负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定.doc

负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定.doc 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴 定 作者:陈陵，向国春，李向红，蔡永国，李晶晶，房殿春，罗元 辉，李志宏，杨仕明 【关键词】 腺病毒达载体 Package and identification of replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT 【Abstract】 AIM: To construct a replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT (AdhTERT). METHODS: The hTERT gene was cloned at the downstream of CMV promoter of the adenoviral shuttle plasmid pDC315 in sense direction and the resultant recombinant plasmid pDC315hTERT was cotransfected into HEK 293 cells together with plasmid pBHGlox (deltaE1, 3) containing adenoviral genome. The adenovirus expression vector was then obtained and identified by infection test, electron microscopic observation and PCR coamplification. RESULTS: After purification and concintration, the titer of AdhTERT reached 5×1012 pfu/L. Virus particles could be found in HEK 293 cells under transmission electron microscope. Both adenovirus and hTERT special fragments could be amplified from AdhTERT by PCR, whereas hTERT special fragment could not be amplified from the control. CONCLUSION: The replicationdeficient recombinant adenovirus expression vector of hTERT is successfully constructed. 【Keywords】 human telomerase reverse transcriptase; adenovirus expression vector 【摘要】 目的: 构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复 制缺陷型腺病毒.方法: 将克隆有正义hTERT cDNA的腺病毒穿梭质 粒pDC315hTERT与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染 人胚肾293细胞(HEK 293), 包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病 毒表达载体(AdhTERT). 对AdhTERT扩增、纯化并浓缩后，进一 步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定. 结果: 纯化浓缩后 的AdhTERT滴度可达5×1012 pfu/L. 电镜下可见在HEK 293细胞中 形成的病毒颗粒，PCR双引物鉴定AdhTERT可扩增出Ad及 hTERT特异片段，而对照则不能扩出hTERT片段. 结论: 成功构建 了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒. 【关键词】 人端粒酶逆转录酶;腺病毒表达载体 0引言 人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT) Mr 127 000，包含1132个氨基酸，其基因位于5号染色体短臂的最末端(5p15.33)，在90%以上的人类肿瘤中高表达，而正常成熟组织中则基本没有表达,1,，因而hTERT是一很有前景的广谱、特异的抗肿瘤治疗靶点. 腺病毒载体系统具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、不发生整合及安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点, 目前已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统,2,，可用作hTERT的异位表达工具. 我们通过构建hTERT腺病毒表达载体，为进一步研究以hTERT为靶点的肿瘤免疫治疗奠定基础. 1材料和方法 1.1材料 负载hTERT基因的正义复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pDC315shTERT由本室构建保存,3,;腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre和转化有腺病毒E1区基因的包装细胞HEK 293均由第三军医大学全军免疫学研究所邹强博士惠赠;大肠杆菌DH5α由本室保存. Hind?, BamH I, Taq DNA聚合酶、dNTP, Plasmid Purification Kit (Promega公司); DGL2000 DNA Marker (北京鼎国试剂公司);质粒DNA小量快速抽提kit (Omega公司);脂质体DOTAP (Roche公司); 高糖DMEM (Gibco公司); 胎牛血清(HyClone公司); 酵母提取物及胰蛋白胨(上海生物工程公司); 低溶点琼脂糖(西班牙进口分装); 氨苄青霉素(华北制药厂). hTERT的PCR引物(144 bp)为P1:5′ CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA 3′,P2: 5′GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3′，腺病毒E2b区引物(860 bp)为P3: 5′TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG 3′, P4:5′CATCTGAACTCAAAGCGTGG 3′,均由上海生物工程公司合成并纯化，纯度达99.5%. AdLacZ空病毒:克隆有β半乳糖苷酶(βgal)基因LacZ，由西南医院心内科唐兵博士惠赠. 