药物载体系统及基因给药系统治疗脑部肿瘤的障碍道

药物载体系统及基因给药系统治疗脑部肿瘤的障碍道 药物载体系统及基因给药系统治疗脑部肿瘤的障碍 摘要目前尽管肿瘤成像、神经外科及放射治疗技术已经取得了较大进展脑肿瘤病人的预后效果仍难以令人满意。有效的化疗药物用于治疗脑肿瘤时往往由于生化及生理屏障阻碍药物进入脑部而失去疗效。在过去的几十年里人们已经采取了一系列的手段来促进药物进入脑部软组织。值得一提的是无论是动物模型还是临床试验对肿瘤部位直接给药都显示了良好的前景并且这种技术特别适合于脂质体及药物聚合物载体给药这两种给药方式能够实现药物恒定释放及更好的特异性细胞靶向。本文将讨论近年来在提高药物进入脑部软组织方面取得的进展重点介绍脂质体及药物聚合物载体给药系统。 关键词脑部肿瘤药物传递细胞外液基因治疗脂质体及聚合物载体给药系统 1.简介 据估计全美每年有17200人被诊断患有恶性中枢神经系统肿瘤。尽管经过外科手术放射治疗化学治疗年平均存活率在过去三十年里仍然提高很小。存活率过低的原因在于患者被诊断为患有肿瘤时其肿瘤体积已经达到30至60立方厘米相当于300至600亿个肿瘤细胞而肿瘤细胞数量需要在10万个左右方能被人体免疫系统控制。通过手术及放射治疗能够 倍但化学治疗不足以将剩下的肿瘤细胞数目再降低100倍。将肿瘤细胞数目降低1000 生化及转运屏障阻碍了脑肿瘤药物治疗的发展。 当前治疗脑部疾病药物的主要研究方向还是围绕能透过血脑屏障而到达病变软组织的小分子、脂溶性药物。一些小分子药物有助于治疗受体及转运体疾病如抑郁症但对治疗阿尔茨海默氏病、杭丁顿氏舞蹈症、中风或脑肿瘤等往往无能为力。大分子药物治疗上述中枢神经系统疾病往往疗效显著因为这些药物具有高度特异的靶向性。然而由于将大分子转运至脑部软组织存在困难对大分子药物治疗脑部疾病的研究往往无功而返。 已经有一些综述了当前脑部给药面临的挑战及改进药物转运至脑的技术研究。本文将讨论促进药物脑部转运的措施重点介绍脂质体及药物聚合物载体给药系统。 2. 脑部生理与解剖 脑部是中枢神经系统的集中地带作为人体主要的调控及交流器官脑部起着当体内外环境改变时维持身体动态平衡的作用。脑部主要细胞为神经细胞及神经胶质细胞成人大概有约1000亿个神经细胞及100亿个神经胶质细胞。神经细胞及神经胶质细胞在脑内进行有序排列从而使其具有独特的组织结构及功能。大脑内部结构可分为灰质及白质二者分别由胞体及轴突控制。轴突同向排列的区域成为大脑白质束。 脑主要组成部分为大脑、小脑及脑干如图1。大脑为体积最大的部分沿着正中矢状平面而分为大脑左半球和大脑右半球。大脑半球面覆盖着一层灰质称为大脑皮层大脑皮层主要负责语言及信息处理等功能由大约250亿个神经元组成由于表面高度褶皱皮层表面积达到2300平方厘米。大脑皮层细胞间相互关联同时通过其深面的大脑白质与脊髓相连。联系左右大脑半球的主要白质纤维束称为胼胝体。小脑也是由灰质及白质组成但体积更小其主要功能是维持身体平衡和协调机体运动。脑干和大脑、小脑一样也由灰质及白质组成但其灰质白质没有分为内外层脑干主要负责机体自主功能如心跳、呼吸同时连接脑部与脊髓。 图1.脑部正中矢状平面图。左右大脑半球由胼胝体相连 脑肿瘤大多发生在大脑软组织。