三白草和猕猴桃保肝降血糖作用的研究

三白草和猕猴桃保肝降血糖作用的研究 STUDY ON THE HEPATOPROTECTIVE AND HYPOGLYCEMIC EFFECTS OF SAURURI HERBA AND FRUCTUS ACTINIDIA CHINENSIS PLANCH A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Chinese Materia Medica By Yin Zhenhua Supervisor: Prof. Kang Wenyi and Senior engineer. Yu Xiuhua Date May, 2013 摘 要 本论文共有五章组成。第一章论述了三白草体外抗氧化活性以及三白草和猕猴桃体 外 α-葡萄糖苷酶抑制活性。第二章论述了三白草对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤的保 护作用。第三章论述了猕猴桃对四氧嘧啶诱导的小鼠糖尿病的降血糖作用。第四章对三 白草脂溶性成分进行研究。第五章综述了猕猴桃的生物活性。 第一章 三白草和猕猴桃体外生物活性研究 1. 采用清除二苯代苦味酰基自由基 (DPPH) 和 [2,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸)二氨盐]自由基 (ABTS) 两种方法评价三白草各提取部位的体外抗氧化活性，为体 内活性研究提供理论依据。研究发现，三白草正丁醇部位清除 DPPH 自由基的能力 (IC50=16.94 µg?mL-1) 比阳性对照 BHT 的清除能力 (IC50=18.71 µg?mL-1) 强，而弱于阳 性对照 PG 和 BHA 的清除能力 (IC50=0.89 和 3.2 µg?mL-1);清除 ABTS 自由基的能力 (IC50=12.90 µg?mL-1) 弱于阳性对照 PG 和 BHA 的清除能力 (IC50=0.81 和 1.95 µg?mL-1)， 比阳性对照 BHT (IC50=7.72 µg?mL-1) 的清除能力略弱;石油醚部位和乙酸乙酯部位清 除 DPPH 和 ABTS 自由基的能力均比阳性对照 PG、BHT 和 BHA 的清除能力弱。结果 表明，三白草正丁醇部位体外抗氧化活性较好。研究浓度与清除率的关系发现，3 个提 取部位对 DPPH 自由基和 ABTS 自由基的清除能力均有一定的浓度依赖性。 2. 通过建立体外 α-葡萄糖苷酶抑制模型，采用 96 微孔板法对三白草和猕猴桃各提 取部位体外 α-葡萄糖苷酶抑制活性进行筛选。结果显示，三白草和猕猴桃石油醚部位、 乙酸乙酯部位和正丁醇部位均有较好的体外 α-葡萄糖酶抑制活性，其中三白草乙酸乙酯 部位对 α-葡萄糖苷酶抑制活性最好 (IC50=122.7 µg?mL-1)，其次为石油醚部位和正丁醇 部位 (IC50=203.3 和 659.9 µg?mL-1);猕猴桃石油醚部位的 α-葡萄糖苷酶抑制活性最好 (IC50 =57.8 µg?mL-1) ， 其 次 为 乙 酸 乙 酯 部 位 (IC50=84.7 µg?mL-1) 和 正 丁 醇 部 位 (IC50=124.7 µg?mL-1)，各部位的抑制活性均远大于阳性对照阿卡波糖 (IC50=1103.01 I µg?mL-1)，且抑制率均与质量浓度呈正相关性，说明其抑制活性具有浓度依赖性。 第二章 三白草保肝作用研究 通过腹腔注射四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型，测定小鼠血清中 GOT 和 GPT 活 力以及肝脏匀浆液中 SOD 活力和 MDA 含量的变化，评价三白草石油醚部位和正丁醇 部位对小鼠急性肝损伤的保护作用。结果显示，石油醚部位和正丁醇部位均能显著的降 低血清中 GOT 和 GPT 的活力，提高肝脏匀浆液中 SOD 的活力，降低 MDA 的含量， 增强机体对抗自由基的能力。可见，石油醚部位和正丁醇部位具有一定的肝脏保护作用， 其保肝作用与其增强机体的抗氧化能力有关。 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 通过尾静脉注射四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病模型，测定小鼠血糖水平，肝糖元、血清 中 TG、TC 和 MDA 的含量以及血清中 SOD 活力的变化，评价猕猴桃石油醚部位、乙 酸乙酯部位和正丁醇部位对小鼠糖尿病的影响。结果显示，猕猴桃 3 个部位均有一定的 降血糖，调节脂质代谢和增强抗氧化防御体系的作用，对糖尿病有一定的疗效。其中石 油醚部位低剂量组和乙酸乙酯部位高剂量组均能显著性的降低餐后血糖和空腹血糖，乙 酸乙酯部位中剂量组和正丁醇部位低剂量组降低餐后血糖效果较好，正丁醇部位中剂量 组降低空腹血糖效果较好;石油醚部位高剂量、乙酸乙酯部位三个剂量组和正丁醇部位 低剂量组均能显著性升高肝糖元含量;3 个部位均能显著性降低 TC 的含量，石油醚和 正丁醇部位高低剂量组以及乙酸乙酯部位高剂量组均能够显著性降低 TG 含量;3 个部 位各剂量组均能显著升高 SOD 水平，石油醚部位和正丁醇部位各剂量组以及乙酸乙酯 部位高剂量组均能显著性降低 MDA 含量。可见，猕猴桃具有一定的降血糖作用，机制 与其促进肝糖元合成，抑制肝糖元分解，纠正脂质代谢紊乱和增强机体抗氧化防御体系 有关。 II 第四章 三白草脂溶性成分研究 采用气相质谱联用技术 (GC-MS)，分析了三白草石油醚部位的脂溶性成分。从石 油醚部位中共鉴定了 15 个化合物，占脂溶性成分总峰面积的 43.77%，主要含有呋喃类 (13.51%)、 醇 (6.42%)、醛 (4.54%)、脂肪酸 (6.4%) 及其甲酯 (4.57%) 等类型的化学 成分，主要脂溶性成分为[2S-(2α,3ß,4α,5ß)]-2,5-双(3,4-二甲氧基苯基)四氢-3,4-二甲基- 呋喃 (10.97%)、1,4-二氢-1-二苯甲烯基-5-羟基-4-氧代萘 (6.93%)、棕榈酸 (3.51%) 和 ß-谷甾醇 (3.45%) 等。 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 从抗癌、降血脂、抗突变和畸变、解毒、抗氧化、保肝、增强免疫功能和促进肠道 (Actinidia chinensis Planch) 果实的生物活性。 运动等多方面介绍猕猴桃 关键词:三白草，猕猴桃，抗氧化活性，α-葡萄糖苷酶抑制活性，急性肝损伤，糖尿病， 脂溶性成分 III ABSTRACT This dissertation is composed of five chapters. The first chapter discussed the antioxidant capacity of Saururi herba and α-glucosidase inhibitory activity of Saururi herba and Fructus Actinidia chinensis Planch in vitro. The second chapter included the hepatoprotective effect of Saururi herba on acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice. The third chapter studied the hypoglycemic effect of Fructus A.chinensis on alloxan-induced diabetes in mice. The fourth chapter analysed the fat-soluble components in Fructus S.chinensis by GC-MS. The fifth chapter summarized the biological activity of Fructus A.chinensis . Chapter ? Bioactivities of Saururi herba and Fructus Actinidia chinensis Planch in virto 1. Antioxidant activity of different extracts of Saururi herba was evaluated by scavenging 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical and [2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulphonic acid] diamonium salt (ABTS) radical in vitro, in order to provide theoretical basis for activity study in vivo. The study discovered that n-BuOH extract from Saururi herba showed higher DPPH radical scavenging activity (IC50=16.94 µg?mL-1) than that of BHT (IC50=18.71 µg?mL-1) as positive control, and lower that of PG and BHA (IC50=0.89 and 3.2 µg?mL-1) as positive controls. ABTS radical scavenging activity (IC50=12.90 µg?mL-1) was much lower than that of PG and BHA (IC50=0.81 and 1.95 µg?mL-1), and slightly lower than that of BHT (IC50=7.72 µg?mL-1). Petroleum ether extract and EtOAC extract showed V lower DPPH and ABTS radical scavenging activity than that of PG, BHT and BHA, which showed that n-BuOH extract had good antioxidant activity. To study the relationship between concentration and scavenging rate, we discovered that the scavenging activity of DPPH and ABTS radical was concentration dependent. 2. By establishing α-glucosidase inhibitory model in vitro, the α-glucosidase inhibitory activities of different extracts from Saururi herba and Fructus A.chinensis were screened in 96-well plates, and the relationship between inhibitory rate and extract concentration was also studied. Results showed that petroleum ether, EtOAC extract and n-BuOH extract from Saururi herba and Fructus A.chinensis had good inhibitory activities. EtOAC extract from Saururi herba had the highest inhibitor activity (IC50=122.7 µg?mL-1), and followed by petroleum ether extract and n-BuOH extract (IC50=203.3 and 659.9 µg?mL-1). Petroleum ether extract from Fructus A. chinensis had the highest inhibitor activity (IC50=57.8 µg?mL-1), and followed by EtOAC extract and n-BuOH extract (IC50=84.7 and 124.7 µg?mL-1). The activities were higher than that of Acarbose (IC50=1103.01 µg?mL-1) as positive control, and α-glucosidase inhibitory activity had positive correlation with mass concentration, their activities were concentration dependent. Chapter ? Hepatoprotective effect of Saururi herba on liver By intraperitoneal injection carbon tetrachloride to establish acute liver injury model in mice, the levels of GOT, GPT, SOD and MDA were detected to evaluate protective effects of petroleum ether extract and n-BuOH extract from Saururi herba. Results showed that petroleum ether extract and n-BuOH extract could significantly reduce the levels of GOT and GPT in mice serum, significantly increase the level of VI SOD and reduce the level of MDA in liver homogenate, enhanced antioxidative capacity, which showed that petroleum ether extract and n-BuOH extract were useful to protect CCl4-induced acute liver injury and hepatoprotective mechanisms was related to improve the antioxidant capacity of liver cells. Chapter ? Hypoglycemic effect of Fructus Actinidia chinensis Planch The diabetic mouse model were established by intravenous injection of alloxan, the levels of blood sugar, hepatic glycogen and TG, TC, MDA and SOD in serum were detected to evaluate hypoglycemic effects of petroleum ether extract, EtOAC extract and n-BuOH extract from Fructus A.chinensis. Results showed that the three extracts had the effects of reducing blood sugar, regulating lipid metabolism and enhancing antioxidant defense system, which showed that A.chinensis had certain curative effect on diabetes. Low dose group of petroleum ether extract and high dose group of EtOAC extract could significantly decrease postprandial blood glucose and fasting blood glucose, medium dose group of EtOAC extract and low dose group of n-BuOH extract had better effects on decreasing postprandial blood glucose, medium dose group of n-BuOH extract had better effects on decreasing fasting blood glucose. High dose group of petroleum ether extract, three dose groups of EtOAC extract and low dose group of n-BuOH extract could significantly increase the content of liver glycogen. Three extracts could significantly increase the content of TC, high and low dose goups of petroleum ether extract and n-BuOH extract, high dose group of EtOAC extract could significantly increase the content of TG. Three dose groups of the