利用基因芯片技术研究乙肝病毒耐药机制_李延武

利用基因芯片技术研究乙肝病毒耐药机制 李延武 (广东省深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035) ［摘要］ 目的 探讨基因芯片技术在乙型肝炎基因中的分型及乙肝病毒耐药性检测中的临床价值，研究乙肝病 毒耐药机制。方法 采用基因芯片技术和传统的 PCR核酸扩增技术，对接受了拉米呋啶治疗的 239 例乙肝患者进行 基因分型以及拉米夫定治疗中 YM － DD基因变异即乙肝病毒耐药性进行检测。结果 所有 HBV DNA阳性者中，B基 因型 10 例，C基因型 132 例，B /C混合型 2 例;拉米夫定治疗小于 3 个月、3 个月 ～ 1 a以及 1 a以上的 YMDD突变率分 别为 3． 77%，15． 56%和 40． 6%。结论 基因芯片技术能很好地用于乙肝的诊断分型，并能检测到 YMDD 变异情况， 从而对拉米夫定治疗后耐药性进行判断。 ［关键词］ 基因芯片;乙肝病毒;拉米夫定;耐药性 ［中图分类号］ R ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1008 － 8849(2012)12 － 1303 － 02 ［基金项目］ 2010 年深圳市科技计划项目(201003037) 近年来人类对乙型肝炎病毒的了解越来越深入，同时医 学分子生物学的蓬勃发展，为乙型肝炎的预防、诊断、治疗翻 开了崭新一页。作为抗病毒治疗用药，拉米夫定(Lamivudi- ne)能够作用于乙肝病毒 DNA聚合酶，有效抑制病毒复制，被 广泛应用于临床。然而长期应用拉米夫定患者可能会出现耐 药情况，药物治疗效果降低。有研究报道，这与乙肝病毒 YM- DD变异导致拉米夫定耐药相关［1］。为了探讨基因芯片技术 在乙型肝炎基因中的分型及乙肝病毒耐药性检测中的临床价 值，笔者采用乙肝病毒基因芯片对 239 例乙肝患者中 HBV DNA阳性的 138 例标本的血清型、基因型分型以及病毒耐药 性进行检测，现将结果报道如下。 1 临床资料 1. 1 仪器及试剂 乙肝抗原、抗体的定量检测(新波生物时 间分辨试剂盒，ANYTEST200 时间分辨荧光免疫系统) ， ALT检测(日立 600 生化分析仪) ，乙肝病毒 PCR 核酸扩增 检测(Roche LightCycler480 核酸扩增分析仪) ，乙肝病毒耐药 检测(亚能生物技术有限公司的乙肝病毒耐药基因芯片检测 试剂盒)。严格按说明操作，检测方法的各项质量指标及 质控参数均在允许范围内。 1. 2 检测对象 选取 2008 年 5 月—2010 年 5 月本院门诊部 确诊的乙型肝炎患者共 239 例，年龄 20 ～ 70 岁，其中共有 130 例 HBV DNA阳性患者，所有患者经过乙肝抗原、抗体、ALT、 乙肝病毒核酸扩增检测，确诊为乙型肝炎，在本院进行了一定 时间的拉米呋啶治疗。 1. 3 研究方法 定量检测乙肝抗原、抗体、ALT、乙肝病毒 PCR核酸扩增检测等各项指标。 1. 3. 1 标本的采集 选定的研究对象及正常对照组于晨抽 取空腹静脉血 2 mL，置于干净的干燥管中，2 h 内离心(3 000 r /min，10 min)分离血清，如当天不能检测，样品立即置 － 20 ℃保存。 1. 3. 2 标本的检测 2 d 之内对标本进行检测。指标包括: 乙肝抗原、抗体、ALT、乙肝病毒 PCR核酸扩增、PCR方法的乙 肝病毒耐药基因、乙肝病毒耐药检测。 1. 3. 3 HBV DNA 提取和 PCR 扩增 HBsAg 阳性血清 提取 DNA 模板，选取 HBV DNA 保守序列为引物行 PCR 扩 增。余操作严格按照说明书进行。 1. 4 统计学处理 对所得数据采用 SPSS 16． 