床分册，2004.5。 3. 张靓，唐朝枢。第四届国际松弛素及其相关肽会议在美召开，生理科学进展，2005.1。 2．工作条件 申请者所在单位北京大学医学部生理与病理生理学系（国家重点学科）和北京大学心血管研究所（教育部分子生物学重点实验室）能提供本项目研究所需的实验场所。北京大学心血管研究所为临床与基础相结合的研究所。具有国内一流的细胞和分子生物学实验设备，生理功能实验设备，如凝胶成像系统、Odyssey双红外激光成像系统等。申请者所在单位动物中心能提供本项目所需的合格动物动物,且实验动物与环境设施符合壹级标准。缺少的本项目有关试剂，均可在国内外公司购买。 3. 申请人简历 张靓，女，讲师。1976年出生。1997年毕业于扬州大学体育学院体育教育专业。1997-2000年在扬州大学体育学院运动科学研究所读硕士研究生，获硕士学位。2000-2003在华东师范大学体育与健康学院读博士研究生，师从许豪文教授，博士论文为“运动与动脉粥样硬化：一氧化氮的作用及机制研究”，获理学博士学位。2002.4－2004.4主持江苏省高校自然科学研究项目（运动对内皮功能的影响及其在动脉粥样硬化形成中的作用，B0209088），已结题。2004年至今于北京大学医学部基础医学院生理与病理生理学系博士后流动站工作，方向为心血管活性物质与心血管疾病。申请人在本项目中为项目负责人。主要负责实验设计、资料的分析和处理和部分分子生物学实验。 近期发表的论文： 近3年来在国内外发表或待发表第一作者和作者论文7篇，参与研究发表的论文5篇。 1. Yang JH, Pan CS, Jia YX, Zhang J, Zhao J, Pang YZ, Yang J, Tang CS, QI YF. Intermedin1-53 activates L-arginine/nitric oxide synthase/nitric oxide pathway in rat aortas. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Mar 10; 341(2):567-72. 2. Jia YX, Pan CS, Zhang J, Geng B, Yang J, Cahng JK, Tang CS, Qi YF. Apelin protects myocardial injury induced by isoproterenol in rats. Regul Pept. 2006 Jan 15; 133(1-3):147-54. 3. Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides. 2005 Sep; 26(9):1632-9. 4. Ren YS, Yang JH, Zhang J, Pan CS, Yang J, Zhao J, Pang YZ, Tang CS, Qi YF. Intermedin 1-53 in central nervous system elevates arterial blood pressure in rats.Peptides. 2006 Jan;27(1):74-9. 5. Wang JX, Li Y, Zhang LK, Zhao J, Pang YZ, Tang CS, Zhang J. Taurine inhibits ischemia/reperfusion-induced compartment syndrome in rabbits. Acta Pharmacol Sin. 2005 Jul;26(7):821-7. 6. Qi YF, Dong LW, Pan CS, Zhang J, Geng B, Zhao J, Tang CS. Adrenomedullin induces heme oxygenase-1 gene expression and cGMP formation in rat vascular smooth muscle cells. Peptides. 2005 Jul;26(7):1257-63. 7. Lian Li, Like Zhang , Yongzheng Pang, Chunshui Pan, Yongfen Qi, Li Chen, Xian Wang, Chaoshu Tang, Jing Zhang. Cardioprotective Effects of Ghrelin and Des-octanoyl-ghrelin on Myocardial Injury Induced by Isoproterenol in Rats. Acta Pharmacol Sin. 2006 in press. 8. 张靓，唐朝枢。松弛素的心血管调节作用，国外医学生理病理科学与临床分册，2004.5。 9. 张靓，唐朝枢。骨骼肌的内分泌功能，生理科学进展，2006, in press。 10. 曾柏生，张靓，李宁川， 黄叔怀。有氧运动改善ApoE基因缺陷小鼠NO合成抗AS机制的研究，中国运动医学杂志，2005.1。 11. 张靓，许豪文。运动与动脉粥样硬化：一氧化氮的作用探讨，体育科学，2004.6。 12. 张靓，许豪文， 黄叔怀。内源性一氧化氮合酶抑制物：ADMA－－新的动脉粥样硬化动脉粥样硬化危险因子，中国运动医学杂志，2004.1。 项目组主要成员耿彬简历： 耿彬，硕士。1997年毕业于山西医科大学儿科系，获临床医学学士学位。2001年毕业于首都医科大学附属友谊医院儿科专业，师从侯安存教授（北京友谊医院儿科），获医学硕士学位，毕业论文为：“健康儿童呼吸道合胞病毒携带状况调查”。同年进入北京大学医学部生理病理生理学系，从事心血管气体信号分子及活性多肽对心血管功能的调节及病理生理意义的研究。发表的主要论文： 1.       Geng B, Yang J, Qi Y, Zhao J, Pang Y, Du J, Tang C.H2S generated by heart in rat and its effects on cardiac function. Biochem Biophys Res Commun 2004, 313: 362–368.. 2.       Geng B, Chang L, Pan C, Qi Y, Zhao J, Pang Y, Du J, Tang C. Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 318:756-763. 3.       Jiang W, Cai DY, Pan CS, Qi YF, Jiang HF, Geng B, Tang CS. Changes in production and metabolism of brain natriuretic peptide in rats with myocardial necrosis. Eur J Pharmacol. 2005, 507:153-162. 4.       Yu F, Zhao J, Yang J, Geng B, Wang S, Feng X, Tang C, Chang L. Salusins promote cardiomyocyte growth but does not affect cardiac function in rats. Regul Pept. 2004, 122:191-197. 