three extracts could significantly increase the level of SOD, three dose groups of petroleum ether extract and n-BuOH extract and high dose group of EtOAC extract could significantly decrease the content of MDA. VII From the above results could be seen, Fructus A.chinensis presented anti-diabetic effect, the mechanism was probably concerned with promoting hepatic glycogen synthesis and inhibiting excessive degradation, rectifying the derangement in lipide metabolism and strengthening antioxidant defense system. Chapter IV Analysis of fat-soluble components in Saururus chinensis (Lour.) Baill by GC-MS The fat-soluble components of petroleum ether extract from S.chinensis were analyzed by GC-MS. 15 compounds from petroleum ether extract were identified, accounting for 43.77% of the total fat-soluble components. Furans (13.51%), alcohol (6.42%), aldehydes (4.54%), fatty acids (6.4%) and its methyl esters (4.75%) were dominant in the fat-soluble components, The main compounds were [2S-(2α,3ß,4α,5ß)]-2,5-bis(3,4-dimethoxyphenyl)tetrahydro-3,4-dimethyl-Furan (10.97%), 4-dihydro-1-(di -phenylmethylene)-5-hydroxy-4-oxo-Naphthalene (6.93%), n-Hexadecanoic acid (3.51%) and ß-Sitosterol (3.45%). Chapter V Research progress of biological activity of Fructus Actinidia chinensis Planch The biological activity research progress of anticancer effect, antihypeflipidemia effect, resistance mutation and distortion, detoxication, antioxident activity, hepatoprotective effect, enhancing immune function and boosting intestinal movement were summarized. VIII KEY WORDS: Saurururi herba, Fructus Actinidia chinensis Planch, antioxidant activity, α-glucosidase inhibitory activity, acute liver injury, diabetes, fat-soluble component IX 目 录 摘 要 ........................................................................................................................................... I ABSTRACT ............................................................................................................................. V 第一章 三白草和猕猴桃体外生物活性研究 .......................................................................... 1 第一节 三白草抗氧化活性研究 .......................................................................................4 1.1.1 材料与仪器 ........................................................................................................ 4 1.1.2 实验方法 ............................................................................................................ 4 1.1.3 结果 .................................................................................................................... 5 1.1.4 讨论 .................................................................................................................... 7 1.1.5 结论 .................................................................................................................... 8 第二节 三白草和猕猴桃 α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 ..................................................9 1.2.1 材料与仪器 ........................................................................................................ 9 1.2.2 实验方法 ............................................................................................................ 9 1.2.3 结果 .................................................................................................................. 10 1.2.4 讨论 .................................................................................................................. 12 1.2.5 结论 .................................................................................................................. 13 参考文献 ...........................................................................................................................14 第二章 三白草保肝作用研究 ................................................................................................ 19 2.1 概述 ............................................................................................................................19 2.2 材料与仪器 ................................................................................................................20 2.2.1 实验动物 .......................................................................................................... 20 2.2.2 样品 .................................................................................................................. 20 2.2.3 试剂 .................................................................................................................. 20 2.2.4 仪器 .................................................................................................................. 21 2.3 实验方法 ....................................................................................................................21 2.3.1 造模方法 ........................................................................................................... 21 XI 2.3.2 分组方法 .......................................................................................................... 21 2.3.3 指标测定方法 .................................................................................................. 21 2.3.4 数据处理 .......................................................................................................... 22 2.4 结果 ............................................................................................................................22 2.4.1 三白草不同部位对急性肝损伤小鼠血清中 GOT 和 GPT 影响 .................. 22 2.4.2 三白草不同部位对急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中 MDA 和 SOD 影响..... 23 2.5 讨论 ............................................................................................................................25 2.6 结论 ............................................................................................................................27 参考文献 ...........................................................................................................................28 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 ............................................................................................ 31 3.1 概述 ............................................................................................................................31 3.2 材料与仪器 ................................................................................................................32 3.2.1 实验动物 .......................................................................................................... 32 3.2.2 样品 .................................................................................................................. 32 3.2.3 试剂 .................................................................................................................. 32 3.2.4 主要仪器 .......................................................................................................... 32 3.3 实验方法 ....................................................................................................................33 3.3.1 造模及分组方法 .............................................................................................. 33 3.3.2 指标测定方法 .................................................................................................. 33 3.3.3 数据处理 .......................................................................................................... 33 3.4 结果 ............................................................................................................................33 3.4.1 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血糖的影响 .......................................... 33 3.4.2 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠肝糖元的影响 ...................................... 36 3.4.3 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血脂水平的影响 .................................. 38 3.4.4 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠脂质过氧化水平的影响 ...................... 