【word】 千里追风活络油微生物限度检查方法的验证

【word】 千里追风活络油微生物限度检查方法的验证 千里追风活络油微生物限度检查方法的验 证 2011年7月中 July2011 第3卷第20期 Vl-3No.2O 中国中医药咨讯 JournalofChinaTradifionalChineseMedicineInformation?’. 千里追风活络油微生物限度检查方法的验证 黄启红农云军苏流坤曾泳而 (中国广州测试中心广东省测试分析研究所.广东广州,510070) 【摘要】目的:建立适合千里追风活络油微生物限度检查的方法.方法:参照2010年版《中国药典(一部)》,采用薄膜过 滤法对千里追风活络油进行微生物限度检查方法学验证.结果:满足《中华人民共和国药典》2010版验证试验的基本要求.在3 次独立的平行试验中,常规法对5株试验茵(大肠埃希氏菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠茵和黑曲霉)的回收率均 <70%,薄膜过滤法回收率均>70%.结论:薄膜过滤法可作为千里追风活络油的常规微生物限度检查方法. 【关键词】千里追风活络油;微生物限度;方法验证;薄膜过滤;回收率 ValidationofmicrobiallimittestsforQianlizhuifeng0il HuANGQi—hong,NONGYun-jun,SuLiu-kun,ZENGYong-er (ChinaNationalAnalyticalCenter,Guangzhou,GuangdongInstituteofAnalysis,GuangdongGuangzhou510070,China) 【Abstract】 ObjectiveToestablishamethodformicrobiallimittestOfQianlizhuifong0il.MethodsAccordingtotheChinese Pharmacopoeia(edition2010,Vo1.I),themembranefiltrationmethodwasadoptedtoconductthemicrobiallimittestsforQianlizhuifengoil. ResultsThemethodcallpassthevalidationtestofChinesePharmacopoeia(edition2010,Vo1.I).Intheparallelexperimentof3independence, therecoveriesof5testedstrains(EscheHchiatoll,StaphylococusaUI”CUS,Bacillussubtilis,Cana~’daalhicansandAsper~llusniger)byroutine methodwerelessthan70%,whilebythemembranefiltrationmethodweremorethan70%.ConclusionThemembranefiltrationmethodcanbe usedinmicrobiallimittestforQianlizhuifengoilpreparationcontro1. 【Keywords】 Qianlizhuifengoff;Microbiallimittests;Validationofthemethod;Membranefiltration;Recoveryrate 千里追风活络油为中药外用制剂,它具有驱风,活络,活1.2.2.1细菌, 霉菌和酵母菌计数方法的验证 血,消肿,止痛等功能.根据《中华人民共和国药典》2010年试验组: 分别取I:10的供试液1mL和1mL的50,100 版微生物限度检查法有关规定?,在建立千里追风活络油微CFU/mL的大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白 生物限度检查法并对其验证过程中,发现该产品对细菌,霉色念珠菌和黑曲霉悬液加45?pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓 菌的生长有明显的抑制作用,通过对不同的实验方法和实验条件冲液100mL稀释后过滤,用200mL的pH7.0的无菌氯化钠蛋 的筛选,建立了适合千里追风活络油微生物限度检查的方法白胨缓冲液冲洗滤膜,每次50mL,边冲洗边振摇,过滤后将 1结果比较满意滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基 1.1与方法平板上,分别置30,35?培养48h和23—28?培养72h. 1.1.1材料菌液组:分别检测上述用到的大肠埃希菌,金黄色葡萄球 1.1.1.1供试品菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠菌和黑曲霉悬液的菌落总数. 千里追风活络油,规格20mIJ,瓶,由香港星洲药业有限公供试品对照组:分别取1:10的供试液1mL加45?pH 司提供.7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100mL稀释后过滤,用200mL 1.1.1.2仪器的pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次50mL, 脱卸式薄膜过滤器.微孔滤膜:孔径0.45m,尺寸50mm,边冲洗边振摇,过滤后将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养 使用前于121?20rain灭菌.基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上,分别置30--35oC培养48h和 1.1.1.3培养基及稀释剂23,28qC培养72h. 营养琼脂培养基,玫瑰红钠琼脂,营养肉汤等稀释剂对照组:依次取pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液.10mL,加1mL无菌聚山梨酯8O,分别加入大肠埃希菌,金 以上培养基均在有效使用期内的使用,由广东环凯微生物黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠菌和黑曲霉5种菌的 科技有限公司提供.菌悬液1mL(含5000,10000CFU/mL),加pH7.0的无菌氯化 1.1.1.4菌种钠蛋白胨缓冲液至10OraL混匀.