过氧化物酶活性测定-滴定

过氧化物酶活性测定-滴定 实 验 八 过氧化物酶活性的测定 一、实验目的: 学习和掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原 理及方法。 二、实验原理: 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植 物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中 活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使 组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程 度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加， 所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过 氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物， 此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化 合物。本实验是以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物 酶的底物，在该酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红 棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为: 该红棕色的物质在波长470nm处有最大光吸收，故可 通过测470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性。 三、实验、主要仪器和试剂 1( 材料:三叶草,苦豆子叶片 2( 仪器: (1)分光光度计; (2)电热恒温水浴锅; (3)离心机; (4)天平 (5)25mL容量瓶; (6)电炉等 3(试剂: (1) 0.05M磷酸缓冲液(pH5.5) (2) 0.05M愈创木酚溶液 (3) 2%H2O2溶液 四、操作步骤 1(酶液提取:称取0.5g大麦苗于研钵中?加入 2ml磷酸缓冲溶液?研成匀浆?转入离心管中 ?再加3ml磷酸缓冲溶液冲洗研钵?转入离心 管中?等重? 8000r/min离心10min ?取上清 液转入25ml容量瓶?沉淀用5ml磷酸缓冲溶液 再提一次?上清液并入25ml容量瓶定容。 2、过氧化物酶活性测定: 0.05M 酶 2% 0.05M 冷 沸 磷酸 沸 愈创木 液 H O 37? 却 2 2 缓冲 编 水 酚溶液 (ml) OD470nm (ml) 水 液 (ml) 水浴 浴 号 (ml) 浴 5 CK 0.1 2.9 1.0 1.0 调零 min 10 测 min 6 定 0.1 2.9 1.0 1.0 , 管 min 五、结果计算 以每分钟光密度(OD470nm)变化0.01为1个过氧化 物酶活力单位，即: ?OD470nm ×D 过氧化物酶活力= 0.01×t ?OD470nm 过氧化物酶比活力= ×D 0.01×wt t:反应时间 W:大麦苗鲜重 D:稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数 六、附注 酶的提取纯化需在低温下进行。 七、思考 测定酶的活力要注意控制哪些条件, (1)保持待测材料的酶活;(2)测定时注意控制反应时间; 分光光度技术 基本原理:利用紫外光、可见光、红外光 和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸 收光谱对物质进行定性定量和物质结 构分析的方法，称为分光光度法或分光光 度技术，使用的仪器称为分光光度计。 光吸收定律: 朗伯—比尔(Lambert,beer)光吸收定律: A,,lgT,εb c A 吸光度，又称光密度“O.D”。 T 透光度， T,I / I。 (I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强) ε摩尔吸光系数或克分子吸光系数L?mol,1?cm,1) 是物质对某波长的光吸收能力的量度。 b 样品光程(cm)。 C 样品浓度(mol/L)。