40 3.5 讨论 ............................................................................................................................42 3.6 结论 ............................................................................................................................44 参考文献 ...........................................................................................................................46 第四章 三白草脂溶性成分研究 ............................................................................................ 49 XII 4.1 概述 ............................................................................................................................49 4.2 材料与仪器 ................................................................................................................49 4.2.1 植物来源 .......................................................................................................... 49 4.2.2 仪器 .................................................................................................................. 49 4.3 实验方法 ....................................................................................................................49 4.3.1 样品准备 .......................................................................................................... 49 4.3.2 GC-MS 分析条件 ............................................................................................. 50 4.3.3 化合物检索 ...................................................................................................... 50 4.4 结果 ............................................................................................................................50 4.5 讨论 ............................................................................................................................52 参考文献 ...........................................................................................................................53 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 ........................................................................................ 55 5.1 抗癌作用 ....................................................................................................................55 5.2 降血脂作用 ................................................................................................................56 5.3 抗突变和畸变作用 ....................................................................................................56 5.4 解毒作用 ....................................................................................................................57 5.5 抗氧化和衰老作用 ....................................................................................................58 5.6 保肝作用 ....................................................................................................................58 5.7 增强免疫功能的作用 ................................................................................................59 5.8 促进肠道运动的作用 ................................................................................................60 5.9 结语 ............................................................................................................................60 参考文献 ...........................................................................................................................61 结 论 ........................................................................................................................................ 63 论文创新点 .............................................................................................................................. 65 硕士期间发表的论文 .............................................................................................................. 67 致 谢 ........................................................................................................................................ 69 XIII 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 第一章 三白草和猕猴桃体外生物活性研究 在正常的机体代谢过程中，细胞会受到高压氧、高能辐射、药物 (如抗癌剂等)、 烟雾和光化学空气污染物等作用，这些会刺激细胞产生氧自由基，如超氧阴离子、过氧 化氢、氢氧根和一氧化氮等氧自由基。机体内存在多种抗氧化防御体系，人体内的氧自 由基处于动态平衡，而且适量的氧自由基存在是维持机体正常代谢必不可少的[1]，同时 氧自由基与各种重要的人类疾病的发病机制及其涉及的氧化应激等有关，过多的氧自由 基可以通过攻击生命大分子，导致蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化、碳水化合物和核 酸损伤，参与机体退化或病理过程，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤、糖尿 病、动脉粥样硬化等恶性疾病的重要原因[2-4]。 目前，众多植物中都存在清除氧自由基的抗氧化性功能因子，包含黄酮类、原花青 素类、生物碱类、维生素、植物激素和吲哚衍生物等，这些物质可抑制氧化的过程和化 学致癌的发生[5]，但是其清除自由基的作用机制不同，如多糖，作为免疫调节剂，通过 增强机体的免疫功能和基团对自由基的清除能力和抗氧化能力，而表现出抗氧化和抗衰 老作用[6]，如蘑菇多糖[7];黄酮类化合物通过与?O2-反应阻断其他类自由基的进一步生 成，与金属离子 (如 Cu2+等) 多酚类化合物螯合，避免氧自由基特异与其结合共同攻击 DNA 碱基;还可以与脂质过氧基 (ROO?) 反应阻断脂质过氧化过程，显示出明显的抗 氧化特性[8-9];酚类由于结构中的羟基与苯环直接相连，是极好的氢或电子供体，其形 成的酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置，比较稳定，不 会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化，所以是很好的抗氧化剂[10]，如花椒总 多酚[11];类胡萝卜素是具有多个共轭双键的萜烯基团类化合物，如 β-胡萝卜素、番茄 红素和虾青素，主要通过电子转移途径、自由基加成途径或者两条途径的结合与含氧自 由基反应将其清除。生物碱作为活性氧猝灭剂，通过与 O2 碰撞，本身获得能量而使 1O2 失活转变为 3O2 [12]，如君子兰总生物碱[13];维生素及其衍生物，既是食品营养素，又可 作为抗氧化剂。 近年来为了保护生物大分子免受氧自由基攻击，抑制活性氧反应产物导致的对生物 体的损伤，已开发和研究了许多天然抗氧化剂和合成抗氧化剂，用于预防和治疗复杂的 1 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 疾病，如动脉粥样硬化、中风、阿尔茨海默氏病、糖尿病和癌症等。 目前，文献报道的有关从植物中筛选抗氧化剂的方法很多，但是主要基于以下 3 种 原理:自由基清除能力、氧化剂还原能力和抗脂质过氧化能力。其中清除自由基能力的 检测方法主要是通过检测清除 DPPH 自由基、ABTS 自由基、?OH-自由基、超氧阴离子 自由基和氧自由基的能力，来评价被测物的抗氧化活性，此外，还有总自由基捕获抗氧 化参数法和 DMPD?+法;氧化剂还原能力的检测方法有铁离子还原能力 (FRAP) 和环伏 安法;抗脂质过氧化能力的检测方法有硫代巴比妥酸法 (TBARS)、共轭二烯氢过氧化 物法、过氧化值法和硫氰酸铁法。对于测定具体某一被测物的抗氧化活性，由于抗氧化 反应机制的多样性和复杂性，加上天然抗氧化剂往往具有多功能性，如果以一种抗氧化 作用机理为主的方法进行测定时，其抗氧化能力就决定其测定体系氧化条件，而不同的 方法体系氧化条件不同，可能影响氧化反应动力学。因此，应至少使用两种不同的测定 方法[14]。本课题组利用清除 DPPH 自由基和 ABTS 自由基两种方法，测定和评价三白 草的抗氧化活性。 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服 降糖药物。其作用机制是通过可逆性抑制位于小肠刷状缘膜上皮细胞的 α-葡萄糖苷酶的 活性，从而延迟多糖、双糖转化为可吸收的葡萄糖，减缓餐后血糖的升高[15-16]。目前， 合成的 α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇是最为常用的三种降 糖药物，已被广泛用来降低餐后高血糖，由于存在价格高、副作用多和毒副作用较大等 危害，因此，从天然产物中筛选高效的、安全的 α-葡萄糖苷酶抑制剂具有广泛的市场前 景，是 II 型糖尿病治疗以及降糖保健食品开发的研究热点。目前，从植物中筛选的 α- 葡萄糖苷酶抑制剂结构类型多样化，有黄酮及其苷类、多酚、三萜及其苷类、生物碱、 肽类、脂类和酸类等，如黄芩素、齐墩果酸、香草酸、槲皮素和鸭嘴花碱等。一些中草 药的提取物也具有很好的抑制 α-葡萄糖苷酶的作用，如滇丁香干燥枝提取物，乙酸乙酯 部分有较高的抑制活性，主要活性成分为五环三萜和香豆素类化合物[17]，连翘叶乙酸乙 酯提取物，活性成分为槲皮素、(-)-松脂素、(+)-松脂素和熊果酸，分别为黄酮类、香豆 素类和萜类化合物[18];大豆种子提取物，活性成分为异黄酮[19];山茱萸干燥果肉提取 物等[20]。 α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型有:以 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物的酶 抑制剂筛选模型[21]、以淀粉、蔗糖、麦芽糖为底物的酶抑制剂筛选模型[22]、固化酶筛 2 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 选模型[23]、高通量筛选模型[24]、Caco-2 细胞筛选模型[25]。此外，许多基于上述筛选模 型衍生出来的新的筛选方法也相继被报道[26-27]。其中，以 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷 为底物的酶抑制剂筛选模型是建立最早、最经典的筛选模型，具有快捷、简单的优点; 高通量筛选模型是近几年才发展起来的体外筛选模型;Caco-2 细胞筛选模型是几种筛 选模型中最能直接反映被测物对人体小肠 α-葡萄糖苷酶抑制作用的模型。本课题组以 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物，建立了 96 微孔板法的高通量筛选 α-葡萄糖苷酶抑 制剂模型，筛选和评价三白草和猕猴桃对 α-葡萄糖苷酶抑制的活性。 三白草 (Saurururi herba) 为三白草科植物三白草 Saururus chinensis (Lour.) Bail.的 干燥地上部分，性甘、寒，味苦，归肺、膀胱经，具有利尿消肿，清热解毒之功能，用 于水肿，小便不利，淋沥涩痛，带下;外治疮疡肿毒，湿疹[28]。国内外研究发现其具有 抗炎[29-30]、降血糖[31-34]、利尿、抗氧化[35-37]、抗菌、保肝[38-39]和解毒等药理作用。 猕猴桃 (Fructus Actinidia chinensis Planch) 为猕猴桃科植物猕猴桃 (Actinidia chinensis Planch) 的果实，又名藤梨、猕猴梨、羊桃等，生于山地林间或灌丛中，常缠 绕在他物上。分布于陕西、江苏、安徽、浙江、江西、福建、四川、贵州、云南等地， 味酸、甘，性寒。归胃、肝、肾经。具有解热、止渴，健胃，通淋之功能。主治烦热、 消渴，肺热干咳，消化不良，湿热黄疸，石淋，痔疮[40]。猕猴桃果中富含挥发性成分[41-43]、 有机酸[44]、黄酮[45]、猕猴桃碱、多种维生素、多糖及多种人体必需的氨基酸和微量元 素等多种化学成分;药理研究表明，其具有降血脂[46-47]、抗脂质过氧化[48-49]、拮抗细胞 毒性[50]、抗突变[51-52]、保肝[53]、防癌[54]、提高免疫力[55]等多方面的药理活性，具备了 药食同用的功能。 国内外对三白草抗氧化活性已有报道，但对其评价方法及评价的主要方面不尽相 同。Ahn BT 等[36]主要是通过测定低密度脂蛋白 (LDL) 来考察三白草地下部分的甲醇 -O-4′-type neolignan 和 Virolin 的抗氧化活性;Kang TH 等提取物中 Saururin A、8[37]主 要是测定三白草的地上部分中 3 个黄酮醇化合物对 1,1-二苯基-2-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基和超氧阴离子自由基的清除来考察其抗氧化活性。国内外对三白草的降血糖作用 已有报道，但主要集中在体内的研究，未见文献报道三白草和猕猴桃对 α-萄糖苷酶抑制 活性。本课题组利用清除 DPPH 自由基和 ABTS 自由基两种方法对三白草不同提取物体 外抗氧化活性进行研究，通过体外建立 α-葡萄糖苷酶模型，利用 96 微孔板法对三白草 和猕猴桃不同提取物对 α-萄糖苷酶抑制活性进行筛选。 3 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 第一节 三白草抗氧化活性研究 1.1.1 材料与仪器 1.1.1.1 植物来源 三白草于2010年7月采集于河南省新县大别山区，由河南大学中药研究所李昌勤副 教授鉴定为三白草科三白草属植物三白草Saururus chinensis (Lour.) Baill.