MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周神经系统CD4^＋T及CD8^＋T调节性细胞变化

MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周神经系统CD4^＋T及CD8^＋T调节性细胞变化 [标签:标] 746 ? 论着? 8738细胞与分子免疫学杂志 ISSN1007— (ChinJCellMolImmuno1)2010,26(8 文章编号:1007—8738(2010)08—0746—04 MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周神经系统 CIM+T及CD8T调节性细胞变化 尚晓峰,席娜娜,王潭,吕锦,韩钊,郑荣远 (温州医学院附属第一医院神经内科,实验神经生物学研究所,浙江温州325000) Thechangeofperipheryandcentra[Keyw.rd]cD4cD25Treg;cDcD2一Tg;experi_ CD4CD25Treg,CD8CD28一Tregpm Ie en s t c a I l er a . u s t i o s im ;r m eg u u n I e at. e ry nce T p c h e a II lomye’’s;mu._ intheMoGinducedmodelofexperi- mentalautoimmuneencephalomyelitis SHANGXiaong,XINa—n,WANGTan,LUJin, HANZhao,ZHENGRong—yuan DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalandRe— searchInstituteofExperimentalNeurobiology,WenzhouMedical College,Wenzhou325000,China [Abstract]AIM:Toobservethechangeofperiphery andcentraCD4CD25Treg,CD8CD28一Tregof MOG35— 55 inducedEAEdiseaseinmouse,andtoexplore thepotentialmechanismofcellularimmunityintheprocess ofEAE.METHODS:MOGwereusedtoestablishEAE modelonfeminaC57BL/6mice.Thebehavioralchanges andthehistologicalscoreswererecorded.Thechangesof CD4CD25Treg,CD8CD28一Tregonperipheryandcen- tralymphocyteinspleen,brainwereanalyzedbyflowcy- tometry.RESULTS:MOG35—55-inducedEAEgroupShowed thetypicalclinicalbehaviorandpathologicalmanifestations, CD4CD25Treg,CD8CD28一Treglymphocyteswerede- tectedinthebrainandspinalcordofEAEgroupmice,but theywerenotdetectedinthebrainofcontrolgroup.CD8 CD28一TreginthespleenofEAEgroupwerelowerthan thoseincontrolgroup(P<0.01).CD4CD25Treglym- phocyteswereslighthigherthanthecontrolgroup.CON- CLUSION:CD4CD25Treg,CD8CD28一Treglympho- cytesallplayimportantrolesinthepathogenesyofEAE. ThedistributionofCD4CD25Treg,CD8CD28一Tregin theCNSandperipheralofEAEisdifferent,suggestingthat theirentryintotheCNSandregulateofIocalinflammation. 收稿日期:2010—0l一08;接受日期:2010—03—08 基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y207494) 作者简介:尚晓峰(1984一),女,河南商丘人,在读硕士 E—mail:xiaofeng8435@163.corn Correspondingauthor,E—mail:zbengry@yahoo.com.cn [摘要]目的:观察实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及 外周CD4CD25调节性T细胞(CD4CD25Treg),CD8 CD28一调节性T细胞(CD8CD28一Treg)表达的变化情况,并 探讨相关的细胞免疫学机制.:雌性C57BL/6小鼠随机 分为未使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35—55(MEVGWYR? SPFsRVVHLYRNGK)(MOG竹1)免疫的对照组和使用 MOG35免疫诱导的EAE小鼠模型组,采用临床症状评分记 录小鼠行为学变化,HE染色观察CNS炎症细胞浸润及病理 改变,使用流式细胞术(FCM)检测小鼠中枢及外周CD8 CD28一Treg,CD4CD25Treg细胞表达水平.