然而不同于任何其他组织将药物传送至脑部比将药物从脑部消除要困难得多。在外脑由颅骨所保护颅骨容纳脑并调节脑组织压力。在内血脑屏障在很大程度上限制了血管内皮细胞的通透性及从而组织药物转运。药物在脑内被清除的机制有如下几种多细胞耐药转运体将药物泵出血脑屏障脑脊液循环周期相比于绝大多数外周组织的淋巴引流周期要短。细胞外液的产生、流动及排泄很大程度地影响了脑部给药的效率。为了更好的理解上述观点本文在讨 论脑部给药措施之前将进一步描述细胞外液运行途径。 2.1 细胞外液 成人颅内容纳了约170ml血液约880ml软组织及大约350ml细胞外液。细胞外液在空间上被隔离成软组织间液ISF225ml及脑脊液CSF125ml。颅内此3个部分受到严格控制因而总体积维持在1.4L左右如图2。另外不同部分液体流速存在很大差别例如血液的流速大约620ml/min是脑脊液流速的1000多倍0.35ml/min。对于药物转运有必要了解不同部分的容积、流速及在正常脑中的功能。 图2.脑内容物被分为四个主要部分。其中任何一部分体积的改变必然导致其他部分体积的相应改变从而维持总体积不变。颅骨黑线部分容纳了软组织棕色部分、软组织间液浅棕色部分、血液白色部分、脑实质脑脊液蓝色部分及脑室脑脊液淡蓝部分。血液及其他部分间的联系被严格控制实线部分而脑脊液及软组织间液间存在一些关联虚线部分。直接联系的部分用点状虚线隔开。 细胞外液在脑外伤时作为保护垫同时也是细胞间信号传导中介并能将异物清除出脑软组织。因此细胞外液的生成、组成及其清除受到机体严格调控维持着其恒定的组成及总体积。 已经知道细胞外液被分为软组织间液及脑脊液。尽管在空间上被分隔开两部分液体仍然具有相似的组成及化学上的高度关联性。例如一种液体中注射的示踪剂能够同时进入蛛网膜下腔的脑脊液及软组织血管外周的软组织间液。然而细胞外液不同部分并非均匀混合例如与右测淋巴结相比注入左边软组织间液的示踪剂优先在左测的淋巴节聚集。 细胞外液的化学组成与血浆中不同细胞外液中Mg2及Cl-浓度升高而K、Ca2及氨基酸浓度降低如图3。这与外周器官中细胞外液情况相 3.脑脊液中溶质浓度与血浆中有很大差别。Mg2反后者离子浓度与血浆中相同。 图 及Cl-浓度更高而K、Ca2及氨基酸浓度降低。上表数值为人、狗、猫体内脑脊液及血浆中离子浓度的平均值三种动物脑脊液中溶质浓度近似。 2.2 脑脊液CSF 成人脑脊液约有110150ml其中大概20脑脊液分布于脑室剩余的80分布于脑脊被膜、包围脑的组织连接层。三层脑膜中软脑膜最靠近脑紧贴软组织表面外层依次为蛛网膜及紧靠颅骨的硬脑膜如图4。脑脊被膜内的脑脊液主要分布于软脑膜及蛛网膜之间即蛛网膜下腔。蛛网膜下腔扩张在脑表面形成囊状凹槽以容纳大部分脑脊液。 图4.脑结构。只有软脑膜紧贴脑软组织表面 脑脊液来源于流经脑的血液由侧脑室、第三、第四脑室上皮细胞也即脉络丛分泌脉络丛排列成绒毛状使其表面积增大至约200平方厘米。每根绒毛中间为一直径约15??m的毛细血管血管外覆盖一单层紧密连接的立方形上皮细胞如图5。 图5.A细胞外液由脉络丛上皮细胞分泌B血脑屏障。分泌细胞蓝色由节点红色紧密相连。A脉络丛绒毛横切面由正中间的毛细血管及包围血管的上皮细胞组成细胞被上部的节点紧密相连。