【doc】人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定

【doc】人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定 人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱 导破骨细胞方法的建立和鉴定 第33卷第5期 8242007年9月 吉林大学(医学版) JournalofJilinUniversity(MedicineEdition) Vo1.33No.5 Sep.2007 [文章编号]1671—587X(2007)05—0824—03 人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨 细胞方法的建立和鉴定 梅红,李一雷,王心蕊.,张丽红,刘巍,王建民.,李玉林 (1.吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室,吉林长春130021;2.吉林大学人兽共患病研究所 人兽共患病教育部重点实验室,吉林长春130062;3.吉林省中西医结合医院骨科,吉林长春130021) [摘要]目的:建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)与人成骨细胞共培养体系,为人破骨细胞体外培养提供 更完善的方法.方法:采用酶消化法分离流产胎儿头盖骨,获取人成骨细胞,对在体外培养的成骨细胞进行碱 性磷酸酶染色(ALP染色);利用Percoll梯度分离法和贴壁筛选法培养hMSCs,应用流式细胞术检测hMSCs免 疫学型,对其进行鉴定;将获得的成骨细胞和hMSCs在体外共培养作为实验组,单独培养的成骨细胞作为对 照组;对诱导后的细胞应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)进行鉴定.结果:体外分离,培养的hMSCs具 有独特的细胞免疫学表型,即CD73和CD105阳性,CD34和CD45阴性.hMSCs与 成骨细胞共同培养5d后, 即可见单个核细胞融合成多核细胞,TRAP染色可见多数细胞胞浆呈酒红色,为诱 导成功的破骨细胞. 结论:hMSCs与人成骨细胞共同培养能诱导为具有典型的破骨细胞表型的多核细 胞. [关键词]破骨细胞;骨髓间充质干细胞;成骨细胞 [中图分类号]Q813.1[文献标识码]A culture EstablishmentofmethodtoinduceosteoclaststhroughCO— ofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsandosteoblasts MEIHong,LIYi-lei,WANGXin-rui.,ZHANGLi—hong,LIUWei,WANGJian— rain.,LIYu—lin (1.KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,SchoolofBasicMedicalSciences,JilinUniversity, Changchun130021,China;2.KeyLaboratoryofZoonosis,MinistryofEducation,InstituteofZoonosis, JilinUniversity,Changchun130062,China;3.DepartmentofOrthopedics,Hospitalof IntergrationofTraditionalandWesternMedicineofJinlinProvince,Changchun130021,China) Abstract:ObjectiveToestablishaco— culturesystemofhumanbonemarrowmesenchymalstemcells(hMSCs) andosteoblaststOgethumanosteoclasts.MethodsTheosteoblastswereobtainedwithcollagenaseandthealkaline phosphatasestainingwasusedtOtesttheformofosteoblasts;hMSCswereisolated,cultivatedandproliferatedby Percollgradientcentrifugation.CoculturehMSCsandosteoblastswerecultivatedtogether,andosteoclastswere identifiedwithtartrate-resistantacidphosphatase(TRAP)staining.ResultsHighhomogenoushMSCswere obtainedandafterCO—culturefor5dwithosteoblasts,theyfusedtOformmultinuclearcellclustersinmicrographand werepostiveinTRAPstaining.ConclusionTheCO—culturesystemmethodissuccessfu1.Withthismethod osteoclastscanbeobtainedfromCO—cultureofhMSCsandosteoblasts. Keywords:osteoclastsbonemarrowmesenchymalstemcells;osteoblasts 破骨细胞(osteoclast,OC)是1873年由英国人koliker首次发现的.