结果: MOG,一诱导的EAE模型组动物出现典型的EAE临床行为 学及病理学表现,FCM检测EAE模型组小鼠脾细胞CD4 CD25Treg较对照组升高但无统计学差异,CD8CD28一Treg 表达水平明显低于对照组(P<0.01),EAE模型组中枢有 CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg淋巴细胞的浸润,且 CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg在中枢的表达均高于外 周,对照组中枢神经系统未检测到淋巴细胞浸润.结论: CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg均参与调控EAE的病理 过程,CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg在EAE小鼠中枢 及外周分布及变化的不同,提示其进人中枢神经系统(CNS) 并参与调节中枢局部炎症. [关键词]CD4CD25Treg;CD8CD28Treg;实验性自身 免疫性脑脊髓炎;多发性硬化;调节性T细胞 [中国分类号]R392.12【文献标识码]A 多发性硬化(multipulesclerosis,MS)是中枢神经 系统的自身免疫性疾病,主要病理变化包括慢性炎 细胞浸润,白质脱髓鞘改变.实验性自身免疫性脑 脊髓炎(experimentalautoimmuneencepha10myelitis, EAE)由CD4T细胞介导,对髓鞘抗原产生免疫应 答的自身免疫性疾病,是目前国际公认的研究MS的 理想动物模型.目前认为在感染和应激情况下,T细 胞在外周活化,通过血脑屏障(bloodbrainbarrier, BBB)后进入中枢神经系统,引起胶质细胞活化及产 生相关细胞因子,进而引起一系列级联反应引发 EAE.近年来调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg) ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellMolImmuno1)2010,26(8 在自身免疫性疾病中的作用备受瞩目,对MS的研究 尽管已经证明I型辅助性T细胞(Th1)在发病中起重 要作用,但对于其他免疫细胞,包括CD4CD25 Treg,CD8Treg等也能通过诱导或调控MS患者 CNS内的免疫应答而参与其发病过程的研究越来越 受到关注. MS的主要病理变化是中枢的炎性白质脱髓鞘, 目前对于MS的研究由于标本取材限制,只能检测到 患者外周血及脑脊液中淋巴细胞变化,极大的限制 了对此病的相关致病机制及治疗的深入研究.EAE 可模拟MS神经功能及病理学上的改变,是研究MS 的典型动物模型_2J.因此本实验室使用MOG 成功诱导出稳定的小鼠EAE模型,通过分离检测 EAE模型组小鼠大脑及脊髓中淋巴细胞,及检测 EAE模型组,对照组小鼠外周脾脏的淋巴细胞,分 析CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg在EAE病理 过程中表达水平的变化,并探讨可能的细胞免疫学 机制,为进一步揭示EAE发病机制提供理论依据. 1和方法 1.1材料SPF级C57BL/6小鼠12只(雌性,5,6周龄,体 质量14—16g),购自北京军事医学科学院实验动物中心.动 物购回后适应性饲养1周,饲养条件为室温22,27~C,相对 湿度40%一70%,自由饮水,分笼饲养.纯度>95%的髓鞘 少突胶质细胞糖蛋白35—55(MEVGWYRSPFSRVVH- LYRNGK)(myelinoligodendroeyteglycoprotein,MOG55)购于 西安联美生物科技有限公司;人结核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis,H37RA)购于美国Difco公司;不完全弗氏佐剂 (Freund’sAdjuvantIncomplete,IFA),百日咳毒素(Pertussis toxin,PT),淋巴细胞分离液(Percoll液)购于Sigma公司;D— PBS购于Gibco公司;BSA购于GENERAYBIOTECH公司;淋 巴细胞表面标记抗体购于美国eBioscience公司;流式细胞仪 (FACSCalibur)为BD公司产品. 1.2方法 1.2.1抗原制备用0.01mol/L的PBS将MOG55稀释成 2g/L,用IFA稀释H37RA为终浓度8g/L的完全弗氏佐剂 (Freund’8Adjuvantcomplete,CFA);将MOG55稀释液(对 照组用PBS代替MOG稀释液)与CFA接三通管等体积快 速混匀10min,至油包水状态,制备成抗原乳剂. 1.2.2EAE模型制作及实验分组对照组EAE组小鼠各6 只.EAE组小鼠颈部,双侧背部,尾根部分4点皮内注射抗 原乳剂0.2mL/只,免疫后0,48h给腹腔注射PT0.2mL/ 只,免疫当日计为0d,所有小鼠均在免疫当天早晚称体质 量,观察行为,神经功能表现,发病潜伏期,发病开始记录神 经功能评分. 1.2.3神经功能评分采用Weaver15分法J,此法为 各项累计积分,尾巴:0.无异常,1.尾半瘫,2.尾全瘫;四 747 肢:0.无异常,1.步态改变,2.轻瘫,3.