[管理]河豚毒素

[管理]河豚毒素 河豚毒素 前言 河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)是鲀鱼类(俗称河豚鱼)及其它生物体内含有的一种生物碱。其分子式为C11H17O8N3，分子量为319。该毒素经腹腔注射对小鼠的LD50为8μg/kg。曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素。河豚毒素对肠道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神经末梢和神经中枢，阻碍神经传导，从而引起神经麻痹而致死亡。河鲀毒素对热稳定，盐腌或日晒均不能使其破坏，只有在高温加热30min以上或在碱性条件下才能被分解。 关键字 河豚毒素 致死 毒性 一 河豚毒素的分布 人们通常所指的河鲀(河豚)(puffer fish)，为鲀科鱼类。中国的鲀科鱼类共有54种，其中东方鲀属22种。根据伍汉霖等调查，中国共有35种河鲀具有不同程度的河鲀毒性，其中，在中国南海分布的有24种，在中国东海包括台湾沿海分布的有31种，在中国黄海分布的有14种，在中国渤海分布的有10种。多数种类生活于淡水中,以热带和亚热带为最多. 大约80种河豚鱼已知含有或怀疑含有河豚毒素。在大多数有毒的河豚鱼身体中，毒素的浓度由高到低依次是卵巢、鱼巢、肝脏、肾脏、眼睛和皮肤，肌肉和血液中较少。由于鱼的肌肉部分河豚毒素的含量很低，所以，中毒大多数是由于可食部受到卵巢或肝脏的污染，或是直接进食了这些内脏器官引起的。 河豚鱼的有毒主要存在于雌性河豚卵巢中，而且含量随着季节变化而有不同。其含量的多少因鱼的种类及季节而有差异，一般在卵巢孕育阶段，即春夏季毒性最强。在冬季。毒素的浓度最高，有趣的是河豚鱼风味最佳也是在这个时候。 二、河豚毒素的毒性 河豚毒素一种存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的海洋毒素。毒素主要存在于河豚的性腺、肝脏、脾脏、眼睛、皮肤、血液等部位。在碱性溶液中易分解，在低的pH值溶液中也不稳定。河豚毒素是强烈的神经毒素，很低浓度的河豚毒素就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜。河豚毒素还有其他药理作用，是神经生理学和肌肉生理学研究的有用工具。 河豚毒素经腹腔注射对小鼠的LD50为8μg/kg。除由细菌产生的蛋白质毒素外，河豚毒素是属于毒性中最强的一类天然毒素，其毒性比氰化钠强1000倍。河豚鱼中毒的特点是发病疾速而剧烈，潜伏期10min至3h，一般先感觉手指、唇、舌等部位刺疼，然后出现呕吐、腹泻等症状，并有四肢无力发冷，以及言语不清血压体温下降，呼吸困难，最后死于呼吸衰竭。河豚毒素中毒一般不大可能得救，死亡率较高。 三、河豚毒素化学性质 河豚毒素主要有两种:河豚毒素和河豚酸。0.5mg河豚毒素就可以毒死一个体重为70kg的人。 河豚毒素系无色针状晶体，微溶于水，易溶于稀乙酸，对热稳定，于100?温度下处理24h或与120?下处理20至60min可使毒素完全受到破坏。盐腌、热嗮都不被破坏。 分子式CHNO，分子量为319，无色棱柱状晶体。对热不稳定。难溶于水，可溶于弱酸111738 的水溶液。TTX 是发现最早的小分子海洋毒素,毒性极大,LD50为8. 7μg/ kg ,是氰化钠的1000 倍。河豚毒素怕碱，在碱性水溶液中，其结构迅速受到破坏，毒性很快就会消失。将河豚毒素加热到200?，它就会变黑，但不分解，超过220?炭化，其毒性很快就会消失。 河豚毒素不溶于水，因此在生产过程中可以用纯水洗去其中的杂质。但是，若从河豚内脏中提取河豚毒素，则又必须通过水来浸泡。只要浸泡一个小时，河豚毒素就能从内脏中流到水里。根据这个原理，人们应该将“拼死吃河豚”改为“拼洗吃河豚”。 TTX是一种氨基全氢喹唑啉(Aminoperhydroquinazoline)型化合物，为白色结晶，无臭无味，微溶于水，不溶于有机溶剂;对酸作用稳定，对碱极不稳定;没有确定熔点，220?以上炭化。