5.       Yan H, Du J, Tang C, Geng B, Jiang H. Changes in arterial hydrogen sulfide (H2S) content during septic shock and endotoxin shock in rats. J Infection. 2003, 47: 155-160. 6.       Chang L, Zhao J, Li GZ, Geng B, Pan CS, Qi YF, Tang CS. Ghrelin protects myocardium from isoproterenol-induced injury in rats. Acta Pharmacol Sin. 2004, 25:1131-1137. 7.       Chang L, Ren Y, Liu X, Li WG, Yang J, Geng B, Weintraub NL, Tang C. Protective Effects of Ghrelin on Ischemia/Reperfusion Injury in the Isolated Rat Heart. J Cardiovasc Pharmacol. 2004, 43:165-170. 8.       耿彬，常林，赵晶，陈志慧，庞永正，唐朝枢。尾加压素II对大鼠胸主动脉及肠系膜动脉各部分产生一氧化氮的影响。高血压杂志。2003，114: 371-376。 9.       耿彬，吴胜英、张宝红，庞永正，唐朝枢。心血管组织钙化大鼠心肌浆网一氧化氮合酶的改变。中国病理生理杂志。2004，20：12-16。 4. 承担科研工作情况 参与“肾上腺髓质素调节血管钙化的细胞信号转导机制”，国家自然科学基金面上项目(NO.30470693)，2004-2007，为一般参与者，承担部分分子生物学实验，与本项目不冲突。 5. 完成自然科学基金情况 无 （三）经费申请说明 不需购置5万元以上大型设备。 （四）其他附件清单 。。。。 国家自然基金成功申请范本2 2008-08-12 23:36:09   来源:互联网   作者:华溢医学论文网   收藏本页  点击： 494次 二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义； 对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。 重症肝炎（又称暴发性肝功能衰竭）发生多与肝炎病毒感染、化学药物中毒等因素有关，我国又是病毒性肝炎发生大国，每年都有相当一部分病人患重症肝炎，每年仅重医大附二院传染科收治的重症肝炎病人就近几十例。重症肝炎以起病急、病情进展快、病死率高为特点，目前对它的发生机制仍未搞清，因此它严重威胁着人们的生命健康。国内现主要以综合疗法治疗重症肝炎，此疗法虽对改善疾病的某些症状有一定帮助，但并未从根本上改变该病的预后。国外多以肝移植来治疗本病，其近期疗效明确而肯定，但远期疗效因受免疫排斥反应的制约而不容乐观。近两年国内几家大医院也相继开展了肝移植手术，但受手术复杂性、器官来源以及接受肝移植者需长期服用免疫抑制剂来避免排斥反应发生所造成的高昂药费和长期使用免疫抑制剂可能造成肾损害等因素的制约，仍限制了此疗法的开展。 人和哺乳动物的肝脏具有强大的再生功能，2/3肝切除后的动物在10-15天左右残存肝脏可恢复到术前体积，而重症肝炎患者多表现为缺乏这种再生能力。究其原因除了残存肝细胞不能为机体代谢提供足够的肝功能支持外，激活的免疫细胞及其产生的炎症因子仍不断造成残存肝细胞坏死，甚至杀伤新生肝细胞，从而严重阻碍了肝脏的再生。近年来越来越多的研究证实肝内和浸润的单核巨噬细胞及其产生的炎症因子在造成肝细胞大量坏死、杀伤新生肝细胞方面起了极其重要的作用（1，2）。如果抑制或删除肝内的单核巨噬细胞，或中和炎症因子就能大大改善肝脏的再生能力（3，4，5）。在这些研究中人们多使用相应的单克隆抗体来删除或中和单核巨噬细胞和它们产生的炎症因子。但单克隆抗体多来自小鼠杂交瘤细胞，用于人体治疗受到限制。急性肝功能衰竭时如能提供一定数量的外源性肝细胞和某种能抑制肝内单核巨噬细胞功能的物质，起到既阻止残存肝细胞进一步坏死和杀伤新生肝细胞，又能避免外源性肝细胞遭到排斥，同时还能支撑机体代谢需要，减轻残存肝细胞的负担，使它们有足够时间再生，达到治愈肝功能衰竭的目的。众多的动物实验已证明肝细胞移植加免疫抑制剂可满足这一目的（6，7，8），但免疫抑制剂都是非特异地抑制机体的整个免疫系统，在降低免疫反应的同时也降低了机体的抵抗力，常常引起严重的继发感染，而且免疫抑制剂多有严重的毒副作用，如临床常用的环孢霉素A就有严重的肾毒性，这些在重症肝炎常是导致病人死亡的危险因素。 1994年Hagiya从乳鼠肝脏中分离出一种能促进肝脏再生的物质，并克隆了它的cDNA，为它取名为肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）（9）。我们已从人胎肝组织中克隆出人ALR cDNA，成功构建了它的真、原核重组表达质粒，并进行了高效表达（10，11）。新近的研究发现ALR能通过抑制肝内NK细胞的活性来促进肝细胞再生（12，13）。在胎胰岛细胞移植加ALR治疗糖尿病大鼠的研究中也发现，凡在移植细胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢复到正常水平，而单独接受胎胰细胞移植治疗的大鼠无一只血糖恢复正常，说明ALR使移植的胎胰细胞避免了排斥反应，能存活并发挥功能（14）。基于这些最新研究成果，我们拟探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法；同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法；并通过本研究观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系，进一步阐明ALR的作用机理。本课题如获成功必将为重症肝炎患者带来福音，产生巨大的社会效益及经济效益。 1．顾长海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科学技术出版社，1997；11-21   2．Nikola LV, Lorenzo P, Alessandro A, et al. Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunology 1995; 154:6324-6338 3．Blazka ME, Elwell MR, Holladay SD, et al. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: ole of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996; 24:181-189 4．Tamura F, Masuhara A, Sakaida I, et al. FK506 promates liver regeneration by suppressing natural killer cell activity. J Gastroenterol Hepatol 1998; 13:703-708 5．  