的全草，标本 存于河南大学中药研究所。 1.1.1.2 样品提取 三白草全草阴干 (3.9 kg)，粉碎，用甲醇室温下浸泡 3 次，每次 3 d，合并滤液、 浓缩，得到甲醇总浸膏 (328.5 g)。总浸膏分散于水中，依次用石油醚 (PE)、乙酸乙酯 (EA) 和正丁醇 (BU) 进行萃取，减压浓缩得到三白草石油醚部位 (41.5 g)、乙酸乙酯 部位 (44.2 g) 和正丁醇部位 (53.4 g)。 1.1.1.3 试剂 DPPH (日本东京化成工业株式会社);Fe3+-三吡啶三哑嗪 (TPTZ;比利时Acros organics公司);[2,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐] (ABTS，美国Fluka公司); 二丁基羟基甲苯 (Butylated hydroxytoluene，比利时Acros organics公司，BHT);没食子 酸丙酯 (propyl gallate，比利时Acros organics公司，PG);丁基羟基茴香醚 (Butylated hydroxyanisole，比利时Acros organics公司，BHA);其它试剂均为分析纯。 1.1.1.4 仪器 旋转蒸发仪 (德国 Heidolph 公司);电子天平 (美国 Mettler-Toledo 公司); CS-H1 型混合器 (北京博励阳科技公司);UV-2000 型紫外可见分光光度计 (上海尤尼科仪器有 限公司)。 1.1.2 实验方法 1.1.2.1 DPPH 法 1.1.2.1.1 实验方法 按照文献[56-57]，取 0.1 mL 样品加入 3.5 mL DPPH 甲醇溶液 (0.06 mmol?mL-1)， 混匀，30 min 后测定 515 nm 处吸光度;同法取 0.1 mL 甲醇加入 3.5 mL DPPH 溶液混 匀测定吸光度。每份样品平行操作 3 次，取平均值。利用式 (1-1) 计算自由基清除率。 4 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 清除率(%) = [(Acontrol-Asample) /Acontrol]×100 (式 1-1) 式中，Acontrol 为 DPPH 本身在测定波长的吸收度，Asample 为样品对 DPPH 作用后的 吸收度数值 (除去样品自身吸收)。 1.1.2.1.2 样品筛选 首先对样品进行初筛，如果初筛抑制率高于 50%，则进入复筛。然后用 Origin6.0 软件处理，作浓度-抑制率图，计算样品的 IC50 值。 1.1.2.2 ABTS 法 1.1.2.2.1 实验方法 按照文献[58]，在734 nm处测定吸光度。每份样品平行操作3次，取平均值。利用 式 (1-2) 计算自由基清除率。 清除率(%) =[(AControl - ASample)/AControl ]×100% (式1-2) 式中AControl为2.85 mLABTS溶液与0.15 mL甲醇混合后的吸光度，ASample为2.85 mL ABTS溶液与0.15 mL样品混合后的吸光度。 1.1.2.2.2 样品筛选 首先对样品进行初筛，如果初筛抑制率高于50%，则进入复筛。然后用Origin6.0软 件处理，作浓度-抑制率图，计算样品的IC50值。 1.1.3 结果 按照上述方法和步骤，对三白草各提取部位的抗氧化活性进行研究，结果如表 1-1， 图 1-1 和图 1-2 所示。 表1-1 三白草不同提取部位的抗氧化活性 Table 1-1 The antioxidant activity of extracts from Saururi herba 提取部位 DPPH/IC50 (μg?mL-1) ABTS /IC50 (μg?mL-1) 石油醚部位 28.78 11.60 乙酸乙酯部位 33.14 10.16 正丁醇部位 16.94 12.90 PG 0.89 0.81 BHT 18.71 7.72 BHA 3.2 1.95 注:BHA、BHT 和 PG 为阳性对照。 Note: PG, BHT and BHT as positive control. 5 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 1.1.3.1 对 DPPH 自由基的清除作用 120 100 80 石油醚部位 60 乙酸乙酯部位 40 正丁醇部位 清除率(%) PG 20 BHA BHT 0 0 20 40 60 80 100 120 -1 质 量 浓 度 ( μg ? mL ) 图 1-1 质量浓度对 DPPH 自由基的影响 Fig. 1-1 Effect of mass concentration on DPPH free radical 50=16.94 μg?mL-1) 比阳性对 表 1-1 显示，正丁醇部位清除 DPPH 自由基的能力 (IC 照 BHT (IC50=18.71 μg?mL-1) 强，但远远弱于阳性对照 PG 和 BHA 的清除能力 (IC50= 0.89 和 3.2 μg?mL-1);石油醚部位和乙酸乙酯部位清除 DPPH 自由基的能力 (IC50=28.78 和 33.14 μg?mL-1) 均比阳性对照 PG、BHT 和 BHA 的清除能力弱。 表 1-1 表明:三白草 3 个部位和阳性对照 PG、BHA 和 BHT 对 DPPH 自由基的清 除能力顺序为:PG>BHA>正丁醇部位>BHT>石油醚部位>乙酸乙酯部位。 图1-1显示，在相同的质量浓度下，正丁醇部位对DPPH自由基的清除率大于阳性对 照BHT。而且，3个部位对DPPH自由基的清除率与其质量浓度均呈正量效关系，即随着 各部位质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率也增大。 6 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 1.1.3.2 对ABTS自由基的清除作用 120 100 80 石油醚部位 60 乙酸乙酯部位 正丁醇部位 40 PG 抑制率 (%) BHA 20 BHT 0 0 20 40 60 -1 质 量 浓 度 ( μg ? mL ) 图 1-2 质量浓度对 ABTS 自由基的影响 Fig. 1-2 Effect of mass concentration on ABTS free radical 表 1-1 显示，三白草 3 个部位清除 ABTS 自由基的能力 (IC50=11.60、10.16 和 12.90 μg?mL-1) 远弱于阳性对照 PG 和 BHA (IC50=0.81 和 1.95 μg?mL-1)，而与阳性对照 BHT 的清除能力 (IC50=7.72 µg?mL-1) 相接近。 表 1-1 表明:三白草 3 个部位和阳性对照 PG、BHA 和 BHT 清除 ABTS 自由基的 能力顺序为:PG>BHA>BHT>乙酸乙酯部位>石油醚部位>正丁醇部位。 图 1-2 显示，在浓度小于 21.09 µg?mL-1 时，石油醚部位对 ABTS 自由基的清除率 低于同一浓度下 BHT，但当浓度大于 21.09 µg?mL-1 时，比 BHT 的清除率高;乙酸乙酯 部位浓度小于 20.17 μg?mL-1 以下时，比同一浓度下 BHT 对 ABTS 自由基的抑制率低， 但在 20.17 μg?mL-1 以上时，比同一浓度下 BHT 清除率高。在实验的浓度范围内，质量 浓度在 3.04 μg?mL-1 时，3 个部位对 ABTS 自由基的清除率均较低，分别为 19.18%、 22.71%和 20.94%，且随着浓度增加，清除率也逐渐增大。当浓度增加到 24.95 μg?mL-1 时，对 ABTS 自由基的清除率分别增大到 93.06%、92.26%和 79.65%;在任何同一浓度 下，正丁醇部位清除 ABTS 自由基的能力均低于阳性对照 BHT。可见，三白草 3 个部 位对 ABTS 自由基的清除率与其浓度呈正比关系，即随着浓度增加，清除率也逐渐增大。 1.1.4 讨论 DPPH 方法用来测定样品清除 DPPH 自由基的能力，对酸性条件较敏感;ABTS 方 7 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 法用来测定样品清除 ABTS 自由基的能力，可以适用于酸性条件抗氧化活性的测定。尽 管两者都是基于清除自由基来测定样品的抗氧化活性，但是 ABTS 自由基与自由基清除 剂反应速度较 DPPH 方法快，原因是 DPPH 自由基相对稳定，主要与相对活泼的还原性 物质反应。 Ahn BT 等[36]主要是通过测定低密度脂蛋白 (LDL) 来考察三白草地下部分的甲醇 提取物中 3 个木脂素类成分:Saururin A、8-O-4′-type neolignan 和 Virolin 的抗氧化活性; Moon TC 等[59]三白草根醋酸乙脂提取物得到的中 2'-羟基-二氢愈创木酯酸及红楠素 D 能 抑制环氧合酶-2 和 5-脂氧合酶而显示具有抗氧化活性;Kang TH 等[37]主要是测定三白 草的地上部分中 3 个黄酮苷化合物对 1,1-二苯基-2-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基和超氧 阴离子自由基的清除来考察其抗氧化活性。三白草水提物对离体 HepG2 细胞吸收氧自 由基的能力、金属螯合能力以及细胞内的抗氧化活性，此结果表明，三白草提取物有可 能作为抗氧化的功能性食品[60]。木脂素、2'-羟基-二氢愈创木酯酸及红楠素 D 和黄酮苷 分别属于低、中和高极性部位的成分。而本实验研究表明，三白草石油醚部位、乙酸乙 酯部位和正丁醇部位均有一定的清除 DPPH 和 ABTS 自由基的能力，推测这些化合物可 能是石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的活性成分。另外还可以看出，植物的抗 氧化活性与提取溶剂的种类和极性有关，也与抗氧化活性测定体系有关[61]。此外，也可 能与三白草各个部位中所含的抗氧化成分的种类及结构有关，故在不同的抗氧化体系 中，其抗氧化作用不同[62]。因此，在测定样品的抗氧化活性时，需要采用多种方法来综 合评价分析样品的抗氧化活性。 1.1.5 结论 利用清除 DPPH 自由基和 ABTS 自由基两种方法对三白草石油醚部位、乙酸乙酯部 位和正丁醇部位的体外抗氧化活性进行研究。结果表明，三个部位均有一定的清除 DPPH 和 ABTS 自由基的能力，其中正丁醇部位清除 DPPH 自由基的能力比阳性对照 BHT 的清除能力强。 8 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 第二节 三白草和猕猴桃 α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 1.2.1 材料与仪器 1.2.1.1 植物来源 三白草同 1.1.1.1 项下的植物来源。 猕猴桃于 2011 年 7 月采集于河南省南召县板山坪镇，由河南大学生药教研室李昌 勤副教授鉴定为猕猴桃科植物猕猴桃 Actinidia chinensis Planch 的果实，标本存于河南大 学中药研究所。 1.2.1.2 样品提取 三白草同 1.1.1.2 项下的提取方法。 猕猴桃新鲜果实 (4.020 kg) 切碎，用甲醇加热回流提取 2 次，依次为 2 h、1 h，提 取液合并、过滤，用旋转蒸发仪浓缩得甲醇总提取物。总提取物依次用石油醚、乙酸乙 酯、正丁醇萃取，减压抽滤，浓缩得到猕猴桃石油醚部位 (2.141 g)、乙酸乙酯部位 (4.900 g) 和正丁醇部位 (18.920 g)。 1.2.1.3 试剂 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase，EC 232-604-7);阿卡波糖 (Acarbose，Lot 16869); 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026 K1516); 以上试剂均购自美国Sigma公司;二甲亚砜 (DMSO，天津市富宇精细化工有限公司)， 1.2.1.4 仪器 Multiskan MK3酶标仪 (美国Thermo Electron公司);旋转蒸发仪 (德国Heidolph公 司);电子天平 (美国Mettler-Toledo公司);LRH-150恒温培养箱 (上海一恒科技有限公 司);DELTA 320型pH计 (美国Mettler-Toledo公司);TGL-16高速离心机 (江苏金坛市中 大仪器厂)。 1.2.2 实验方法 参照文献[63-64]，先进行酶活力测定，于 405 nm 波长下测 OD 值。同样的方法， 加入 8 μL DMSO 溶解的样品溶液，测定样品的 OD 值。 检测方法:将三白草和猕猴桃各部位以DMSO溶解，并存储于4?冰箱中备用。96 微孔板筛选方法，405 nm处检测其OD值。实验共设5个组，平行三个，分别为:a. 对照 9 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 组 (缓冲液+酶液+底物);b. 空白组对照组 (缓冲液);c. 样品测定组 (样品+酶液+底物); d. 样品对照组 (样品+缓冲液);e. 阳性对照组 (Acarbose+酶液+底物)。 酶活性抑制率(%)=[1-(OD 样品-OD 样品空白)/(OD 阴性-OD 空白)]×100% (式 1-3) 利用式 (1-3) 计算酶活性抑制率，用Origin6.0软件绘制样品浓度与抑制率曲线，求 出IC50值。 1.2.3 结果 1.3.3.1 三白草对 α-葡萄糖苷酶抑制活性 按上述方法，对三白草各部位进行体外α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，结果见表1-2， 各部位质量浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率的关系见图1-3。 表 1-2 三白草提取部位 α-葡萄糖苷酶抑制活性 Table 1-2 α-glucosidase inhibitory activity of different extracts of Saururi herba 初筛浓度 抑制率 IC50 提取部位 (μg?mL-1) (%) (μg?mL-1) 1500 100.09 203.3 石油醚部位 乙酸乙酯部位 1500 96.27 122.7 正丁醇部位 1500 96.97 659.9 阿卡波糖 1500 57.26 1103.01 注:阿卡波糖为阳性对照。 Note:Acarbose as positive control. 表 1-2 显示，初筛时，在质量浓度 1500 μg?mL-1 时，三白草 3 个部位对 α-葡萄糖苷 酶抑制率从大到小依次为:石油醚部位>正丁醇部位>乙酸乙酯部位，且均高于阳性对照 阿卡波糖。但是，初筛抑制率与 IC50 值不呈正相关，应结合抑制率和 IC50 值进行综合 分析。在初筛浓度的基础上，对各部位浓度进行半倍稀释，测定相应浓度下的抑制率， 计算 IC50，进一步研究其抑制活性。乙酸乙酯部位 (IC50=122.7 μg?mL-1) 对 α-葡萄糖苷 酶抑制活性最高，其次为石油醚部位 (IC50=203.3 μg?mL-1)，正丁醇部位 (IC50=659.9 μg?mL-1) 最低，且 3 个部位抑制活性均高于阳性对照阿卡波糖 (IC50=1103.01 μg?mL-1)。 可见，三白草 3 个部位均具有好的 α-葡萄糖苷酶抑制活性。 图 1-3 显示，三白草 3 个部位对 α-葡萄糖苷酶抑制率均与浓度呈正比，具有一定的 浓度依赖性。质量浓度为 300 μg?mL-1 时，石油醚和乙酸乙酯部位的抑制率已经达到了 10 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 73.38%和 74.45%，此后继续增加浓度，抑制率增加缓慢;正丁醇部位对 α-葡萄糖苷酶 抑制率几乎随浓度的增加而增加。 120 100 80 石油醚部位 60 乙酸乙酯部位 40 抑制率 (%) 正丁醇部位 20 0 0 500 1000 1500 2000 -1 质 量 浓 度 ( μg ? mL ) 图 1-3 提取物质量浓度对 α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响 Fig. 1-3 The mass concentration of the different extracts of S.chinensis effect on α-glucosidase inhibitory activity 1.3.3.2 猕猴桃对α-葡萄糖苷酶抑制活性 ， 按上述方法，对猕猴桃各部位进行体外α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，结果见表1-3 各部位质量浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率的关系见图1-4。 表 1-3 猕猴桃提取部位 α-葡萄糖苷酶抑制活性 Table 1-3 α-glucosidase inhibitory activity of the different extracts of Fructus A.chinensis 初筛浓度 抑制率 IC50 提取部位 -1 (%) (μg?mL-1) (μg?mL ) 97.90 57.8 石油醚部位 1500 乙酸乙酯部位 1500 96.27 84.7 正丁醇部位 1500 96.97 124.7 阿卡波糖 1500 57.26 1103.01 注:阿卡波糖为阳性对照。 Note:Acarbose as positive control. 由表 1-3 可以看出，在初筛浓度 (1500 µg?mL-1) 下，猕猴桃 3 个部位对 α-葡萄糖 苷酶均有较高的抑制率，接近 100%，从大到小依次为石油醚部位>正丁醇部位>乙酸乙 11 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 酯部位，且均高于阳性对照阿卡波糖。