TTX的结构特征是有1个碳环，1个胍基，6个羟基，在C-5和C-10位有一个半醛糖内酯连接着的分开的环。在胰液酶、唾液淀粉酶、乳化酶、糖转化酶等酶类存在下不分解。只溶于酸性水或醇溶液，在碱水溶液中易分解，在5%氢氧化钾溶液中于90-100?下可分解成黄色结晶2-氨基-羟甲基-8-羟基-喹唑啉。它是相当特殊的一种有机化合物，分子内的胍基与氮原子是质子化的，正羰酸也离解为阴离子，所以河豚毒素是以内盐形式存在。在室温下用50 g/L的氢氧化钡处理河豚毒素可得脱水河豚毒素—由pKa1值为2.5的羧基和pKa2值为10.9的 胍基组成的两性离子化合物，其可在水中与一分子的溴完全反应产生河豚酸。河豚毒素在酸中也能部分异构化为脱水河豚毒素，从而影响对河豚毒素的提取纯度。所以，河豚毒素制剂经过长时间放置可降解。至于河豚酸是否具备毒性尚有争议。因此，在生物代谢过程[中，脱水和脱氧过程会降低毒性，而加氧能够使毒性增强。 四、提取和作用原理 河豚毒素的提取工艺十分复杂。据有关资料介绍，每100公斤河豚卵只能提取1克粗品，而将粗品纯化成精品，其损耗率将是50%。由于河豚毒素得率低微，故全球每年的河豚毒素产量很少，有不少报道说每年只产25克。 工艺流程 河豚卵巢?水提取?除蛋白质?离子交换?脱色?活性炭吸附?浓缩?精制?结晶 操作要点 1(原料:取新鲜河豚鱼卵巢，如不及时使用可保存在福尔马林溶液中，卵巢需磨碎才能加工。 2(提取:碎卵巢加水浸泡4天，过滤后，再加水泡1天。反复三次，三次滤液合并，浸泡时需在0--5?低温下进行。 3(除蛋白质:滤液中有许多水溶性蛋白质需去除，可用加热法处理。将滤液加热至沸，并维持1 0分钟，使蛋白质产生热变性析出滤去，取滤液。 4(离子交换:要提纯毒素，需用离子交换方法将一些杂质去除，河豚毒素带正离子，所以可用弱酸性阳离子交换树脂进行交换，当树脂交换饱和后(用小白鼠跟踪进行毒性测定)，停止上柱，分别用水及10,醋酸洗脱交换柱，并分别收集洗脱液。 5(脱色:洗脱液毒性已很强，但色泽较深，需脱色处理。用醋酸调节洗脱液的pH至4--6，加3,活性炭，加热至80?，然后过滤，得无色澄清滤液。 6(吸附:为了得到更纯的毒素，需进一步提纯。用硬脂酸减活处理后的活性炭柱将毒液吸附(滤液需用8,氨水调节pH至9)，吸附饱和后再用含0.5,醋酸的20,乙醇溶液洗脱，洗脱至最后洗脱液无毒为上，收集洗脱液。 7(浓缩:洗脱液于70?以下减压浓缩，蒸发去除水分和乙醇，此时液体呈淡黄色油状 8(粗品:用5,醋酸溶液，再用8,氨水调:节pH至9，并放置在低温处24小时，析出的白色固体即为河豚毒素粗品。 9(结晶:如想继续提取精品结晶，则将上道工序反复进行溶解、沉淀，几次后再将析出的沉淀加等量苦味酸混合，加入少量水加热溶解、过滤，低温析出结晶，此工序也要反复3--4次，才能得到较纯的结晶状河豚毒苦味酸盐，将此产品加热水溶解，并滴人10,氨水调pH至9，冷却、结晶、洗涤，再加10,醋酸溶解，用氨水调pH，直至结晶析出。最后将晶体干燥，得到纯品。 [河鲀毒素毒理作用的主要表征是阻遏神经和肌肉的传导。除直接作用于胃肠道引起局部刺激症状外，河鲀毒素被机体吸收进入血液后，能迅速使神经末梢和神经中枢发生麻痹，继而使得各随意肌的运动神经麻痹;毒量增大时会毒及迷走神经，影响呼吸，造成脉搏迟缓;严重时体温和血压下降，最后导致血管运动神经和呼吸神经中枢麻痹而迅速死亡。TTX可选择性地抑制可兴奋膜的电压，阻碍Na+通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导，使神经肌肉丧失兴奋性。此后，多数研究工作都是围绕着TTX阻断可兴奋组织的Na+通道而展开。河鲀对TTX具有抵抗力和免疫性。 五、检测方法 河纯毒素在发现之初人们就在不断寻找其更好的检测方法。河鲀毒素检测常用的方法有小鼠检测法、酶联免疫法、薄层色谱法、柱后衍生高效液相色谱检测法、气质联用法和液质联用等。国外较多地采用气质联用、液质联用的方法检测河鲀毒素。 小鼠生物法(以30分钟内将一体重20克小鼠致死所用河纯毒素的量为一鼠单位)是最常用、最直观的检测方法，通过小鼠死亡前所呈现出的典型的河鲀毒素中毒症状，可迅速地将河鲀毒素与其它致死性物质区分开。