脑脊液即由上皮细胞分泌并进入脑室。B被紧密连接的内皮细胞分泌软组织间液间液通过基底膜并穿过周细胞及星形胶质细胞而进入软组织。 脑脊液分泌的第一步是血浆通过直径约60至350nm的内皮孔进行滤过。血清滤过后由于紧密连接的存在不能自由流过脉络丛上皮细胞但脉络丛上皮细胞能活跃地分泌脑脊液。上皮细胞顶部的钠泵、Na/K/2Cl联合转运子、及HCO3、K通道使脑脊液成为高渗溶液。水通过脉络丛上皮细胞上部细胞膜的水通道后将高渗溶液稀释被稀释的脑脊液与血浆成等渗溶液。由于水通道单位面积水渗透率达6×10-4cm3/s如此大的渗透性足以保证通道分泌足够的水而使脑脊液与血浆形成等渗溶液。 脑脊液形成后流经蛛网膜下腔流向由脑软组织的结构及两个主要窝池决定两个分别为小脑延髓池及底池如图6。侧脑室、第三、第四脑室分泌的脑脊液向下流向小脑延髓池至小脑延髓池后脑脊液向后及向上环绕小脑流动或向前绕经脑干后进 入底池。从底池起脑脊液继续前流并主要通过上矢状窦排出。另外脑脊液还能通过大脑小脑间隙回流与来自小脑延髓池中向上并围绕小脑流动的脑脊液汇合。这股脑脊液继续向上向前流也主要通过上矢状窦排出并最终进入静脉循环。 图6.脑脊液在脑中流向。脑脊液由脉络丛产生粉红色流向红色主要两条途径黄色并且主要经上矢状窦及鼻腔通道排出蓝色 矢状窦为厚而硬的硬脑膜包围所成的空腔。脑脊液经蛛网膜下腔清除主要通过下腔上一种称为蛛网膜颗粒的瘤状突起来实现如图7清除的动力为流体静力及胶体渗透压差二种力共同作用的结果导致蛛网膜颗粒产生孔道从而允许大分子物质如白蛋白通过。 图7.矢状窦是脑脊液从脑清除的主要途径。在经蛛网膜颗粒进入矢状窦之前软组织间液从软组织中顺着血管外周途径进入蛛网膜下腔的脑脊液中。矢状窦由硬脑膜所隔成的空腔最终将脑脊液排入静脉系统。 渗透压的改变将直接对脑脊液穿透蛛网膜颗粒产生影响增加脑脊液压力或降低矢状窦压力将有利于脑脊液通过蛛网膜颗粒进入矢状窦。使脑脊液从矢状窦反流是不允许的因为蛛网膜颗粒所产生的孔道只是单向开启。可以推测如果渗透压差反向的话蛛网膜颗粒将会塌陷。 脑脊液清除存在另一条有争议的途径即通过鼻腔粘膜脑脊液从这条途径清除的量约占50。此途径起源于小脑延髓池它允许脑脊液顺着嗅觉神经进入血管丰富并含淋巴传出通道的鼻腔粘膜下层。鼻腔粘膜下层血管密布并具有小孔允许示踪物质如EDTA及菊粉分子从脑脊液进入血液循环。另外有大量的水同时进入血液因为已经证实淋巴节前蛋白浓度高于淋巴节后蛋白浓度。 鼻腔粘膜下层的多孔结构还不足以让微粒或大分子蛋白质通过因此脑脊液中的示踪剂分子仍然通过传统的淋巴途径排入颈部淋巴节。由于鼻腔粘膜途径没有蛛网膜颗粒参与因此认为对于儿童更为重要因为儿童的蛛网膜颗粒尚未发育完全。但成人脑脊液通过这条途径清除的作用仍然不很明确。 2.3 软组织间液ISF 成人脑软组织细胞外空间内约有200250ml软组织间液约占整个脑软组织体积的15。软组织间液来源于毛细血管中的血液由毛细血管壁分泌成人毛细血管表面积约为20平方米。尽管分泌软组织间液区域的面积约为分泌脑脊液区域面积的1000倍前者的分泌速率仅为后者的1/10这点已从老鼠试验得到证实。