0 统计软件进 行处理，单因素计数资料采用 2检验，计量资料采用 t 检验， P ＜ 0． 05 为具有显著性差异。 2 结 果 2. 1 基因分型 所有 HBV DNA阳性者中，B基因型 10 例，C 基因型 132 例，B /C混合型 2 例; 2. 2 拉米夫定服用时间和 YMDD变异的关系 拉米夫定治 疗小于 3 个月、3 个月 ～ 1 a 以及 1 a 以上的 YMDD 突变率分 别为 3． 77%，15． 56%和 40． 6%。见 1。 表 1 拉米夫定服用时间和 YMDD变异的关系 用药时间 n YMDD突变数 /例 突变率 /% ＞ 1 a 32 13 40． 62① 3 个月 ～ 1 a 45 7 15． 56① ＜ 3 个月 53 2 3． 77 注:①与 P ＜ 3 个月组比较，P ＜ 0． 05。 3 讨 论 HBV感染会导致严重的肝炎、肝硬化和肝癌等。抗乙肝 病毒治疗在国内外尚无特效药物，只有抑制慢性乙肝病毒复 制的部分有效药，主要有拉米呋啶、阿德福韦、恩替卡韦、替比 呋啶等。核苷类药物拉米夫定等可抑制 HBV复制，具有明显 的抗病毒作用，但长期使用可引起耐药性。其耐药机制是长 期使用拉米夫定，引起乙肝病毒聚合酶中 YMDD(酪氨酸 －蛋 氨酸 －天门冬氨酸 －天门冬氨酸)序列中的核苷酸发生突 变，造成病毒对相应药物敏感性大大降低，从而血清中 HBV DNA复制恢复活跃。近来的研究表明，HBV在人体内受自然 压力、人体免疫力和药物治疗的影响，基因序列突变的 HBV 病毒株会不断地大量积累，而有些病毒的基因变异恰好位于 ·3031·现代中西医结合杂志 Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2012 Apr，21(12) HBV DNA 聚合酶的区域，就会产生耐药［2 － 4］。因此，经过抗 病毒药物的选择，和抗病毒用药时间的延长，最终耐药病毒株 从劣势种群逐渐演变成优势种群。早期发现耐药位点对于指 导医生用药，实现个体化医疗，提高治疗成功率具有很重要的 价值。目前最新的基因芯片检测技术能够同时对多个位点进 行检测，操作比较简单，准确快速，符合分子生物学发展的趋 势［5］。通过本研究显示基因芯片技术能很好用于乙肝的诊 断分型，并能检测到 YMDD 变异情况，从而对拉米夫定治疗 后耐药性进行判断。 ［ 参 考 文 献 ］ ［1］ 陈伟烈，蔡晓莉，魏绍静，等． 基因芯片技术在乙肝病毒基因型 及 YMDD变异检测中的应用［J］． 中国实验诊断学，2007，8 (2) :207 － 212 ［2］ 陈建，许建民，王敏，等． 基因芯片检测乙醇对慢性乙型肝炎患 者乙肝病毒多位点基因突变的研究［J］． 中国病理生理杂志， 2008，5(3) :573 － 576 ［3］ 高春明，陈家盛． 基因芯片法检测乙肝相关性肝硬化患者 HBV 感染血清标志物［J］． 蚌埠医学院学报，2006，11(4) :360 － 361 ［4］ 李金明，谢南，熊德琴，等． 基因芯片法检测乙肝病毒多位点变 异的临床应用［J］． 实验与检验医学，2009，6(6) :615 － 616 ［5］ 亓民，江河清． 基因芯片检测慢性乙肝患者 HBV － DNA变异的 临床研究［J］． 河南科技大学学报:医学版，2006，9(1) :19 － 21 ［收稿日期］ 2011 － 11 － 17 柴芍承气汤治疗急性水肿型胰腺炎的疗效评估 王纪东 (河南省开封市第一人民医院，河南 开封 475003) ［摘要］ 目的 探讨柴芍承气汤治疗急性水肿型胰腺炎的效果。方法 将 46 例患者随机分为治疗组和对照组， 对照组给予禁食、胃肠减压、补充血容量、纠正水电解质酸碱失衡、生长抑素、奥美拉唑、抗生素治疗;治疗组在对照组 治疗的基础上加用柴芍承气汤 200 mL经胃管注入或口服，2 ～ 3 次 /d，观察 2 组治疗效果。