破骨细胞直接参与骨吸 [收稿日期] [基金项目] [作者简介] [通讯作者] 2OO7一O3一l2 国家863重大专项资助课题(2004AA205020) 梅红(1977一),女,黑龙江省宁安市人,医学博士,主要从事干细胞组织工程学研究. 李玉林(Tel:0431—85619481,E-mail:liyl@jlu.edu.cn) 梅红,等.人骨髓问充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定825 收,在骨塑造和重塑过程中发挥重要作用.体外培 养破骨细胞是研究破骨细胞特性的重要手段.但破 骨细胞培养比较困难,其成活率低,需要的刺激因 子较多等口],限制了破骨细胞的深入研究.目前, 国内外对动物破骨细胞分离方法研究较多,而人破 骨细胞的实验研究相对较少l_1].本实验采用人骨髓 间充质干细胞(hMScs)和人成骨细胞体外共培 养的方法,获得人破骨细胞,为人破骨细胞生物学 特性及其调控的研究奠定基础. 1与方法 1.1主要试剂低糖DMEM(L—DMEM, Hyclone,USA),胎牛血清(Hyclone,USA), Percoll(Pharmacia),抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)试剂盒(天津血液病研究所), 1,25(OH)2D3(Sigma,USA),抗CD73, CD105单克隆抗体购于BD公司,抗CD34, CD45单克隆抗体购于Neomarker公司. 1.2hMSCs的分离培养取肝素化人骨髓血与等 DMEM混合,1000r?min离心5rain,弃 量L— 上清,加入等体积Percoll,2500r?min离心 30rain.抽取单个核细胞层,用含10胎牛血清 的L,DMEM重新悬浮细胞,以1×10?mL接种 于6孔培养板中,置于37?,5CO培养箱中常 规培养.24~48h后首次换液,以后每隔3d换液 1次.培养细胞汇流接近80时,以1:3比例传 代培养]. 1.3流式细胞术检测hMSCs免疫学表型 0.25胰酶消化收集hMSCs,分别取1×10个细 胞与抗CD73,CD105,CD34和CD45抗体(效 价均为1:50)室温孵育30,40rain, 0.1mol?LPBS洗涤2次,滴加FITC标记的二 100 75 詈5O 0 U25 0 lO2lO3lOlO5 FITC—A CD73-FITC lOO 75 ?50U 25 0 lO2lO3lOlO5 FITC—A CD29-FITC 抗,避光孵育30min,0.1mol?LPBS洗涤 2次后悬浮,采用流式细胞仪. 1.4成骨细胞的分离培养与鉴定分离流产胎儿 颅盖骨,剪碎,37?胰酶消化15rain,血清终止, 离心,37?胶原酶消化20min,将细胞接种于3个 培养瓶内,加4mL含血清DMEM培养液培养, 置于37?,5CO饱和湿度培养箱中常规培 养.ALP染色采用Gomori改良钙钴法染色. 1.5hMSCs与成骨细胞共培养将成骨细胞(细 胞密度为2×10?mL)与hMSCs细胞(细胞密 度为2×10?ml)消化后,加入预先放好玻璃 盖片的6孔板内,同时加入1,25(OH)zD.(浓度 10mol?L).以单独培养的成骨细胞(细胞密 度为2×10?mL)作为对照组.实验重复 3次,观察结果. 1.6破骨细胞形态观察对诱导的细胞进行活体 观察.TRAP是破骨细胞特异性的标志3].于培养 第2,5和8天取玻片,根据试剂盒说明进行 TRAP染色,光镜下观察.含2个胞核以上且呈 TRAP染色阳性的多核巨细胞即为破骨细胞. TRAP染色具体步骤见说明书. 2结果 2.1hMSCs的分离与培养细胞接种48h后换 液,可见散在生长,分布不均的单个细胞,细胞呈 成纤维细胞样,核呈椭圆形.第7天时,细胞汇流 达80,呈漩涡状排列(图1,见封二).此时以 1:3比例进行传代. 2.2hMSCs的表型特征流式细胞仪结果显示, hMSCs具有独特的免疫学表型,未分化的hMSCs 细胞CD73和CD105阳性,CD34和CD45造血谱 系和内皮细胞标记则呈阴性(图2). lOO 75 暑5O u25 0 HTC—A CD105-Frrc 90 80 70 60 50 40 30 20 】0 0 Fig.2PhenotypiccharacterizationofhMSCs(flowcytometry) 吉林大学(医学版)第33卷第5期2007年9月 2.3成骨细胞的分离培养与鉴定倒置相差显微 镜下,接种成骨细胞完全贴壁,细胞形态不规则, 多呈三角形,多角形,有较多的突起,单核呈卵圆 形,胞质丰富,清晰(图3A,见封二).