但是，初筛时抑制率高其活性未必好，仅从抑制 率评价其活性并不可靠，应结合 IC50 值综合判断。为进一步研究抑制活性，在初筛浓度 的基础上，依次进行对半稀释，计算 IC50，结果见表 1-3，3 个部位中，石油醚部位对 α- 葡萄糖苷酶的抑制活性最高 (IC50=57.8 µg?mL-1)，其次为乙酸乙酯部位 (IC50=84.7 µg?mL-1) 和正丁醇部位 (IC50=124.7 µg?mL-1)，其活性均远高于阳性对照阿卡波糖 ( IC50=1103.01 µg?mL-1)。 图 1-4 显示，在一定质量浓度范围内，猕猴桃 3 各部位对 α-葡萄糖苷酶的抑制活性 均呈剂量依赖性，其中乙酸乙酯部位和正丁醇部位在质量浓度为 375 µg?mL-1 时，抑制 率已经大于 90%，石油醚部位在质量浓度浓度为 187.5 µg?mL-1 时，抑制率已经达到了 96.4%，此后再增加 3 个部位的质量浓度，抑制率几乎不变，而且在同一质量浓度下， 抑制率的大小顺序为:石油醚部位>乙酸乙酯部位>正丁醇部位，以上说明，猕猴桃提取 部位对 α-葡萄糖苷酶的抑制活性与提取用溶剂的极性大小呈反比关系。 120 100 80 石油醚部位 60 乙酸乙酯部位 40 正丁醇部位 抑制率 (%) 20 0 0 500 1000 1500 2000 -1 质 量 浓 度 ( μg ? mL ) 图 1-4 提取物质量浓度对 α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响 Fig. 1-4 The mass concentration of the different extracts of Fructus A.chinensis effect on α-glucosidase inhibitory activity 1.2.4 讨论 α-葡萄糖苷酶抑制剂可逆性竞争抑制小肠粘膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶，抑制了淀粉、 蔗糖、麦芽糖的分解，使葡萄糖的生成和吸收减缓，使餐后血糖曲线较为平稳，从而降 低餐后血糖峰值，减少血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，保护胰腺的功能，有 12 第一章 三白草和猕猴桃体外生活性研究 效预防并改善因高血糖引发起并发症的发生和发展[65-66]。 目前α-葡萄糖苷酶抑制剂主要来源有:一是从微生物的代谢产物中得到，如阿卡波 糖;二是采用化学合成;三是从天然产物中提取分离。天然植物或传统中草药在降血糖、 糖尿病防治中发挥着重要作用，现在发现含有α-葡萄糖苷酶抑制剂的药用植物有一百多 种[67]，是α-葡萄糖苷酶抑制剂主要来源。本文利用体外抑制α-糖苷酶活性筛选模型对三 白草和猕猴桃各部位抑制α-葡萄糖苷酶活性进行了测定，初筛抑制率结合半数抑制浓度 综合评价三白草和猕猴桃不同部位的糖苷酶抑制活性，发现三白草和猕猴桃提取部位均 具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且各部位的活性高于阳性对照阿卡波糖，其中以石 油醚和乙酸乙酯部位抑制活性最好。可见，三白草和猕猴桃有望开发成降血糖药物。为 了对其进一步研究其活性成分，需要对相应部位进行活性追踪，分离化合物，利用质谱、 红外、核磁等方法以及体外酶活性筛选模型从一类活性部位中分离鉴定出结构明确、鉴 定出高效治疗糖尿病的活性成分，在此基础上进行化合物的合成及结构修饰，筛选降血 糖药。 1.2.5 结论 本文首次采用体外 α-葡萄糖苷酶抑制模型对三白草和猕猴桃各部位 α-葡萄糖苷酶 抑制活性进行研究，发现三白草和猕猴桃各部位均具有一定的 α-葡萄糖苷酶抑制活性， 且活性均高于阳性对照阿卡波糖，其中以石油醚部位和乙酸乙酯部位抑制活性最好，说 明三白草和猕猴桃脂溶性或者中等极性成分具有较好的 α-葡萄糖苷酶抑制活性。另外， 在一定浓度范围内，各部位对 α-葡萄糖苷酶抑制活性与浓度呈正相关性，说明其抑制活 性具有一定的浓度依赖性。 13 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 参考文献 [1] Halliwell B, Gutterridge JM. 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2 g，雄性，由河南省实验动物中心提供。在室温 25-27? 下，自由采食和饮水，饲喂普通优质饲料。 2.2.2 样品 三白草石油醚部位和正丁醇部位 2.2.3 试剂 四氯化碳 (AR，CCl4);联苯双酯滴丸 (由浙江万邦药业有限公司生产，批号为 20 第二章 三白草保肝作用研究 090205);橄榄油 (上海卫辉化学试剂厂);考马斯亮蓝 G250 (上海化学试剂公司分装厂， 批号为 20050115);牛清蛋白 (北京奥博星生物技术有限责任公司，批号为 20100526); 谷草转氨酶 (GOT，20110616)、谷丙转氨酶 (GPT，20110616)、丙二醛 (MDA，20110616) 和超氧化物歧化酶 (SOD，20110613) 测定试剂盒均购于南京建成生物研究所;其 他试剂均为分析纯。 2.2.4 仪器 电子天平 (美国 Mettler-Toledo 公司);UV-2000 型紫外可见分光光度计 (上海尤尼 科仪器有限公司);Multiskan MK3 酶标仪 (美国 Thermo Electron 公司);CS-H1 型混合 器 (北京博励阳科技公司);LRH-150 恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司);TGL-16 高 速离心机 (江苏金坛市中大仪器厂);各种移液器等。 2.3 实验方法 2.3.1 造模方法 配置 0.4% CCl4 橄榄油溶液，用磁力搅拌器搅拌 2 h，实验前现用现配，除空 白组外，其他各组按照 0.1 mL?10 g-1 腹腔注射 CCl4 油溶液进行造模。 2.3.2 分组方法 取健康昆明小鼠 90 只，雄性，4,6 周龄，体重 20?2 g，将小鼠随机分为 9 组，每 组 10 只。分别为空白组、模型组、阳性对照组、石油醚部位高、中、低剂量组、正丁 醇部位高、中、低剂量组。每天灌胃相应的药物，第 8 d 给药后 2 h，除空白组外其他 组造模，禁食不禁水 12 h 后，摘除小鼠眼球取血，血浆室温静置 30 min，待血清分离 后离心，得到血清，放置于冰箱 0-3?保存。快速分离肝脏，制备 10%和 1%的肝脏 组织匀浆液。 2.3.3 指标测定方法 GOT、GPT、 SOD和MDA指标的测定均按照试剂盒操作说明进行。 参考文献[13]，利用考马斯亮蓝G250法测定血清中蛋白含量，除蛋白。 21 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 2.3.4 数据处理 采用 SPSS17.0 软件进行统计学处理，所有数据采用,x?s 表示，以 One-way ANOVA 分析各组别之间的差异，两组均数比较采用 t 检验。 2.4 结果 2.4.1 三白草不同部位对急性肝损伤小鼠血清中 GOT 和 GPT 影响 表 2-1 和图 2-1 显示，与空白组比较，模型组 GOT 和 GPT 均有极显著升高 (P<0.001)，说明造模成功;与模型组比较，阳性对照组 GOT 和 GPT 均有极显著降低 (P<0.001);石油醚部位高中低剂量组 GOT 和 GPT 均有极显著降低 (P<0.001);正丁醇 部位高低剂量组 GOT 和 GPT 均有极显著降低 (P<0.001)，中剂量组 GOT 无显著性差异， GPT 有极显著降低 (P<0.001)。由此可得，三白草石油醚部位和正丁醇部位能明显降低 肝损伤小鼠血清中 GOT 和 GPT 的活力，说明其具有较好的肝脏保护作用。 表 2-1 三白草石油醚和正丁醇部位对急性肝损伤小鼠血清中 GOT 和 GPT 影响 (,x?s，n=10) Table 2-1 Effect of petroleum ether and n-Butanol extracts of Saururi herba on GOT and GPT in serum of acute liver injury mice (,x?s, n=10) 剂量 GOT GPT 样品 组别 -1) (U?mL-1) -1) (mg?kg(U?mL 500 92.82?25.73*** 432.67?91.80*** 高剂量组 中剂量组 石油醚部位 250 312.30?98.71*** 522.15?75.28*** 低剂量组 125 190.62?60.19*** 441.45?78.85*** 高剂量组 800 297.79?63.03*** 675.37?87.64*** 中剂量组 400 479.95?88.57 808.18?106.78*** 正丁醇部位 低剂量组 200 322.15?61.04*** 773.85?154.36*** 阳性对照组 70 321.21?31.69*** 845.36?79.03*** 联苯双酯 空白组 - 170.94?44.74 330.66?68.72 ??? ??? 模型组 - 1437.15?158.88 576.15?93.99 注:联苯双酯为阳性对照; 与空白组比较:???P<0.001 ，P< 0.01 ，P< 0.05; 与模型组比较:***P< 0.001，**P< 0.01，*P< 0.05。 Note: Bifendate as positive control; P P P Compared with blank group: < 0.001, < 0.01, < 0.05; 22 第二章 三白草保肝作用研究 Compared with model group: ***P< 0.001, **P< 0.01, *P< 0.05. 图 2-1 三白草石油醚和正丁醇部位对急性肝损伤小鼠血清中 GOT 和 GPT 影响 (,x?s，n=10) Fig. 2-1 Effect of petroleum ether extract and n-Butanol extracts of Saururi herba on GOT and GPT in serum of acute liver injury mice (,x?s, n=10) 2.4.2 三白草不同部位对急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中 MDA 和 SOD 影响 表 2-2 和图 2-2、图 2-3 显示，空白组比较，模型组 MDA 显著升高 (P<0.05)，SOD 非常显著降低 (P<0.01)，说明造模成功;与模型组比较，阳性对照组 MDA 非常显著降 低 (P<0.01)，SOD 无显著性差异;石油醚部位高中低剂量组 MDA 分别非常显著、显 著和显著降低 (P<0.01、P<0.05 和 P<0.05)，SOD 均极显著升高 (P<0.001);正丁醇部 位高中低剂量组 MDA 均非常显著降低 (P<0.01)，SOD 分别极显著、极显著和非常显 和 P<0.01)。结果表明，三白草石油醚部位和正丁醇部位明 著升高 (P<0.001、P<0.001 显升高肝损伤小鼠肝脏匀浆液中 SOD 的活力，降低 MDA 的水平，这可能是其保肝护 肝的作用机制。 23 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 表 2-2 三白草石油醚和正丁醇部位对急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中 MDA 和 SOD 影响 (,x?s，n=10) Table 2-2 Effect of petroleum ether and n-Butanol extracts of Saururi herba on MDA and SOD in liver homogenate of acute liver injury mice (,x?s, n=10) 剂量 SOD MDA 样品 组别 -1) (nmol?mgprot-1) (U?mgprot-1) (mg?kg 500 6.16?1.11** 359.35?20.55*** 高剂量组 中剂量组 石油醚部位 250 12.48?1.22* 268.85?38.33*** 低剂量组 125 10.56?1.06* 349.34?12.57*** 高剂量组 800 10.45?1.43** 351.06?35.17*** 中剂量组 400 7.82?1.08** 246.06?39.32*** 正丁醇部位 低剂量组 200 8.38?1.18** 232.45?8.88** 阳性对照组 70 9.43?1.44** 199.19?28.23 联苯双酯 空白组 - 8.02?0.43 334.85?49.65 模型组 - 22.03?1.77? 115.91?16.70?? 注:联苯双酯为阳性对照; 与空白组比较:???P<0.001 ，P< 0.01 ，P< 0.05; *** ** * 与模型组比较: P< 0.001， P< 0.01， P< 0.05。 Note: Bifendate as positive control; ??? P P < 0.01, Compared with blank group: P< 0.001, < 0.05; *** ** * Compared with model group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05. 24 第二章 三白草保肝作用研究 表 2-2 三白草石油醚和正丁醇部位对急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中 MDA 影响 (,x?s，n=10) Fig. 2-2 Effect of petroleum ether and n-Butanol extract s of Saururi herba on MDA in liver homogenate of acute liver injury mice (,x?s, n=10) 图 2-3 三白草石油醚和正丁醇部位对急性肝损伤小鼠肝脏匀浆液中 SOD 影响 (,x?s，n=10) Fig. 2-3 Effect of petroleum ether and n-Butanol extracts of S.chinensis on SOD in liver homogenate of acute liver injury mice (,x?s, n=10) 2.5 讨论 目前认为肝损伤的机制主要有细胞因子过表达、氧化应激、细胞凋亡、肠道菌群失 25 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 衡、感染、微循环障碍、非特异性炎症细胞肝内聚集、补体过度激活、胰酶和胰腺炎相 关性腹水等。中药及其有效成分可以通过抑制细胞因子过表达、抗自由基损伤、减少致 炎和凋亡相关介质的产生、促进肝脏血液循环和肝细胞的再生、调节免疫、抗病毒等方 面保护肝细胞，防止肝损伤[14]。 氧化应激在 CCl4 诱导的肝细胞毒性中起着重要的作用[15]，而且其与脂质过氧化之 间的联系已经被报道。氧化应激不仅是肝功能障碍的一部分，也是所有肝损伤的病理生 理基础。肝细胞内一旦有反应性氧化产物 ROS (reactive oxygen species) 的过量产生和抗 氧化机制低下，就容易导致氧化应激状态，发生细胞膜脂质过氧化、细胞器功能异常、 线粒体内 Ca2+超载和炎性反应等，甚至出现核的氧化，进一步发展会导致癌变。 CCl4 进入机体后，经肝脏细胞色素 P450 激活，生成三氯甲基自由基 (?CCl3) 和三氯 甲基过氧自由基 (?OOCCl3)，这两种自由基引起脂质过氧化链反应，从而导致肝损伤 [16-17] 。由于脂质过氧化的结果，CCl4 可以改变细胞膜的结构，导致细胞质中的酶外漏， 如 GPT 和 GOT，引起血清中该酶的活性大大增高[15]，因此，血清中该酶水平的高低可 以用来评价肝损伤的程度。研究发现，三白草石油醚部位和正丁醇部位均能明显的降低 小鼠血清中 GOT 和 GPT 的活力，这可能与其降低自由基的产生和增强抗氧化酶的活性 有关。SOD 是一种有效清除自由基的酶，其水平的高低可以反映机体对抗自由基的能 力;MDA 是脂质过氧化作用的代谢产物，其以高低可反映脂质过氧化的程度。通过 CCl4 感应可以导致小鼠肝脏中 SOD 水平下降，MDA 的含量升高。然而，三白草石油醚部位 和正丁醇部位可以升高小鼠肝脏匀浆液中 SOD 的活力，降低 MDA 的含量。换言之， 三白草抑制脂质过氧化的机制可能与自由基的清除作用有关。 另外，文献报道，从三白草中分离得到的马纳萨亭 B 可明显抑制肝星状细胞 HSC-T6 的增殖，降低胶原的产生，显示抗肝纤维化活性[9];从三白草的水溶性部位中分离得到 2 个黄酮醇葡萄糖醛酸，以及从正己烷部位分离得到 3 个非对映木脂素:三白草酮、三 白草酮 A 和 1'-表三白草酮，这 5 个化合物均能显著降低 CCl4 损伤的大鼠肝细胞中 GPT 分泌量[10];此外，还有文献报道，三白草酮可显著减弱 CCl4 所致的大鼠肝细胞损伤， 降低 GPT 水平，抑制谷胱甘肽 (GSH)、SOD 和谷胱甘肽过氧化酶 (GPx) 水平的降低， 改善脂质过氧化，抑制 MDA 的产生。可见，三白草酮可能是通过抗氧化作用而发挥保 肝活性[18]。抗氧化文献结果表明，从三白草地下部分的甲醇提取物中分离得到的 3 个木 脂素类成分:Saururin A、8-O-4′-type neolignan 和 Virolin 能降低密度脂蛋白 (LDL) 而 26 第二章 三白草保肝作用研究 显示一定降低抗氧化活性[19];从三白草的地上部分中分离得到的 3 个黄酮苷化合物能清 除 DPPH 自由基和超氧阴离子自由基而显示出抗氧化活性[20];三白草水提物对离体 HepG2 细胞吸收氧自由基的能力、金属螯合能力以及细胞内的抗氧化活性，此结果表 明，三白草提取物有可能作为抗氧化的功能性食品[21]。