软组织间液分泌速率的缓慢也导致其循环周期的延长循环一个周期约需10个小时而脑脊液循环需2.5小时。 不同于脑脊液分泌软组织间液不是血脑屏障的血浆滤过液。脑毛细血管内皮由一层基底膜包围基底膜又包了一层由纵杂交错的星形胶质细胞组成的鞘。上述结构组成了所谓的血脑屏障其中毛细血管内皮主要负责产生并调节软组织间液进入软组织间隙这种调节功能部分依赖于外周星形胶质细胞所发出的信号。内皮细胞之间的紧密连接降低了毛细血管壁的通透性使得物质想要通过屏障会象通过细胞膜一样困难。并且血脑屏障的水力传导系数要比外周组织毛细血管的小2到3百倍因此内皮几乎不存在胞饮。 血脑屏障如此低的水力传导系数部分原因在于内皮细胞极小的水通道蛋白表达内皮细胞不具有AQP1水通道蛋白1而只有极低水平的AQP4水通道蛋白4。宏观上透过血脑屏障的水力传导系数可由测定细胞膜电阻获得其平均大小是外周毛细血管的2到3百倍。 软组织间液分泌后在软组织间隙进行初步混合其总体流动主要限于白质及外周血管间隙。在白质中软组织间液能更为自由的流动大粒径的示踪物如墨汁平均直径约250nm会顺着纤维丛的方向流动。 在灰质中间液总体流动主要集中在血管外周间隙而不是直接通过软组织原因就在于血管外周间隙对流体所造成的阻力要小的多。流阻主要是由通道宽度决定的血管外周间隙宽度约为500nm而相邻的软组织细胞间隙只有10至20nm。除了血管外 周更低的流阻外血管有戒律性的蠕动也对间液流动有一定影响。 正是由于软组织间液总体流动不是通过脑软组织间液的清除也就主要是顺着血管外周间隙与蛛网膜下腔中的脑脊液汇合。由于血管外间隙与脑部脉管系统是并行的所以这条途径对于软组织间液的清除非常理想。使用一些小分子的示踪剂? 懈 俜?钟幸恍〔糠值娜碜橹 湟和ü 泳跬ǖ阑蚱渌 谏窬 宄 杂谀约挂呵宄 此嫡庑?ǖ啦惶 匾 ?软组织间液清除速率与机体淋巴液平均清除速率相当约为0.03??l/g组织/min。除了软组织间液清除途径外细胞外微粒的清除还通过吞噬细胞如小胶质细胞及大动脉大静脉外周的巨嗜细胞如墨汁微粒及脂质体就会被吞噬细胞带入血管外周或被巨嗜细胞吞噬。 2.4 脑肿瘤改变生理及生化状况 脑肿瘤生长将导致脑部流体运行状况的一系列改变。例如肿瘤如果生长太快的话就会对流体通道适当进入或偏离肿瘤区域造成阻碍而通道受阻就导致流体在肿瘤细胞外区域蓄积。由于颅骨限制了脑的体积流体蓄积将增加肿瘤区间隙及相邻正常脑组织区间隙的压力。脑肿瘤继续生长就会压迫颅内痛觉敏感部位如血管、矢状窦及颅神经从而导致头痛。更为严重的是脑部血流将会受阻致使局部缺氧及神经元死亡。由于神经元之间是彼此相连的某些神经元从其固定位置被清除就会影响神经元间正常的信号传导从而导致神经综合症如癫痫、感觉失灵、运动障碍及认知能力的改变。 从血脑屏障进一步渗出的流体将加剧蓄积程度。转移肿瘤的孔隙及内皮细胞间隙都将扩大达到5nm甚至1??m。与正常脑血管相比肿瘤区血管基底膜要更薄使液体从毛细血管渗出的障碍减小。 除上述器质性改变外肿瘤内内皮细胞表达更高水平的AQP1及AQP2水通道水通道的高度表达加速水从血液至软组织的运行。由于正常脑内皮细胞水通道表达几乎为零肿瘤区内皮细胞水通道的高度表达就扮演着正相调控的肿瘤生长因子的作用。