Boulton RA, Alison MR, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70% partial hepatectomy in rats following selective kuffer cell depletion. J Hepatol 1998; 29:271-280 6．  Takeshita K, Ishibashi H, Suzuki M, et al. Hepatocellular transplantation for metabolic support in experimental acute ischemic liver failure in rats. Cell Transplant 1993; 2:319-324 7．  Demetriou AA, Reisner A, Sanchez J, et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatectomized rats. Hepatology 1988; 8:1006-1009 8．  Mito M, Susano M, Sawa M, et al. Hepatocyte transplantation for hepatic failure. Transplant Rev 1993; 7:35-43 9．  Michio Hagiya, Antonio Francavilla, Lorenzo Polimeno, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:8142-8146 10.  中华肝脏病杂志。1999; 7(3) 11.  中华肝脏病杂志 2000；8（1） 12.  Francavilla A, Vujanovic NL, Polimeno L, et al. The in vivo effect of hepatotrophic factors augmenter of liver regeneration, hepatocyte growth factor, and insulin-like growth factor-II on liver natural killer cell functions. Hepatology 1997; 25:411-415 13.  Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 2000; 35:112-119 14.  Adams GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rats of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation 1998; 65:32-36     －3－   三、研究方案 1.    研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 （1）    研究目标： 通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法。同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。 （2）    研究内容： a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型； b：Ⅳ型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞； c：电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞； d：ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况； e：比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后，胎肝细胞复苏存活率； f：用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR，了解ALR的变化情况； g：用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21（DE3）表达的大鼠ALR； h：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别； i：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化； j：免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布，以判断移植细胞的存活情况； k：用ELISA法和Northern blot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-α、IL-1水平及它们的mRNA表达情况，探讨ALR的作用机理； l：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。 （3）    拟解决的关键问题： 重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。     －4－   2.      拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析   （1）研究方法、技术路线、实验方案：   D-氨基半乳糖制备 胶原酶消化胎鼠肝 冻存、复苏 大鼠急性肝衰竭模型 制备胎肝细胞 纯化的大鼠ALR 电转化质粒 pCDNA3.1-S 至胎肝细胞     对照组 FLC＋CsA FLC＋ALR FLC ALR   比较各项检测指标   如果FLC＋ALR组有效， 再与冻存细胞进行治疗比较 注：图中FLC为胎肝细胞；CsA为环孢霉素A；ALR为肝再生增强因子。 （2）可行性分析：本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株，只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒，只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植，就能区判定移植细胞的存活情况。此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备，为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段，要完成本课题研究应不成问题。 3.      本项目的创新之处 （1）首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性； （2）首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达变化情况及它对TNF-α、IL-1等炎症产生的影响； （3）首次探讨胎