以上化合物主要从三白草的极性 小的部位或极性大的部位分离得到，而且实验研究还表明，三白草石油醚部位和正丁醇 部位均有一定的清除 DPPH 和 ABTS 自由基的能力[22]。可见，体外清除自由基的能力 与体内保肝作用具有一定的相关性。 2.6 结论 通过腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性肝损伤模型，对三白草的保肝护肝作用进行研 究。结果表明，三白草石油醚部位和正丁醇部位均能明显的降低小鼠血清中 GOT 和 GPT 的活力，明显的升高小鼠肝脏匀浆液中 SOD 的活力, 降低 MDA 的含量。可见，三白草 石油醚部位和正丁醇部位对四氯化碳致小鼠急性肝损伤均有一定的保护作用，其作用机 制与其对抗自由基脂质过氧化密切相关。 27 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 参考文献 [1] Reddy PB, Kokate CK, Rambhau D, et al. 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Inhibitory effect of olive oil on fibrosis induced by carbon 28 第二章 三白草保肝作用研究 tetrachloride in rat liver[J]. Clinical Nutrition, 2008, 27(6): 900-907. [17] Weber LW, Boll M, Stampfl A. Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachlorides as a toxicological model[J]. Critical Reviews in Toxicology, 2003, 33(2): 105-136. [18] Sung SH, Lee EJ, Cho JH, et al. Sauchinone, a lignan from saururus chinensis, attenuates CCl4-induc- ed toxicity in primary cultures of rat hepatocytes[J]. Biol Pharm Bull, 2000, 23(5): 666-668. [19] BT Ahn, S Lee, SB Lee, et al. Low-density lipoprotein-antioxidant constituents of Saururus chinenesis[J]. Journal of Natural Products, 2001, 64 (12): 1562-1564. [20] Kang TH, Cho H , Oh H, et al. Flavonol glycosides with free radical-scavenging activity of Saururus chinensis[J]. Fitoterapia, 2005, 76(1): 115-117. [21] Kim GN, Lee JS, Jang HD. In vitro and cellular antioxidant activity of a water extract of Saururus chinensis [J]. 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P P Compared with blank group: P< 0.001, < 0.05; < 0.01, *** ** * Compared with model group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05; ### ## # P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05. Compared with positive control group: 35 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 图 3-1 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠空腹血糖的影响 (,x?s, n=10) Fig. 3-1 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on fasting blood glucose (,x?s, n=10) 图 3-2 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠餐后血糖的影响 (,x?s, n=10) Fig. 3-2 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on post-prandial blood glucose (,x?s, n=10) 3.4.2 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠肝糖元的影响 由表 3-2 和图 3-3 可以看出，与空白组相比，模型组小鼠肝糖元含量极显著性的降 低 (P<0.001);给药治疗 7 d 后，与模型组相比，石油醚部位高剂量组能非常显著性的 36 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 升高肝糖元的含量 (P<0.01)，中剂量和低剂量组无统计学意义 (P>0.05);乙酸乙酯部 位三个剂量组均能升高肝糖元含量，且具有显著性差异 (P<0.05，P<0.01 和 P<0.05); 正丁醇部位低剂量组能够显著性的升高肝糖元含量 (P<0.05)，高中剂量组虽能够升高小 鼠肝糖元含量，但不具有统计学意义 (P>0.05);与阳性对照组相比，石油醚部位、乙酸 乙酯部位和正丁醇部位各给药组对肝糖元含量影响无显著性差异，不具有统计学意义 (P>0.05)。可见，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位可能是通过促进肝糖元的合 成，降低肝糖元的分解等途径，降低糖尿病的血糖水平。 表 3-2 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠肝糖元的影响 (,x?s, n=10) Table 3-2 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on hepatic glycogen content (,x?s, n=10) 给药剂量 肝糖元 组别 -1) (mg?g-1) (mg?kg 500 10.71?2.81** 石油醚部位 250 9.60?1.44 125 5.57?1.39 600 10.30?2.90* 300 11.08?1.90** 乙酸乙酯部位 150 10.49?1.93* 800 9.42?1.83 正丁醇部位 400 9.41?3.24 200 10.15?2.14* 阳性对照组 75 10.45?2.23* ??? 模型组 - 7.04?1.40 空白组 - 12.78?1.49 注:阿卡波糖为阳性对照; P ， ? 与空白组比较: < 0.001 P< 0.01， P< 0.05; *** ** * 与模型组比较: P< 0.001， P< 0.01， P< 0.05; ### ## # 与阳性对照组比较: P< 0.001， P< 0.01， P< 0.05。 Note: Acarbose as positive control; ??? P P Compared with blank group: P< 0.001, < 0.05; < 0.01, *** ** * Compared with model group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05; ### ## # Compared with positive control group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05. 37 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 图 3-3 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠肝糖元的影响 (,x?s, n=10) Fig. 3-3 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on hepatic glycogen content (,x?s, n=10) 3.4.3 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血脂水平的影响 由表 3-3 图 3-4 可以看出，与空白组相比，模型组小鼠 TC 含量极显著性的升高 (P<0.001);给药治疗 7 d 后，与模型组相比，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位 和阳性对照组均能极显著性的降低 TC 的含量 (P<0.001)，且与空白组相比无显著性差 异(P>0.05);石油醚部位高剂量组和正丁醇部位高低剂量组均能够显著性的降低 TG 含 (P<0.05)，石油醚部位低剂量组能极显著降低 TG 含量 (P<0.001)，乙酸乙酯部位高 量 剂量组能够非常显著性降低 TG 含量 (P<0.01);与阳性对组相比，石油醚部位、乙酸乙 酯部位和正丁醇部位各给药组对 TC 和 TG 含量的影响均无显著性差异 (P>0.05)。可见， 石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能通过降低血清中 TC 和 TG 的含量，来改 善糖尿病并发症-高血脂，纠正糖尿病小鼠的脂质代谢紊乱。 38 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 表 3-3 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血清中 TC 和 TG 的影响 (,x?s, n=10) Table 3-3 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on the level of TC and TG in serum (,x?s, n=10) 给药量 TC TG 组别 -1) -1) -1) (mmol?L(mmol?L(mg?kg 500 2.02?0.37*** 0.51?0.20* 2.32?0.36*** 0.57?0.13 石油醚部位 250 2.20?0.58*** 0.22?0.056*** 125 600 2.17?0.39*** 0.40?0.14** 300 2.06?0.23*** 0.55?0.23 乙酸乙酯部位 150 2.13?0.55*** 0.57?0.24 800 1.94?0.36*** 0.43?0.18* 正丁醇部位 400 2.10?0.24*** 0.57?0.29 200 2.06?0.30*** 0.50?0.20* 75 2.21?.069*** 阳性对照组 0.38?0.13** ??? ? 模型组 - 3.54?0.64 0.77?0.19 空白组 - 1.92?0.38 1.07?0.20 注:阿卡波糖为阳性对照; P ， ? 与空白组比较: < 0.001 P< 0.01， P< 0.05; *** ** * 与模型组比较: P<.001， P< 0.01， P< 0.05; ### ## # 与阳性对照组比较: P< 0.001， P< 0.01， P< 0.05。 Note: Acarbose as positive control; ??? P P Compared with blank group: P< 0.001, < 0.05; < 0.01, *** ** * Compared with model group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05; ### ## # Compared with positive control group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05. 39 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 图 3-4 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血清中 TC 和 TG 的影响 (,x?s, n=10) Fig. 3-4 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on the level of TC and TG in serum (,x?s, n=10) 3.4.4 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠脂质过氧化水平的影响 由表 3-4，图 3-5 和图 3-6 可以看出，与空白组相比，模型组小鼠血清中 MDA 含量 极显著性升高 (P<0.001)，SOD 水平极显著性降低 (P<0.001)。给药治疗 7 d 后，与模 型组相比，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位各剂量组均能极显著的升高 SOD 水平 (P<0.001)，石油醚部位高中低剂量组、乙酸乙酯部位高剂量组、正丁醇部位高低 剂量组均能极显著性的降低 MDA 含量 (P<0.001)，正丁醇部位中剂量组能非常显著的 降低 MDA 含量 (P<0.01)，乙酸乙酯部位中低剂量组对 MDA 含量的影响无显著性差异， 但低于模型组;与阳性对照相比，石油醚部位高中低 3 个剂量组呈现不同程度的降低 MDA 含量 (P<0.001，P<0.05 和 P<0.01)，除乙酸乙酯部位和正丁醇部位低剂量组外， 其他各组能不同程度的升高 SOD 水平。可见，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部 位均能通过不同程度的降低血清中 MDA 的含量，升高 SOD 水平，增强糖尿病小鼠机 体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害。 40 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 表 3-4 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血清 MDA 和 SOD 的影响 (,x?s, n=10) Table 3-4 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on the content of MDA and the level of SOD in serum (,x?s, n=10) 给药剂量 MDA SOD 组别 -1) (nmol?mL-1) -1) (mg?kg(U?mL 500 1.57?0.35***### 208.28?8.60***### 石油醚部位 250 2.14?0.38***# 187.76?21.60***### 125 2.00?0.20***## 171.89?10.01***## 600 2.25?0.32*** 208.51?5.25***### 300 2.98?0.39## 192.98?8.84***### 乙酸乙酯部位 150 3.06?0.24## 153.96?19.20*** 800 2.50?0.11*** 193.85?11.51***### 正丁醇部位 400 2.61?0.21** 184.52?11.07***### 200 2.38?0.19*** 142.07?6.74*** 阳性对照组 75 2.53?0.12*** 148.41?14.32*** ??? ??? 模型组 - 3.22?0.13 116.31?14.69 空白组 - 2.45?0.51 158.42?6.15 注:阿卡波糖为阳性对照; P ， ? 与空白组比较: < 0.001 P< 0.01， P< 0.05; *** ** * 与模型组比较: P< 0.001， P< 0.01， P< 0.05; ### ## # 与阳性对照组比较: P< 0.001， P< 0.01， P< 0.05。 Note: Acarbose as positive control; ??? P P Compared with blank group: P< 0.001, < 0.05; < 0.01, *** ** * Compared with model group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05; ### ## # Compared with positive control group: P< 0.001, P< 0.01, P< 0.05. 41 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 图 3-5 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血清 MDA 的影响 (,x?s, n=10) Fig. 3-5 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on the content of MDA in serum (,x?s, n=10) 图 3-6 猕猴桃不同提取部位对糖尿病小鼠血清 SOD 的影响 (,x?s, n=10) Fig. 3-6 Effect of the different extracts of Fructus A.chinensis on the level of SOD in serum (,x?s, n=10) 3.5 讨论 近年来，全世界糖尿病发病率呈现逐年上升趋势，尤其是糖尿病引起的慢性并发症， 42 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 严重威胁人类的健康。