而且已经发现肿瘤细胞表达水通道4的水平提高了35倍从而加速流体从细胞外进入细胞内。流体进入细胞内降低了细胞外液的清除效果而增加了肿瘤内压力。另外即使是数量很小脑肿瘤内皮细胞上药物外流性转运蛋白的存在也将对药物在肿瘤中分布产生重大影响。 肿瘤区血流量的减少药物外流性转运蛋白的存在组织间隙压力的增加上述种种因素都对系统给药脑肿瘤区药物的吸收产生影响。 3.脑肿瘤动物模型 建立合适的脑肿瘤动物模型可以归结到化学治疗的发展历程当中。评价治疗时动物及肿瘤类型的选择肿瘤诱导机理及肿瘤类型适当的给药方案都是必须考虑的。脑肿瘤动物模型的建立可以是自发或人工移植的。自发性模型可以通过持续给予致癌物质或肉瘤病毒进行诱导。然而自发性模型肿瘤生长速率是不一致的并且肿瘤接受性差。因此这种技术不是进行化疗研究的首选。但也通过此技术成功地获得了一系列的脑肿瘤细胞株如9L神经胶质肉瘤及F98神经胶质瘤。另外进行手术切除时也能获得人脑肿瘤细胞株。 肿瘤细胞株可以同位移植至脑或皮下移植至胁等部位。很早就知道肿瘤细胞生长受环境影响很显著同位移植的肿瘤受治疗方案的影响比皮下移植的要大。最近研究了人脑胶质瘤细胞株U251及U87分别在免疫妥协大鼠体内自然生长、皮下生长、脑内生长的基因表达谱结果进一步佐证了上述观点。两种细胞株自然生长的基因表达谱差别很大但脑内生长表达谱近似。在脑内两种细胞株表达了更多与中枢神经系统基因表达产物相关联的基因。 选择小动物建立脑内肿瘤模型后大多数化学治疗试验选择的动物都是大鼠。大鼠的脑容量足以保证肿瘤移植手术的重复性同时要获得有显著统计学意义的治疗组在经济上也是可行的。对快速生长的肿瘤如来自Fischer大鼠的神经胶质肉瘤在移植后五天内连续给予全身化疗发现生存时间有所延 长但如果治疗时间再拖延几天发现有效率将大大下降。 除了治疗时间外适当的肿瘤模型的选择对于准确评估治疗方案也有重要意义。例如硼捉中子捕获治疗对大鼠神经胶质肉瘤有很好疗效但对大鼠F98神经胶质瘤疗效确一般F98神经胶质瘤对辐射及其他方式的化疗具有高度抵抗性 仅仅依据肿瘤模型对治疗方案有所反应仍然难以判断所观察到的疗效确实就是治疗方案产生的直接结果。即使在同源寄主许多大鼠脑肿瘤模型仍然会产生免疫原反应。这种致免疫反应可以通过使用免疫妥协的动物而得到降低免疫妥协动物能够耐受大鼠脑肿瘤同种异体移植及人体脑肿瘤异种移植。组织受损也会导致致免疫反应。有一些治疗手段是直接使用导管将药物导入肿瘤这就会导致外伤及局部感染从而改变毛细血管通透性及肿瘤区免疫学环境。在评价对啮齿类动物肿瘤模型进行基因治疗时这点应该引起特别的重视。在模型选择及给药途径方面Fross及其同仁已经有过论述。 小鼠脑肿瘤模型在化疗研究中的应用要少得多因为小鼠个头太小而脑部肿瘤移植需要高度的精密性这使得通过静脉或腹腔之外的途径给药变得非常困难。但即使有上述问题小鼠还是被广泛地应用于基因给药研究。依据本体论原理而模拟人脑肿瘤建立的转基因模型为研究脑肿瘤的发病及病变提供了一个有前景的手段。 4.脑部给药 当前脑肿瘤给药方案集中在对如下给药部位的探讨静脉给药、动脉给药、脑室内给药、鞘内给药及软组织内给药。