经Gomori 改良钙钴法染色,本实验培养的细胞大多数细胞核 及细胞质上形成了灰黑至深黑色的颗粒状或片状沉 淀(图3B,见封二),显示强阳性,符合成骨细胞 特征. 2.4破骨细胞的鉴定成骨细胞和hMSCs共培 养5d后可见破骨细胞样细胞胞体很大,呈圆形, 椭圆形,长条形或不规则形,有片状或丝状伪足, 含几个到十几个细胞核.经TRAP染色可见实验 组中多数细胞胞浆呈酒红色,含多个核;单独培养 的成骨细胞即对照组不显色.经苏木素复染后,核 呈紫蓝色(图4,见封二). 3讨论 Chamber'S等于1984年从新生动物体内首 次成功地分离出了破骨细胞,破骨细胞是骨组织吸 收的主要细胞.许多骨代谢性疾病的发生,如骨质 疏松症,Paget病等都与破骨细胞有关.虽然破骨 细胞在骨代谢性疾病中发挥重要作用,然而破骨细 胞体外分离培养是比较困难的,目前多数学者集中 于动物破骨细胞分离培养的研究.本实验采用酶消 化法分离获取人成骨细胞和用密度梯度离心法获得 hMSCs,将其在体外共同培养,获得人破骨细胞. 成骨细胞在破骨细胞诱导分化过程中起到重要 的调控作用.成骨细胞通过细胞与细胞直接接触方 式调节破骨细胞增殖,生存,融合等功能].据报 道],成骨细胞具有调节破骨细胞分化的特性.如 果在共同培养体系中用透膜将骨髓细胞,即破骨细 胞前体与成骨分隔开,即使加入任何诱导因子均不 能诱导生成破骨细胞.由此可见,成骨与破骨细胞 前体的直接接触是破骨细胞形成,分化过程中必不 可少的因素之一.本研究构建了hMSCs和人成骨 细胞的共培养体系,把成骨细胞和hMSCs直接混 合在一起培养,获得人破骨细胞. 破骨细胞体外鉴定方法很多,本实验采用最常 用的方法:TRAP染色].已公认酸性磷酸酶与破 骨细胞及骨吸收有关,组织化学染色显示破骨细胞 胞浆内含有丰富的酸性磷酸酶,但酸性磷酸酶并非 破骨细胞所特有,因为成骨细胞也含有少量的酸性 磷酸酶,TRAP是破骨细胞的酸性磷酸酶同功酶, 为破骨细胞所特有,通常作为鉴别破骨细胞的重要 标志].该酶是破骨细胞的特异性酶,萘酚AS_ BI磷酸盐能和该酶产生特异的不溶性酒红色沉淀. 本研究TRAP染色结果显示,破骨细胞胞浆呈酒 红色. 综上所述,采用hMSCs和人成骨细胞体外共 培养诱导破骨细胞的方法是成功的,该方法比新生 动物的直接分离法简单易行.更为重要是所培养的 是人的破骨细胞,为人破骨细胞生物学特性及其调 控的研究奠定了基础,更具有应用前景. [参考文献] [1]MoriSA.Osteoclastdevelopmentinimmobilizedboneis suppressedbyparathyroidectomyinmice[J].JBoneMiner Metab,2005,23(1):8-l4. E2]郭新,赵东海,何旭,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离 培养[J].吉林大学:医学版,2005,31(3):469—471. [3]IgarashiY,LeeMY,MatsuzakiS,eta1.Acidphosphatases asmarkersofbonemetabolism[J].JChromatogrBAnalyt TechnolBiomedLifeSci,2002,78l(1-2):345—358. [4]ChambersTJ,Revel1PA,FulLerK,eta1.Resorptionofbone byisolatedrabbitosteoclasts[J].JCellSci,1984,66(5): 383—399. [5]vonKnochF,ClaudeJ,MarcK,eta1.Effectsof bisphosphonatesonproliferationandosteoblastdifferentiation ofhumanbonemarrowstromalcells[刀.Biomaterials,2005, 26(34):6941-6949. [6]TakanoriD,YoshinoriY,AmiF,eta1.Ultrastructuralstudy ofcell—cellinteractionbetweenosteoclastsandosteoblasts/ stromacellsinvitro[J].AnnAnatAnatomischerAnzeiger, 2002,184(3):221-227. [7]AnderssonGN,MarksSC.Tartrate—resistantacidATPaseas acytochemicalmarkerforosteoclasts[J].JHistochem Cytochem,1989,37:ll5—12l_ [8]Perez—AmodioS,VogelsIMC,SchoenmakerT,eta1. 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