结果 治疗组有效率明显 高于对照组，2 组比较有显著性差异(P ＜ 0． 05) ;治疗组症状、体征改善时间及住院时间较对照组明显缩短，2 组比较 有显著性差异;2 组重症发生率比较无显著性差异。结论 柴芍承气汤治疗急性水肿型胰腺炎有一定的临床应用价 值，值得临床推广应用。 ［关键词］ 柴芍承气汤;急性水肿性胰腺炎 ［中图分类号］ R576 ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1008 － 8849(2012)12 － 1304 － 02 急性胰腺炎是内科常见的急腹症，起病急、病情重、发展 快，且临床治疗效果不甚满意。近年来，随着国人饮食结构的 改变，急性胰腺炎发病率呈现明显的上升趋势，其发病机制主 要是多种病因导致胰酶在胰腺内部被激活后引起胰腺组织自 身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应［1］。急性水肿型胰 腺炎如治疗不及时或不当时容易发展成重症胰腺炎。2009 年 1 月—2011 年 8 月，笔者在西医常规治疗的基础上，加用 中药柴芍承气汤治疗急性水肿型胰腺炎，取得了一定的疗效， 现报道如下。 1 临床资料 1. 1 一般资料 选择 2009 年 1 月—2011 年 8 月我院住院急 性水肿型胰腺炎患者 46 例，其中男 35 例，女 9 例;年龄 28 ～ 72 岁，平均 47 岁;发病时间 3 ～ 72 h。诊断符合 2003 年中华 消化病学分会胰腺病学组制定的《中国急性胰腺炎诊治指南 (草案)》中的诊断和分级［2］。随机分为 2 组:治疗组 29 例，男 25 例，女 4 例;发病诱因为胆源性 19 例，酒精性 8 例， 其他 2 例。对照组 17 例，男 12 例，女 5 例;发病诱因为胆源 性 14 例，酒精性 2 例，其他 1 例。2 组患者在年龄、性别、发病 时间、病因学诊断等方面无显著性差异(P均 ＞ 0． 05) ，具有可 比性。 1. 2 治疗方法 2 组均予禁食，持续胃肠减压，抑制胃酸分 泌(奥美拉唑) ，抑制胰腺分泌(生长抑素) ，防止感染(头孢他 啶合奥硝唑) ，补液，纠正水、电解质紊乱，营养支持等常规治 疗。在此基础上，治疗组加用柴芍承气汤加减治疗。组方:柴 胡 15 g、黄芩 9 g、川厚朴 12 g、炒杭芍 15 g、川木香 9 g、炒延胡 索 15 g、生大黄 15 g(后下)、芒硝 10 g(冲服)、生甘草 6 g，1 剂 /d，水煎 2 次，量约 200 mL，分 2 ～ 3 次胃管注入并夹管 1 h 后松开胃管，或口服，疗程 7 ～ 10 d。 1. 3 观察指标 观察 2 组治疗有效率;比较 2 组间腹痛、腹 胀持续时间、血淀粉酶恢复正常时间、住院时间以及重症胰腺 类发生率。 1. 4 疗效评定标准 参照文献［2］拟定。显效:治疗 4 d 内 腹胀、腹痛缓解，有肛门排便、排气、肠鸣音恢复;血、尿淀粉 酶检查正常。有效:治疗 7 d 内达到上述标准者。无效:治 疗 7 d 后腹痛、腹胀无明显减轻，血、尿淀粉酶无明显降低。 1. 5 统计学处理 应用 SPSS 11． 0 软件处理数据。计量资 料以 珋x ± s表示，采用 2 检验。P ＜ 0． 05 表示有显著性差异。 2 结 果 2. 1 2 组临床疗效比较 见表 1。 2 . 2 2组症状体征改善时间、血淀粉酶恢复时间及住院时 ·4031· 现代中西医结合杂志 Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2012 Apr，21(12)