高血糖可以加快葡萄糖的有氧氧化、增强蛋白的非酶糖基化作用 和导致脂代谢异常，这些可以导致糖尿病患者体内活性氧化物产生增加，同时使一些抗 氧化酶活性也明显减低，使糖尿病患者体内存在一定程度的氧化应激。氧化应激会使外 周组织对胰岛素的敏感性下降，葡萄糖的利用降低。此外，氧化应激还会加剧胰岛 β 细 胞凋亡，胰岛细胞数目减少，降低胰岛素的合成与分泌，使糖代谢异常进一步加剧，因 此，氧化应激在糖尿病的病理衍变中起重要作用。可见，高血糖会引起糖尿病患者抗氧 化系统紊乱，产生氧化应激，反过来氧化应激又会影响糖代谢，由此形成恶性循环[13-14]。 在糖尿病治疗过程中，α-葡萄糖苷酶抑制剂能与小肠中的 α-葡萄糖苷酶的中心活性 部位结合，阻抑酶活性的发挥，阻滞双糖水解为单糖，吸收时间后延，从而对降低餐后 高血糖起到有益的作用[15]。目前，已知多种植物中的活性成分均有 α-葡萄糖苷酶抑制 作用，并能有效控制糖尿病人的餐后血糖的升高[16-17]。 目前四氧嘧啶已广泛用于糖尿病动物模型的建立。文献研究表明，大鼠经四氧嘧啶 诱导后，胰岛 β 细胞损伤，分泌功能降低，因而糖元合成和脂类生成作用受阻，血糖、 血脂和动脉粥样硬化指数升高，同时，主要抗氧化酶类-血清 SOD 降低，外周组织膜脂 蛋白代谢末端产物-脂质过氧化产物升高[18]。本实验研究也表明，四氧嘧啶也可以诱导 小鼠糖尿病模型，使糖尿病小鼠血清中血糖水平升高、肝糖元降低、血脂代谢紊乱，TG 和 TC 含量升高，抗氧化系统紊乱，脂质过氧化产物-MDA 含量升高，SOD 活力下降。 见，饲养嘧啶诱导的糖尿病小鼠和大鼠模型脂质代谢紊乱，抗氧化防御体系受抑制， 可 自由基产生率大于清除率，氧化应激增强[19]。这与糖尿病患者体内变化相一致[20]。 本实验利用尾静脉注射四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型，分别用猕猴桃石油醚部位、 乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行灌胃处理，探讨其降血糖作用，并研究其体外 α-葡萄糖 苷酶抑制活性、抗氧化活性与体内降血糖的之间的关联。1.3.3.2 结果显示，猕猴桃三个 部位均有一定的 α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中石油醚部位对 α-葡萄糖苷酶的抑制活性 最高，其次为乙酸乙酯部位和正丁醇部位，其活性均远高于阳性对照阿卡波糖。文献报 道，猕猴桃果实籽油具有一定的还原力以及清除 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、 H2O2 以及羟基自由基的能力[21]。猕猴桃含有黄酮、多酚等成分，具有抗氧化作用，能 抑制 H2O2 致膜脂质过氧化产物 MDA 产生水平，具有一定的抗脂质过氧化作用[22-23]。 由体内糖尿病小鼠实验表明，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均有一定的降血 糖作用，其中石油醚部位低剂量组和乙酸乙酯部位高剂量组降血糖效果最好，乙酸乙酯 43 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 部位中剂量组和正丁醇部位低剂量组降低餐后血糖效果较好，正丁醇部位中剂量组降低 空腹血糖效果较好。石油醚部位高剂量组、乙酸乙酯部位高中低剂量组以及正丁醇部位 低剂量能均能显著性的升高肝糖元的含量;石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均 能显著性的降低 TC 的含量，石油醚部位高低剂量组、乙酸乙酯部位高剂量组和正丁醇 部位高低剂量组均能够显著性的降低 TG 含量;石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部 位各剂量组均能极显著的升高 SOD 水平 (P<0.001)，石油醚部位高中低剂量组、乙酸乙 酯部位高剂量组和正丁醇部位高中低剂量组均能极显著性的降低 MDA 含量。 综上而言，猕猴桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对四氧嘧啶诱导的糖尿 病小鼠均有一定的治疗作用，可以不同程度的降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的空腹血 糖和餐后血糖，并能降低血清中 TC 和 TG 的含量，改善糖尿病并发症如高血脂，纠正 糖尿病小鼠的脂质代谢。通过促进肝糖元的合成，降低肝糖元的分解等途径，降低血糖 水平;通过降低血清中 MDA 的含量，升高 SOD 水平，增强糖尿病小鼠机体的抗氧化 防御功能，保护机体免受自由基的进一步攻击，进而达到治疗糖尿病的作用。因此，猕 猴桃有望用于糖尿病及其并发症的有效治疗。另外，此研究也表明，猕猴桃体内降血糖 作用与其体外 α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性紧密相关。 查阅文献发现，来自天然产物中萜类、胰岛素、肽和氨基酸类、黄酮类、多糖类、 硫醚类、生物碱类、香豆精类和不饱和脂肪酸类等类型的化合物具有一定的降糖作用， 如胡芦巴中芹菜素黄酮苷类化合物有降血糖活性[24]、当归多糖有降血糖作用[25]等，化 学成分研究表明，猕猴桃果中富含挥发性成分 (含有不饱和脂肪酸)、有机酸、黄酮、 猕猴桃碱、多种维生素、多糖及多种人体必需的氨基酸和微量元素等多种化学成分，这 些类型的化学成分可能是猕猴桃具有降糖作用的活性成分，但具体是哪一个或者几个化 合物具有降血糖作用，需要进一步分离纯化，获取单体化合物，进一步研究其活性。 3.6 结论 通过尾静脉注射四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型，首次研究猕猴桃体内降血糖作用。 结果表明，猕猴桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对四氧嘧啶诱导的糖尿病小 鼠均有一定的治疗作用，可以通过促进肝糖元的合成，降低肝糖元的分解等途径，降低 糖尿病小鼠的空腹血糖以及餐后血糖水平;通过降低血清中 TC 和 TG 的含量，改善糖 尿病并发症如高血脂，纠正糖尿病小鼠的脂质代谢紊乱;通过降低血清中 MDA 的含量， 44 第三章 猕猴桃降血糖作用研究 升高 SOD 水平，增强糖尿病小鼠机体的抗氧化防御功能，保护机体免受自由基的进一 步攻击，进而达到治疗糖尿病的作用。 45 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 参考文献 [1] Hsua YJ, Lee TH, Chang Cicero LT, et al. 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[25] 许莹, 丁虹. 当归多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用[J]. 中国药师, 2004, 7(11): 880-881. 47 第四章 三白草脂溶性成分研究 第四章 三白草脂溶性成分研究 4.1 概述 查阅文献发现，三白草具有多种生物活性，其中我们课题组研究了其抗氧化活性[1]、 保肝作用[2]和 α-葡萄糖苷酶抑制活性[3];三白草化学成分有挥发油、木脂素、生物碱、 黄酮、萜类、鞣质等[4-11]。有文献报道三白草挥发油是通过水蒸气蒸馏法提取得到的[12]， 而本文利用甲醇提取得到总浸膏，用石油醚萃取得到三白草脂溶性成分，利用气质联用 技术 (GC-MS) 分析其脂溶性成分，为进一步开发利用三白草资源提供理论依据。 4.2 材料与仪器 4.2.1 植物来源 见 1.1.1.1。 4.2.2 仪器 手动固相微萃取进样器 (美国 Supelco 公司)、65 μm 聚二甲基硅氧烷萃取头 (美国 Supelco 公司)、6890 N 型气相色谱-5975 型质谱联用仪 (美国安捷伦) 和 C6~C26 正构烷 烃品 (Alfa Aesar)。 4.3 实验方法 4.3.1 样品准备 三白草全草阴干，粉碎，用甲醇室温下浸泡 3 次，每次 3 d，合并滤液、浓缩，得 到甲醇总浸膏。总浸膏分散于水中，用石油醚萃取，减压浓缩得到三白草石油醚部位， 即为脂溶性部位，采用分流进样，当样品完全被汽化，与载气充分混合后，样品按照分 流进样器进入柱子的流量与通过分流器的流量 10:1 进样。 49 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 4.3.2 GC-MS 分析条件 气相色谱条件:DB-5 ms 毛细管柱 (30 m×0.25 mm ID×0.10 μm)，载气为 99. 999% 的高纯氦气，流速为 1.0 mL?min-1，进样口温度 250?;温柱初始温度为 100?，保持 1.0 min，以 15??min-1 升温至 310?，保持 5 min，最后以 2??min-1 降温至 280?，保 持 20 min;分流进样。 质谱条件:电离方式采用 EI 源，电离能量为 70 eV;四极杆温度 150?，离子源温 度为 230?，传输线温度 280?;电子倍增器电压 1506 V;质量扫描范围 m/z 为 30~450 amu。 4.3.3 化合物检索 采用 NIST 质谱库 2008 年版，根据分子离子峰，与质谱库中对应的化合物的分子 离子峰进行比较，以其相似程度进行化合物检索。 4.4 结果 依据上述实验方法和条件，对三白草脂溶性成分进行 GC-MS 分析，总离子流图见 图 4-1，面积归一化法确定各成分在脂溶性物质中的相对含量，其结果列于表 4-1。 图 4-1 三白草脂溶性成分总离子流图 Fig. 4-1 Total ion chromatogram of fat-soluble components in Saururi herba 50 第四章 三白草脂溶性成分研究 表 4-1 三白草脂溶性成分 Table 4-1 Fat-soluble components in Saururi herba 编号 化学成分 t/min 含量/% 相似度/% 1 10.455 Hexadecanoic acid, methyl ester 棕榈酸甲酯 2.04 99 n-Hexadecanoic acid 棕榈酸 2 10.709 3.51 99 3 11.518 E-15-Heptadecenal E-15-十七烯醛 2.92 99 (Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid,methyl ester 4 11.574 1.34 99 亚油酸甲酯 (Z,Z,Z)- 9,12,15-Octadecatrienoic acid, methyl 5 11.612 1.19 98 ester 亚麻酸甲酯 Phytol 叶绿醇 6 11.678 1.39 91 7 11.828 (Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid 亚油酸 1.06 99 (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoic acid 亚麻酸 8 11.866 1.83 95 4-dihydro-1-(diphenylmethylene)-5-hydroxy-4-ox 9 15.091 o-Naphthalene 1,4-二氢-1-二苯甲烯基-5-羟基 6.93 87 -4-氧代萘 1-[2-(3,4-Dimethoxy-phenyl)-ethyl]-3-phenethyl-t 10 15.552 1.4 89 hiourea 1-[2-(3,4-二甲氧苯)乙基]-3-苯乙基硫脲 [2S-(2α,3ß,4α,5ß)]-2,5-bis(3,4-dimethoxyphenyl)t etrahydro-3,4-dimethyl-Furan 11 16.041 10.97 95 [2S-(2α,3ß,4α,5ß)]- 2,5-双(3,4-二甲氧基苯基)四 氢-3,4-二甲基-呋喃 [2R-(2α,3ß,4ß,5α)]-2,5-bis(3,4-dimethoxyphenyl)t etrahydro-3,4-dimethyl-Furan 12 16.586 2.54 83 [2R-(2α,3ß,4ß,5α)]- 2,5-双(3,4-二甲氧基苯基)四 氢-3,4-二甲基-呋喃 2-phenyl-1H-Indole-3-carboxaldehyde 13 17.903 1.62 60 2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛 Stigmasterol 豆甾醇 14 18.937 1.58 96 15 19.576 ß-Sitosterol ß-谷甾醇 3.45 95 总计 43.77 由表 4-1 可以看出，从中鉴定出了 15 个化合物，占色谱总馏分出峰面积的 43.77%， 其主要成分含量由高到低依次为 [2S-(2α,3ß,4α,5ß)]-2,5-双(3,4-二甲氧基苯基)四氢-3,4- 二甲基 -呋喃 (10.97%)、 1,4-二氢 -1-二苯甲烯基 -5-羟基 -4-氧代萘 (6.93%)、棕榈酸 (3.51%) 和 ß-谷甾醇 (3.45%) 等。 从化合物类别分析，呋喃类占 13.51%、醇和醛分别为 6.42%和 4.54%，脂肪酸占 6.4%及其甲酯占 4.57%。 51 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 4.5 讨论 早期的报道表明，三白草全草含挥发油，其主要成分有甲基正壬基酮、肉豆蔻醚、 β-石竹烯等。其茎叶经水蒸馏提取挥发油量为 0.5%，除主成分肉豆蔻醚外，尚含硬脂 酸、软脂酸、油酸、亚油酸、α-蒎烯、茨烯、里哪醇、葎草烯、β-丁香烯、黄樟醚和 1- 烯丙基-3,4-亚甲二氧基-5-甲氧基苯等，包括脂肪类、单萜类、倍半萜类和芳香族类以及 硬脂酸、软脂酸、油酸、亚麻酸等一些酸类化合物。三白草脂溶性成分主要有呋喃类、 醇类、醛类、脂肪酸及其甲酯，而未检测出单萜和倍半萜类成分。挥发油具有挥发性， 在常温下可自行挥发而不留任何痕迹，在脂溶性成分中其萜类挥发性成分可能已挥发， 因此在脂溶性成分中未检测到。 植物甾醇具有降低血浆胆固醇、抗癌，已经被用作功能性食品添加剂使用[13]，文献 报道，三白草具有抗癌和降胆固醇作用，其抗癌主要活性成分有三白草酮、马纳萨亭 A 及其 2 个差向异构体、三白草脂素-7 和 10-氨甲基-3-羟基-4-甲氧基-菲羧酸内酰胺[14-16]， 乙醇提取物可以降低血清中的胆固醇[17]。目前，在三白草脂溶性成分检测到植物甾醇如 豆甾醇和谷甾醇，可以推测其可能也是三白草抗癌和降胆固醇的活性的成分，但需要进 一步研究。 此外，三白草脂溶性成分中含有棕榈酸及其甲酯、亚油酸及其甲酯和亚麻酸及其甲 酯，可见存在酯化或酯解的过程。另外，不饱和脂肪酸是人类必需的脂肪酸，在机体内 不能合成，必须由食物供给，具有降低血脂、胆固醇和血压，抗血栓、动脉硬化，预防 心血管疾病等作用[18]，三白草脂溶性成分中含有 2 个不饱和脂肪酸甲酯及其相对应的脂 肪酸，由此可推测三白草脂溶性成分具有降低血脂、胆固醇和血压作用。 52 第四章 三白草脂溶性成分研究 参考文献 [1] 尹震花, 顾雪竹, 张一冰, 等. 三白草体外抗氧化活性[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(4): 99-102. 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[18] 韩宏毅, 王剑. 多不饱和脂肪酸及其生理功能[J]. 中国临床研究, 2010, 23(6): 523-525. 54 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 猕猴桃属植物在全世界约 60 余种，除少数种分布在温带外，主要产于亚热带地区。 我国是该属植物原生地和分布中心，共有 58 种，主要分布于长江流域各省的山区阴湿 《 地带。中华本草》中记载，猕猴桃为猕猴桃科植物猕猴桃 (Actinidia chinensis Planch) 的 果实，又名藤梨、猕猴梨、羊桃等，生于山地林间或灌丛中，常缠绕在他物上。分布于 陕西、江苏、安徽、浙江、江西、福建、四川、贵州、云南等地，味酸、甘，性寒。归 胃、肝、肾经。具有解热、止渴，健胃，通淋之功能。主治烦热、消渴，肺热干咳，消 化不良，湿热黄疸，石淋，痔疮。猕猴桃果中富含挥发性成分、有机酸、黄酮、猕猴桃 碱、多种维生素、多糖及多种人体必需的氨基酸和微量元素等多种化学成分。本章对其 果实在生物活性方面的研究进展进行概括。 5.1 抗癌作用 宋圃菊[1]利用 15 只雄性 Wistar 大鼠和 10 名男性健康志愿者为研究对象，自身对照 法分期观察中华猕猴桃果实的抗癌作用。实验研究表明，给予中华猕猴桃汁后，大鼠尿 中 N-亚硝基脯氨酸 (NPRO) 排出明显减少，阻断体内 NPRO 的合成，阻断率 59.6%， 且效果优于同浓度维生素 C 溶液 (阻断率 41.8%)，志愿者食入 150 g 含 75 mg 维生素 C 的中华猕猴桃后，可完全阻断服 300 mg NaNO3 和 500 mg 脯氨酸后体内 NPRO 的合成， 而 75 mg 维生素 C 仅能部分阻断。可见，中华猕猴桃具有一定的抗癌作用。 卢丹等[2]以接种了肉瘤细胞 S180 的小鼠为实验对象，考察从中华猕猴桃果中提取 的粗多糖 fruit polysaccharide (FP)，以及 FP 经阴离子交换层析等分离、纯化得到多糖 FP1 和 FP2 的抗肿瘤作用。