免疫酶技术是20世纪60年代发展起来的新的免疫测定法，它是抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理的有机结合。高效液相色谱是、制备领域应用最为广泛也最为成熟的技术之一，它具有分离效率高、分辨率好及速度快等特点。 六、医学作用 由于河毒素独特的作用机制，使人们对其结构产生了浓厚兴趣。因此，通过对毒素分子母核的研究，有可能人工合成一系列控制神经肌肉细胞膜作用机制的药物。临床上，河毒素针剂在使用上受到一定限制，但在临床上可有以下几方面的用途:(1)镇痛，含TTX的注射剂曾用于治疗神经痛、癌痛、关节痛、肌肉痛、麻疯痛以及因创伤、挫伤、烧伤引起的疼痛。(2)局部麻醉，由于河毒素的麻醉作用比一般的局部麻醉药要强上万倍，故国外已有河毒素与普通麻醉药配伍而作为麻醉药的专利出售。(3)镇静，可用作瘙痒镇静剂，对于皮肤瘙痒症、疥癣、皮炎等可以止痒，进而促使其痊愈。也可用作呼吸镇静剂，治疗气喘和百日咳等症。(4)镇痉，作为解痉剂，用于松弛肌肉痉挛、胃痉挛和其它痉挛，对破伤风痉挛的解痉效果尤为显著。(5)降压，河毒素有独特的降血压效果可以考虑在临床上用来抢救高血压患者。(6)抗心律失常，河毒素有明显的抗心律失常活性，若与其他抗心律失常药物配用，可显著增强对心律失常的疗效。(7)其它，作尿意镇静剂，用于遗尿症的治疗，有一定的疗效。 河鲀毒素(Tetrodotoxin，TTX)是氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，可高选择性和高亲和性地阻断神经兴奋膜上钠离子通道。河鲀毒素是小分子量、非蛋白质的神经性毒素，其毒性比剧毒的氰化钠还要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。河豚毒素对肠道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神经末梢和神经中枢，阻碍神经传导，从而引起神经麻痹而致死亡。其具体作用机制是通过与钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动作电位，导致与之相关的生理活动的阻碍，主要是神经肌肉的麻痹，河鲀毒素对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周神经共同作用的结果。河鲀毒素对热稳定，盐腌或日晒均不能使其破坏，只有在高温加热30min以上或在碱性条件下才能被分解。220?加热20-60min可使毒素全部破坏。TTX中毒潜伏期很短，短至10-30min，长至3-6h发病，发病急，如果抢救不及时，中毒后最快的10min内死亡，最迟4-6h死亡。河鲀毒素的化学性质稳定，一般烹调手段难以破坏。中毒后也缺乏有效的解救措施。河豚毒素纯品的国际市场价每克可达21万美元，具有极高商业价值。 参考文献 1(骆和东，贾玉珠，朱宝平.固相萃取-超过滤-液相色谱/质谱联用法测定织纹螺中的河豚毒素[J]. 色 谱，2007，25(6) 2(伍汉霖，陈永豪，牟阳，等.中国有毒及药用鱼类新志[M]. 北京:中国农业出版社，2002 3(杨平，林怡芳.海洋生物毒素研究现状[J]. 国外医学:卫生学分册，1997，24 4(徐金传.理性看待河豚消费[J]. 渔业致富指南，2007(6) 5(杜晋. 河豚毒素的药理[J]. 中国海洋药物，1998(1-2) 6( Hwang D F.Research on marine toxins in taiwan[J]. Toxin Rev，2003，22(4) 7(GB/T 5009.206-2007，鲜河鲀鱼中河鲀毒素的测定[S].北京:中国出版社，2008 8(GB/T 23217-2008，水产品中河鲀毒素的测定液相色谱荧光检测法[S].北京:中国标准出版社，2009 9(苏锦祥，李春生.中国动物志硬骨鱼纲鲀形目海蛾鱼目喉盘鱼目鱇鮟目[M].北京:科学出版社，2002 10(程苏云，丛黎明，蒋贤根，等.浙江省沿海河豚鱼生态分布和毒素检测[J]. 浙江预防医学，2003，15(10)