1.2方法 1.2.1负载hTERT的复制缺陷型腺病毒的包装脂质体介导pDC315hTERT和pBHGloXΔE1,3Cre参照DOTAP使用说明的方法转染HEK293细胞10,12 d可出现空斑，仔细挑取5个空斑，用少量无菌PBS溶液悬浮后，分别装管冻存于-70?. 将HEK293细胞传入6孔板，细胞70%融合时用于扩增病毒;将挑取的空斑溶液反复冻融3次，低速离心，取上清感染HEK 293细胞;按0.5 mL上清液，0.5 mL DMEM培养液加入6孔板中的HEK 293细胞中，37?培养1 h，其间每15 min摇动培养板1次，1 h后再加入2 mL培养液，继续培养,同时设立阴性转染对照;培养3,5 d后，用空斑上清液转染的HEK293细胞出现细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 而阴性对照组细胞无CPE;收集出现CPE的HEK293细胞，于无菌EP管中以1500 g室温下离心5 min，上清冻存于-70?，用于再感染HEK 293细胞，细胞沉淀用适量无菌PBS液吹散后冻存于-70?. 1.2.2AdhTERT的大量扩增、纯化及滴度测定HEK 293细胞传代于250 mL培养瓶中，细胞80,融合时，加病毒上清5 mL培养1 h，其间每10,15 min摇动培养瓶1次，使其均匀感染，1 h后补加新鲜培养液10 mL，继续培养3,5 d，当细胞出现完全CPE时，收集病变细胞，连同培养液一起移入无菌离心管，室温下以1500 g离心5 min，-70?分别保存上清及细胞，分别用于再感染和收集高滴度病毒. 重复多次即可获得内含大量病毒的HEK 293细胞. 将收集的病变HEK 293细胞冻融3次，破碎细胞，释放病毒，室温下2500 g离心5 min，去除细胞碎片. 病毒上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌，然后将除菌后的病毒上清叠加于无菌梯度氯化铯(CsCl)溶液上层(0.5 mL，比重1.5 kg/L;3.0 mL，1.35 kg/L;3.0 mL，1.25 kg/L)，10?, 150 000 g离心1 h后在1.25 kg/L和1.35 kg/L CsCl溶液间可见灰白色病毒带，将病毒带吸出并与比重为1.35 kg/L的CsCl溶液混和，以4?, 150 000 g离心18 h，留取病毒液，4?避光透析(10 mmol/L TrisCl pH 7.5;1 mmol/L MgCl2;100 mL/L甘油) 24 h，收集病毒液于无菌离心管中，取少许检测病毒滴度，余置-70?冻存备用. 24孔培养板每孔接入1×105 HEK 293细胞，培养24 h，取病毒转染液0.2 mL加PBS至总量2 mL，混匀后作10×倍比稀释至第6管，每个稀释度设3孔，加入不同稀释度病毒液0.2 mL，培养1 h，其间每10,15 min摇动1次培养板，1 h后补加培养液1.5 mL，继续培养36,48 h，观察细胞病变情况. 取近100%出现CPE的稀释度，按下列公式计算病毒滴度: nfu/L=(105细胞×稀释度×10个病毒/细胞)?0.2 mL(设定公式中每个细胞感染10个病毒，36,48 h内导致细胞完全病变).1.2.3AdhTERT的鉴定用冻存的腺病毒载体感染70%,80%融合的HEK 293细胞,37?培养2,3 d，观察HEK 293有无CPE出现. 用PBS作空白对照. 用冻存的腺病毒载体感染HEK 293细胞,37?培养2,3 d后,HEK 293细胞出现CPE.将HEK 293细胞收获,制作电镜标本,透射电镜下观测细胞内有无病毒样颗粒形成. 用PBS作空白对照. 取纯化的病毒200 μL于EP管内，沸水煮10 min，之后直接取5 μL用于PCR的DNA模板. 采用插入的hTERT基因特有引物P1 P2和腺病毒载体特有引物P3 P4,进行双引物PCR鉴定.使用PCR Master进行PCR扩增，模板DNA加入量为5 μL，上下游引物各加1 μL，反应体系为20 μL. 分别扩增腺病毒及端粒酶基因. 反应条件为94? 3 min，94? 1 min，53? 1 min，68? 1 min，40个循环，68?延伸7 min，4?保存. 电泳后同时出现腺病毒基因和端粒酶基因的特异性扩增条带作为阳性判断标准. 用AdLacZ作对照. 2结果 含病毒的细胞冻融液离心去细胞碎片并经梯度CsCl低温超速离心纯化后,得到病毒液5 mL. 采用倍比稀释法测定了AdhTERT的滴度，经计算所得病毒滴度为5×1012 pfu/L. 用AdhTERT感染HEK 293细胞,37?培养2,3 d后,发现HEK 293细胞圆缩、脱落,出现CPE.表明包装成的腺病毒载体感染能力强,可以在HEK 293细胞中E1基因产物的反式作用下大量增生,并阻断宿主细胞DNA和蛋白质生成,最终导致细胞营养耗竭而死亡(图1A). 而用PBS作对照的HEK 293细胞则生长良好(图1B). 用AdhTERT感染HEK 293细胞出现CPE后有大量病毒颗粒形成(图2A), 大小约75,85 nm. 细胞肿胀,透明度增加,核膜不连续.这表明细胞内的病毒复制对细胞造成损伤. 未感染腺病毒的HEK 293细胞(图2B)则发现有病毒样颗粒形成,核膜完整连续,胞质内细胞器清晰可见. 分别对AdLacZ和AdhTERT用两对引物进行PCR扩增，结果AdLacZ只出现860 bp的Ad特异条带(图3), 而AdhTERT则可扩增出860 bp和144 bp两条带. 这表明包装的腺病毒载体内携带hTERT基因. 3讨论 现已发现约90%人类恶性肿瘤细胞内表达端粒酶. 而正常人体，除造血干细胞、生殖细胞等分裂旺盛的细胞表达端粒酶，其余多为阴性，这使得端粒酶有可能成为广谱抗肿瘤治疗靶点,4,. 杨仕明等,5,发现在胃癌、肠癌及肝癌中端粒酶的3个亚单位中TP1及hTR在癌细胞内高表达，在癌旁正常组织内也有或多或少的表达;hTERT则仅在癌细胞内高表达，在癌旁正常组织内极少表达，且hTERT的表达水平与肿瘤的恶性程度成正相关. 转染hTERT cDNA到端粒酶阴性的原代培养细胞内后，可检测到端粒酶表达,6,. 病毒载体可以稳定地将外源基因导入受体细胞并表达，而且效率高，基因转移过程中不易受DNA酶的降解，因而是十分具有发展前途的转基因方法. 而且采用转基因手段将某些功能基因(如肿瘤相关基因MART1, MAGE等)修饰DC,使其在DC中表达，激活特异性肿瘤免疫反应，可以克服抗原直接刺激的DC由于抗原MHC复合物解离或细胞MHC分子降解对其诱导T细胞免疫应答所产生的不利影响,7,. 近年来腺病毒载体被广泛用于DC肿瘤疫苗的研究中,8,. 我们采用分子生物学技术，成功构建了负载hTERT的腺病毒载体，为进一步研究端粒酶基因转染对细胞生物学行为的影响以及针对hTERT的肿瘤疫苗及肿瘤的基因治疗奠定了基础. 【