结果显示，FP 和纯化后的 FP1 和 FP2 中，仅 FP2 具有显著 的抗肿瘤活性 (P<0.01)，抑制率达到了 50.8%。FP 的抑制作用不具有显著性 (P>0.05)， 而 FP1 的抑制作用呈现负值。进一步研究 FP2 的抗肿瘤活性，发现在高剂量 150 mg?kg-1 给药下，对 S180 肿瘤细胞的抑制率达到 54.2%，且具有显著性 (P<0.01)。可见，中华 猕猴桃果实多糖具有一定的抗癌作用。 范远景等[3]以谷氨酸-甘氨酸-精氨酸肽为底物，采用体抑制尿激酶活性的方法，测 55 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 定猕猴桃果汁对尿激酶抑制作用。结果显示，猕猴桃果汁具有好的抑制尿激酶效果，抑 制率为 97.8%。 5.2 降血脂作用 何素琴等[4]研究发现猕猴桃果汁能明显降低高脂血症小鼠血清中总胆固醇含量，升 高高密度脂蛋白胆固醇含量，说明其具有一定的降脂作用。 曹兴亚等[5]对猕猴桃果汁的降血脂作用初步研究发现，猕猴桃果汁 10 mL?kg-1 和 20 mL?kg-1 两个剂量组对大鼠血清胆固醇和甘油三酯的上升趋势有预防作用，但不具有统 计学意义，20 mL?kg-1 剂量组能显著降低高脂血症小鼠血清中胆固醇的含量，且具有显 著性差异。 刘晓鹏和陈吉棣[6]研究发现，在饲喂高脂饲料建立大鼠高脂血症的同时及建成大鼠 高脂血症模型后，给予猕猴桃复方口服液均可显著降低高脂血症大鼠的体重、体脂、血 清胆固醇、甘油三酯和血清低密度脂蛋白胆固醇水平，提高血清高密度脂蛋白胆固醇水 平。 薛美兰等[7]研究发现，猕猴桃浓缩物能显著性的降低大鼠血浆总胆固醇、总甘油三 酯和低密度脂蛋白的含量以及细胞膜 MDA 的含量，且可以显著性的升高高密度脂蛋白 与低密度脂蛋白的比例。可见，猕猴桃浓缩物具有显著的降血脂作用，且具有一定剂量 依赖性。 5.3 抗突变和畸变作用 李双莲[8-9]和 Schröder R 等[10-11]等通过测定大鼠外周血双核淋巴细胞微核细胞率以 及肝中 SOD、GST、UDPCT 和 γ-CT 的活性，GSH 和 MDA 的含量，对猕猴桃果汁抗 环磷酰胺致突变作用及机制进行研究，结果显示，与阳性对照组相比，猕猴桃果汁实验 组显著降低双核淋巴细胞微核细胞率，并随剂量的增加，细胞率降低越多;能明显升高 SOD 和 UDPGT 的活性，降低 MDA 的含量，三者均具有明显的剂量效应关系，有轻 度的降低 γ-CT 的活性，也可以明显的升高 GSH 的含量，但当两者均不具有量效关系， 此外，发现微核细胞率与 SOD、GST 和 UDGTP 活性及 GSH 含量呈明显负相关，而与 MDA 含量呈明显正相关。从而说明猕猴桃可能是通过诱导机体的外来化合物代谢解毒 酶系，加速环磷酰胺的代谢灭活，提高机体抗氧化防御系统的功能，防止有害自由基对 56 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 细胞内生物大分子的损伤来抵抗环磷酰胺的致突变。 赵泽贞等[12]利用大肠杆菌溶原性菌株 GY5027 和对特异性噬菌体敏感的指示菌株 GY4015，采用抗突变和致突变同步快速试验技术，观察猕猴桃抗突变作用。结果显示， 在加与不加 S9 的两种试验中，猕猴桃与抗突变阳性对照剂维生素 C 出现一致的效应, 即 猕猴桃对丝裂霉素 C 的致突变毒性有拮抗作用。 Ikken Y 等[13]通过 Ames 试验研究发现，猕猴桃乙醇提取物可抑制 N-亚硝基化合物 的致突变作用，对亚硝基二甲胺、亚硝基二丁胺、亚硝基吡咯烷和亚硝基哌啶引起的突 变也有一定的抑制作用，其中对亚硝基吡咯烷的抑制率最高，可达 51%，说明猕猴桃能 抑制 N-亚硝基化合物所致的突变。 周宁菱等[14]通过 Ames 试验研究猕猴桃提取物抗苯并[a]芘致突变的作用，结果显 示，猕猴桃提取物具有高强度的对抗苯并[a]芘诱导的鼠伤寒沙门氏菌 TA98 致突变作用。 杨业鹏等[15]通过观察猕猴桃果汁对经 60 Co-γ 射线照射后小鼠骨髓有核细胞数量、 细胞 DNA 合成及染色体畸变的影响，结果显示:5.0 Gy γ 照射可以使小鼠骨髓有核细 胞数量明显减少，DNA 合成总量和单位数量细胞的 DNA 合成量显著下降，染色体畸变 细胞率和染色体畸变率显著增高，这说明猕猴桃果汁对骨髓细胞畸变有一定的保护作 用。 5.4 解毒作用 张文书等[16]研究发现猕猴桃对对亚硝酸盐、亚硝胺引起的毒性具有一定的解毒作 用。亚硝酸钠单用可以使小鼠肝脏脂质过氧化物水平升高 (P<0.05)，同时给予猕猴桃组 可以使脂质过氧化物水平降低 (P<0.05);从亚硝酸钠可以使大鼠肝脏脂质过氧化物水 平、SOD 和 GSH-PX 活力升高，同时给予组猴桃组可以使过氧化物水平和酶活降低。 亚硝酸盐、亚硝胺可能通过产生自由基的途径对机体产生毒性，而给予猕猴桃后，能通 过部分消除亚硝酸盐和抗脂质过氧化作用降低亚硝酸盐、亚硝胺对机体的毒性。 贾光等[17]采用噻唑蓝比色法测定猕猴桃对 K2Cr2O7 引起的细胞毒性作用发现，在 K2Cr2O7 与 20 g?L-1 猕猴桃汁同时作用组，细胞在 492 nm 的光密度值在各剂量组 (K2Cr2O7 分别为 0 µmol?L-1、0.625 µmol?L-1 和 1.25 µmol?L-1) 都高于相应剂量单纯 K2Cr2O7 组，且具有统计学意义，说明猕猴桃汁可以有效地拮抗 K2Cr2O7 引起的细胞毒 效应。 57 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 5.5 抗氧化和衰老作用 唐筑灵和张小蕾[18]通过研究猕猴桃原汁对 H2O2 引起的小鼠红细胞溶血和脂质过氧 化的作用，观察猕猴桃原汁的抗氧化作用。结果显示，与溶血组 (溶血率为 33.1%，MDA 产量为 0.346?0.106) 相比，猕猴桃原汁和维生素 C 均有明显的抗溶血作用，溶血率分 别为 15.6% (P<0.01) 和 22.0% (P<0.05)，猕猴桃组更为显著;猕猴桃原汁可以抑制脂质 过氧化，MDA 产生量为 0.135?0.028，明显减少 (P<0.01)，而维生素 C 无此作用。可 见，猕猴桃能抑制 H2O2 致膜脂质过氧化产物 MDA 产生水平，具有一定的抗脂质过氧 化作用。 Yamazaki M[19]研究发现，猕猴桃果中含有大量的多酚类成分，显示出明显的抗氧 化活性。 运晨霞等[20]以人胃腺癌细胞菌株 SGC-7901 为实验对象，研究猕猴桃水提取抗氧化 作用机制。结果显示，采用免疫组化法染色观察，猕猴桃水提物含药血清高中低剂量组 均可显著性的提高核因子相关基因 2 的表达水平，颜色由浅黄变为棕黄。通过 RT-PCR 检测，可显著性的诱导二相酶谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因的表达，且可以显 著性的诱导谷胱甘肽-S-转移酶 P1 和 T1 基因表达作用。可见，猕猴桃水提物可通过促 使核因子相关基因 2 进入核内，增加二相酶的表达，而起到细胞解毒抗氧化作用。 李加兴等 [21]建立体外抗氧化方法，通过测定猕猴桃果实籽油的还原力以及清除 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、H2O2 以及羟基自由基的能力，研究猕猴桃籽油的抗 氧化活性。结果显示，在一定浓度范围内，猕猴桃籽油的还原能力和清除自由基能力均 与其浓度呈正相关。可见，猕猴桃籽油具有较强的体外抗氧化活性。 张钰华等[22]通过 D-半乳糖诱导亚急性衰老动物模型来研究猕猴桃籽油延缓衰老的 机制。结果显示，与模型组相比，猕猴桃籽油干预组 SOD 活性显著性增高 (P<0.05)， MDA 含量显著下降 (P<0.05)，皮肤中羟脯氨酸含量显著性提高 (P<0.05)。可见，猕猴 桃籽油可通过调节血清中 SOD 的活力和 MDA 的含量以及皮肤组织中羟脯氨酸而起到 延缓衰老的作用。 5.6 保肝作用 黄悼伟等[23]采用 0.1%四氯化碳油溶液或者硫代乙酰胺水溶液或强的松龙混悬液诱 58 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 导急性肝损伤，观察浓缩至 10 倍的猕猴桃果汁的保肝作用。结果显示，猕猴桃果汁降 低小鼠肝炎模型的甘油三酯含量以及血清中 SGPT 水平不显著，但对肝细胞的损害程度 降低，可见浓缩至 10 倍的猕猴桃果汁对肝损伤具有一定的保护作用。 雷霆雯等[24]以于 15 月龄的雄性 Wistar 大鼠为研究对象，实验组每日喂猕猴桃汁 10 mL?kg-1，不喂猕猴桃汁组为对照，通过观察大鼠肝细胞膜 β 肾上腺素能受体数目和亲 和力以及丙二醛含量的变化，结果显示，与对照组相比，受体数目无显著性差异，但亲 和力升高，且具有显著性 (P<0.05)，MDA 含量降低，但不具有显著性。可见，猕猴桃 果汁对老龄大鼠肝细胞膜 β 肾上腺素能受体具有一定的保护作用。 向志钢等[25]以高脂饲料诱导小鼠脂肪肝模型，观察猕猴桃果仁油对小鼠非酒精性脂 肪性肝病 (NAFLD) 的保护作用并探讨其机制。结果显示，猕猴桃高中剂量能显著性的 降低小鼠血清中 TG、TC 和肝组织中 MDA 的含量以及血清中 AST 和 ALT 的活力，显 著性的升高肝组织中 SOD 和 GSH-Px 的活力，且肝脏脂肪变性程度轻，细胞坏死不明 显。可见，猕猴桃果仁油对高脂饲料诱导的小鼠 NAFLD 有明显的保护作用。 5.7 增强免疫功能的作用 李香华等[26]以健康青年为实验对象，补充猕猴桃汁饮料后，通过测定 PHA 刺激的 淋巴细胞的增殖能力和表型，与补充纯净水的对照组作比较，观察机体进行大强度运动 前后 T 淋巴细胞活性及其亚群的变化。结果表明，除 CD3+无显著性差异外，与对照组 比较，实验组 CD4+升高，CD8+降低，CD4+/CD8+升高，且均呈现显著性差异，可见， 补充猕猴桃果汁饮料对大强度运动时机体免疫功能有良好的调节作用。 林延鹏等[27]采用硫代巴比妥酸法测定服用 SOD 猕猴桃果汁前后血清和红细胞中丙 二醛含量的变化，以及利用上海捷门生物技术公司提供的试剂测定免疫球蛋白 IgG、IgA 和 IgM 的变化研究其对机体免疫功能的作用。试验表明，服用 SOD 猕猴桃果汁后，红 细胞与血清丙二醛 (MDA) 含量显著降低 (P<0.001)，IgG、IgA 和 IgM 均呈上升趋势。 其中，红细胞和血清 MDA 含量与免疫球蛋白 IgG、IgA 和 IgM 均呈负相关;血清 IgM 和红细胞与血清 MDA 含量呈显著负相关;IgG 与红细胞 MDA 含量呈显著负相关。这 些说明纯天然 SOD 猕猴桃果汁具有抗脂质过氧化、降低血清和红细胞 MDA 含量，提 高免疫球蛋白 IgG、IgA 和 IgM 的作用。 59 三白草和猕猴桃保肝降血糖作用研究 5.8 促进肠道运动的作用 吴旻丹等[28]观察猕猴桃提取液和提取物对成年雄性小鼠离体肠的作用。结果显示， 猕猴桃提取液可以极显著性的提高小肠收缩率和收缩力 (P<0.001)，且与阳性对照乙酰 胆碱相似，而且，随着提取液浓度的增加，收缩率和收缩力不断升高。可见，猕猴桃提 取液具有促进肠运动的作用。 李加兴等[29-30]通过测定猕猴桃果汁对小鼠和成人排铅的作用以及对便秘小鼠的排 便时间、频率以及排便量的影响，来研究其润肠通便的保健功能。结果显示，猕猴桃果 汁可以降低小鼠血液和肝中铅的含量，增加人尿中铅的排出量，促进便秘小鼠的小肠运 动，缩短排便时间，增加排便量，且均具有显著性差异。 5.9 结语 综上所述，猕猴桃果实具有抗癌、降血脂、抗突变和畸变、解毒、抗氧化、保肝、 增强免疫功能和促进肠道运动等多种生物活性，具备了药食同用的功能。由于其有着优 异的生物括性和丰富的营养价值，现世界各国均大量栽培猕猴桃。随着对猕猴桃药理作 用研究的深入及我国膳食结构由小康型向营养保健型的转变，猕猴桃将会在药物及保健 食品方面有着广阔的研究、开发、应用前景。 60 第五章 猕猴桃生物活性研究进展 参考文献 [1] 宋圃菊. 中华猕猴桃的防癌作用 (五) 阻断大鼠和健康人体内 N-亚硝基脯氨酸的合成[J]. 营养 学报, 1988, 10(1): 50-55. 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[30] 李加兴, 陈双平, 秦轶, 等. 猕猴桃果汁保健功能研究[J]. 食品工业科技, 2006, 27(6): 162-165. 62 结 论 结 论 1. 对三白草石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行体外抗氧化活性研究。 结果显示，3 个部位均有一定的清除 DPPH 和 ABTS 自由基的能力，且具有浓度依赖性。 2. 三白草和猕猴桃的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行 α-葡萄糖苷酶 抑制活性研究。结果显示，三白草和猕猴桃各提取部位均有一定的 α-葡萄糖苷酶抑制活 性，且在一定弄范围内，各部位对 α-葡萄糖苷酶的抑制率均与浓度呈正相关性，即具有 浓度依赖性。 3. 研究三白草石油醚部位和正丁醇部位对小鼠急性肝损伤的保护作用。结果显示， 石油醚部位和正丁醇部位均能显著地降低血清中 GOT 和 GPT 的活力，提高肝脏匀浆液 中 SOD 的活力，降低 MDA 的含量，增强机体对抗自由基的能力，具有一定的保肝护 肝作用。三白草石油醚部位和正丁醇部位的保肝作用与其增强肝细胞的抗氧化能力有 关。 4. 研究猕猴桃的体内降血糖作用。结果显示，猕猴桃石油醚部位、乙酸乙酯部位 和正丁醇部位对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠均有一定的治疗作用，可以通过促进肝糖元 的合成，降低肝糖元的分解等途径，降低糖尿病的空腹血糖以及餐后血糖水平;通过降 低血清中 TC 和 TG 的含量，改善糖尿病并发症如高血脂，纠正糖尿病小鼠的脂质代谢 紊乱;通过降低血清中 MDA 的含量，升高 SOD 水平，增强糖尿病小鼠机体的抗氧化 防御功能，保护机体免受自由基的进一步攻击，进而达到治疗糖尿病的作用。 5. 采用气质联用技术 (GC-MS) 分析三白草脂溶性成分。从中鉴定出了 15 个化合 物 ， 占 色 谱 总 馏 分 出 峰 面 积 的 43.77% ， 其 主 要 成 分 含 量 由 高 到 低 依 次 为 [2S-(2α,3ß,4α,5ß)]-2,5-双(3,4-二甲氧基苯基) 四氢-3,4-二甲基-呋喃 (10.97%)、1,4-二氢 -1-二苯甲烯基-5-羟基-4-氧代萘 (6.93%)、棕榈酸 (3.51%) 和 ß-谷甾醇 (3.45%) 等。从 化合物类别分析，呋喃类占 13.51%、醇和醛分别为 6.42%和 4.54%，脂肪酸 6.4%及其 甲酯 4.57%。 6. 从抗癌、降血脂、抗突变和畸变、解毒、抗氧化、保肝、增强免疫功能和促进 肠道运动等多方面介绍猕猴桃 (Actinidia chinensis Planch) 果实的生物活性研究进展。 63 论文创新点 论文创新点 1. 首次采用体外清除 DPPH 自由基和 ABTS 自由基的方法及 α-葡萄糖苷酶抑制筛选模 型对三白草石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗氧化和 α-葡萄糖苷酶抑制活 性进行研究。 2. 首次采用体外 α-葡萄糖苷酶抑制筛选模型，对猕猴桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和 正丁醇部位的 α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究。 3. 首次采用四氧嘧啶诱导的小鼠糖尿病模型对猕猴桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和正 丁醇部位的降血糖作用进行研究。 65 硕士期间发表的论文 硕士期间发表的论文 1. Zhen-hua Yin, Jia-jia Wang, Xue-zhu Gu, Hai-peng Gu, Wen-yi Kang. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activity of red raspberry (Harrywaters) fruits in vitro[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2012, 6(45): 3118-3123. 2. Fang Gong, Zhen-hua Yin, Qitai Xu, Wen-yi Kang. Hepatoprotective effect of Mitragyna rotundifolia Kuntze on CCl4-induced acute liver injury in mice[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2012, 6(5): 330-335. 3. Jin-Feng Wei, Zhen-hua Yin, and Fu-De Shang. Volatiles in the Lysimachia clethroides Duby by head space solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS)[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2012, 6(33): 2484-2487. 4. Jin-feng Wei, Yuan-yuan Li, Zhen-hua Yin, Fang Gong, Fu-de Shang. Antioxidant activities in vitro and hepatoprotective effects of Lysimachia clethroides Duby on CCl4-induced acute liver injury in mice[J]. 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