上述不同部位给药将药物送至软组织间液/脑脊液流经路径的不同位置药物依据不同部位空间大小及流体产生及清除速率将分布于脑内不同部位如图8。给药部位的不同会对肿瘤区、正常脑组织、全身器官的药物浓度产生深刻影响而药物表现出的药效、毒性也会有很大差别。 图7.如图所示不同部分代表在人脑相对固定的容积。灰色箭头表示药物扩散路径可能存在反方向扩散箭头宽度及空心箭头代表相对流速。蓝色箭头表示可从此部位直接给药箭头宽度表示相对给药量。 药物转运至脑软组织的效果在很大程度上受药物理化性质的影响。药物血浆及脑脊液中半衰期、非特异性与血浆蛋白结合的水平、通过血脑屏障及外周组织的通透性、代谢速率及脑部结合状况等种种因素都对药物脑软组织浓度产生影响。 静脉内全身给药是最为常用的给药途径这条途径能给予机体最大的药量。然而由于血脑屏障及细胞外液快速清除异物的原因药物多分布于外周器官而进入脑部的药量极少。例如给猴子静脉注射替莫唑胺发笑脑部药物浓度比血浆浓度低得多。尽管有上述缺点在临床试验中仍然显示疗效并已被FDA批准。 为了增加脑部药物分布减少外周组织分布可以采用脑室或鞘内给药以将药物直接输送至脑脊液分布区域。尽管这种方法对治疗脑室周及脑膜肿瘤有效药物进入脑软组织仍然有限进入软组织肿瘤的效果也就差得到。如果要增加药物软组织分布可以采用脑软组织直接给药。下文将简要介绍全身给药及局部给药两种脑部给药方法重点介绍一下脑肿瘤给药。对于其他类型的中枢神经系统疾病的治疗对给药系统有不同的要求例如中风后紧急抢救必须使药物迅速而准确地分布于受伤部位而对于退变性疾病则需对特定部位长期给药。 4.1 全身给药 为改善血液直接注射这种全身给药方法已经采取了一系列措施来增加小分子药物透过血脑屏障的通透性。这方面已经有文献进行了进一步的综述这些措施包括修饰药物化学结构、动脉内给药及破坏血脑屏障。例如可以通过化学手段使化疗药物进行结合以增加药物对血脑屏障的粘附力还可以增加药物分子的亲脂性。但上述方法常常改变药物血浆中动力学也可能降低药物分子对肿瘤细胞的毒性。动脉直接给药不会改变药物本身性质可得药物不经外周组织直接进入脑部脉管系统避免了肝首过效应。化疗药动 脉给药常常伴随使用缓激胎受体促进药CereportTM或高渗透性物质如甘露醇。因为上述物质分子增加了整个脑部血脑屏障的通透性因此必须加强病人监护以降低癫痫发作及颅内压增高的风险。上述改善全身给药效果的措施在小分子药物治疗肿瘤方面取得了一定成效。但由于绝大多数小分子药物血浆半衰期较短所以需要多次给药。为延长药物清除半衰期药物可以制成聚合物或脂类为载体的给药制剂。 4.1.1 微粒型药物载体 微粒型药物载体粒径从小于100nm至约300nm。肿瘤区存在所谓的通透性及保留率增强效应ERP这是由肿瘤区脉管系统存在泄漏淋巴系统发育不完善所造成的这种效应可使药物载体在肿瘤区蓄积。目前已经对以脂类为载体的药物制剂全身给药进行了一些临床前动物模型及人体临床研究。当前给药系统主要是非靶向性的但可通过使用抗体来对抗如转铁蛋白受体、小分子多肽或碳水化合物等来实现靶向给药。脂质体也可作为药物载体而与光动力学或热敏型给药系统协同使用。目前有如下药物被制成脂质体或脂类为载体的药物制剂用于肿瘤治疗3油酸7β羟基胆甾醇、硼卡钠、顺铂、阿糖胞苷、阿霉素、帕尼特西及光敏.