分别取1mL,加入45?pH7.0 大肠埃希氏菌CMCC(B)44102第2代,金黄色葡萄球菌的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100mL稀释后过滤,用200mL的 CMCC(B)26003第4代,枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501第pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次50mL,边 3代,白色念珠菌CMCC(F)98001第2代,黑曲霉CMCC(F)冲洗边振摇,过滤后将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基 98003第3代,铜绿假单胞菌CMCC(F)第4代.和玫瑰红钠琼脂培养 基平板上,分别置3O,35?培养48h和 1.2实验方法及菌液制备方法23,28?培养72h. 参照2010年《中华人民共和国药典》版一部附录微生物限上述同样的方法做3个平行实验. 度检查法方法验证,简述如下.1.2.2-2控制菌检查方法的验证 1.2.1供试液制备参照细菌,霉菌和酵母菌计数方法薄膜过滤的方法进行验 取供试品10mL,加入1mL无菌聚山梨酯8O,加pH7.0证,程序按2010年《中华人民共和国药典》版一部附录微生物 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至1190mL振摇充分混匀,作为1:10限度检查法方法验证分别对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检 供试液.查方法的进行验证试验. 鉴于常规法对千里追风活络油进行测试,细菌,霉菌和酵母2结果 菌回收率均<70%,故必须建立另一种适合的方法对其进行测试.2.1薄膜过滤法回收率测定 1.2.2薄膜过滤法用薄膜过滤法测定大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽 ?8? 中国中医药咨讯 JoumalofChina1_raditionalChinoseMe,dicineInformation 2011年7月中 Julv2011 第3卷第2O期 V0l-3No.2O 孢杆菌,白色念珠菌和黑曲霉5个菌株的回收率,结果见1. 由表1可见,用薄膜过滤法的三次平行试验,稀释剂对照组和 试验组,5个菌株的三次平行实验回收率均可以达到70%,说 明用薄膜过滤法200mL冲洗液分4次冲洗是可以消除千里追风 活络油对细菌,霉菌和酵母菌的抑制作用的. 2-2控制菌验证结果 对铜绿假单胞菌检查方法的验证中,试验组培养后可见增 菌培养基混浊生长,平板菌落呈灰白色,扁平,无定形,周边 有扩散现象,表面湿润,菌落周边有蓝绿色素扩散.阴性对照 组培养后可见增菌培养基混浊生长,平板无菌落生长.上述实 验表明试验组检出铜绿假单胞,阴性对照组未检出大肠埃希茵. 对金黄色葡萄球菌检查方法的验证中,实验组培养后可见 增菌培养基混浊生长,平板菌落呈金黄色,圆形凸起,边缘整 齐,光滑湿润,周边有黄色环,菌落直径约O.71ram.阴性对 照组培养后可见增菌培养基混浊生长,平板无菌落生长.上述 实验表明试验组检出金黄色葡萄球菌,阴性对照组未检出大肠 埃希菌. 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌控制菌检查的方法验证结 果表明薄膜过滤法后,试验菌都能生长良好. 表1千里追风活络油细菌,霉菌和酵母菌回收率的测定(薄膜过滤法) 3讨论 药品微生物限度检查是非灭菌制剂不可缺少的重要必检项 目.检查之前,应对该药品建立细菌,霉菌及酵母菌计数方法 的验证脚,控制菌检查方法的验证,以确认所采取的方法适合 于该药品的微生物限度检查. 本次研究以中国药典2010版微生物限度检查法方法验证 作为依据,将5种阳性对照菌的回收率试验作为评价常规法和 薄膜过滤法的客观,确定了千里追风活络油的微生物限度 检查的方法.结果显示采用常规法,供试品对大肠埃希菌,金 黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠菌和黑曲霉的回收率 试验均<7O%;采用薄膜过滤法,供试品对大肠埃希菌,金黄色 葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验 均>70%.表明千里追风活络油对细菌,真菌都有较强的抑菌作 用,需采用薄膜过滤法.由于千里追风活络油中含有挥发油成 分,直接加入pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液产生分层,因此 加入聚山梨酯8O能使供试液分散均匀;同时研究发现聚山梨酯 80的加入量不宜太大,应以能使油剂乳化的最小量为适.笔者 曾对不同的加入量进行了验证,其结果是随着聚山梨酯8O加 入量的增加,细菌的回收率反而会降低,所以本品只加入了1mL 的无菌聚山梨酯8O来帮助乳化.另外,在供试液的制备和实 验操作过程供试液及冲洗液需在45?保温,增大其溶解度避 免滤膜堵塞,保证供试液顺利通过滤膜. 参考文献 [1】国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M】.北京:中国医 药科技出版社,2010:附录XIIIC微生物限度检查法. 【2】国家药典委员会.中华人民共和国药典(,部)【M】.北京:化学出 版社,2005:71. 【3】国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M】.北京:化学出 版社,2005:73. 令???c-?<>?0??<>??0?<>-<>,—-??--??—---C??????0-???0???0}-?—0—<>?<>.<>?<).—C0?《>?——-??C?—0??C?—;?-??-??<>???0-??????>-?<>??? (上接第17页) 【4】刘士趁.银杏叶提取物的成分及药理作用研究评析唧.实用中医内科 杂志,2008,7(22):85—87. [5]王淑霞.舒血宁注射液致过敏性休克1例[J].中国药物警戒,2009,6 (3):180. [6】于文源.305例药物不良反应的整理分析[J].中国现代药物应用, 2007,1(11):61.62. [7】张东华,董强波,董建敏.银杏叶提取物的化学成分,药理作用和临 床应用研究概况【J】.现代保健(医学创新研究),2007,4(12):35. [8]赵志茹,谢乾松,吴晓凤.银杏制剂的药理作用及临床应用研究进展 [J].中医药研究,2001,17(5):54-55. [9】杨茂春,杨哲.中药安全性评价与监护方法的探讨[J】.中国药物警戒, 2007,4(1):31. [10】杨君,黄仲义.我院184例药品不良反应回顾性分析[J].中国药 房,2005,16(6):455.