全瘫(每个肢体分开 评分,四肢全瘫计12分);死亡为15分. 1.2.4组织病理学检查及评分标准小鼠于发病高峰当天 麻醉后心脏灌注处死,取腰髓常规石蜡包埋,每隔25m间 断连续切片,片厚5I,zm,进行苏木精一伊红(HE)染色,光镜 下观察病理变化及炎化;1炎症细胞浸润仅限于血管周围;2 脊髓内轻微的炎症细胞浸润(1—101/片);3脊髓内中度症浸 润情况.组织病理学评分参照5分法(OkudaY,1999年)Es] (400倍镜下计数):0没有炎症变的炎症细胞浸润(11—100/ 片);4脊髓内重度的炎症细胞浸润(>100/片). 1.2.5中枢及外周淋巴细胞分离及检测小鼠发病高峰期 麻醉后心脏灌注处死,给予预冷的PBS液经主动脉灌流至无 血液流出时小心取出小段脊髓及部分脑组织40g/L多聚甲醛 固定留做病理学检查,余一半大脑,脑干,颈胸髓,脾脏置入 预冷PBS液中,传至超净台用做FCM检测,使用pH值为7.4 的DPBS液使组织湿润,剔除软脑膜和血管等结缔组织,用虹 膜剪在不用外力条件下剪成乳糜状,小心研磨使脑组织中的 淋巴细胞游离,200目尼龙网过滤,用DPBS清洗1次,组织 沉淀物用40%Percoll液重悬后移入70%Percoll液液面上方. 加样时,使Percoll液沿管壁平稳流下,形成满意的界面, 600g,25~C,离心20min,在40/70界面部位出现白色雾状 层,即为淋巴细胞,用含20g//LBSA的0.01mol/L的DPBS 液清洗2次.调整细胞密度至5×10/100,加淋巴细胞表 面标记抗体CD4,CD25,CD8,CD28及阴性对照,避光孵育 30rain,PBS液清洗后加入l0g/L甲醛PBS150/xL待测. 脾脏单细胞悬液的制备:首先去除脾脏周围脂肪及纤维组织, 针刺法制备脾脏细胞悬液,使用红细胞裂解液去除红细胞, PBS清洗后细胞计数,调整细胞密度至1X10./100,之后 操作同中枢标本制备.细胞标本由专业人员使用流式细胞仪 (FACSCalibur)(BectonDickinson)检测,数据采用Cell Quest. 1.2.6统计学分析使用SPSS16.0统计软件进行统计分 析,发病潜伏期,临床症状评分,病理评分,淋巴细胞所占百 分数用?s表示,两组问比较用独立样本检验,P<0.05 认为有统计学意义. 2结果 2.1动物发病情况及症状评分对照组未出现发病症状,小 鼠质量持续增加,活动度正常.EAE组6只小鼠全部发病, 发病小鼠多数以尾部张力下降,行走尾巴远端拖地为首发症 状,继而出现全尾瘫痪,后肢无力,后肢瘫痪,行走拖地,前 肢无力等症状.另外还表现为活动减少,食欲降低,毛色暗 淡,体质量减轻等(图1A),临床症状最早出现于免疫后第13 天,最迟在免疫后第l7天,EAE组小鼠最大症状评分为8.83 ?3.26.小鼠日均临床评分见图(图1B). 2.2病理学改变(IIE染色)对照组小鼠脊髓病理检查未发 现炎性细胞浸润(图2A).发病的EAE小鼠病理检查腰髓有 大量的炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主,多分布于灰质与白 质交界区,发病较严重的可见脊膜不完整,可见典型的”血管 748 袖套样”(cuffing)改变(图2B). A19 ?l1 7 8 t 犍l5 H :i B1. 8 妻s 丑2 0 3579Il13l51719 免疫后天数(d) 图1免疫后各组小鼠平均体质量的变化及日均症状评分 图2小鼠腰髓的病理学变化(HE染色,×200) A:对照组小鼠;B:EAE组小鼠腰髓灰质明显炎症细胞浸润 2.3EAE小鼠中枢CD4CD25Treg.CD8CD28一Treg 的表达EAE高峰期小鼠外周CD4CD25Treg较对照组变 化不明显,CD8CD28一Treg细胞较对照组明显降低(P<0. 01).EAE组小鼠中枢CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg细 胞检出数量较多,中枢浸润明显.对照组小鼠中枢未检测到 淋巴细胞浸润(表1,图3). 表1EAE组与对照组CIMCD25Treg,CD8CD28一Treg淋 巴细胞亚群变化比较 P<0.05,P<0.0l对照组外周 s .囱S 茎.S~霸B 图3FCM检测EAE组与对照组CD4CD25Treg,CD8 CD28,Treg淋巴细胞 a:CD4CD25Treg对照组脾脏Ib:EAE组脾脏;c:EAE组中枢;d: CD8CD28一Treg对照组脾脏;e:EAE组脾脏;f:EAE组中枢. 3讨论 MS是一种发病机制复杂的主要累及中枢神经系 志(ChinjCellMolhnmuno1)2010,26(8 统白质的慢性炎性脱髓鞘疾病,MOG诱导 C57BL/6小鼠建立的EAE模型很好的模拟了MS的 主要病理特征,因此成为研究MS的经典动物模型. 因为小鼠中枢神经系统的病理改变更能直接反应MS 的病理发生情况,我们首次使用FCM检测到小鼠中 枢及外周淋巴细胞的变化.同时,本实验室使用 MOG免疫C57BL/6小鼠建立的EAE模型行为学 上表现为发病期行动迟缓,步态异常,体重下降,尾 巴及肢体瘫痪;病理见中枢白质为主的炎性细胞浸 润和血管”袖套”样改变等,与文献报道中EAE模型 的临床及病理改变均相符合,提示我们复制诱导 的EAE模型是成功的. Treg是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群, 根据表面标记的不同可分为CD4Treg和CD8Treg 两大类.近年来对Treg研究主要集中在CD4 CD25Treg,且大量的研究证实其对EAE的保护作 用.研究发现一些CD8Treg也表现出明显的免疫 抑制功能.已经证实CD8CD28一Treg为具有免疫抑 制功能的一类特殊的细胞亚群,它们通过作用于抗 原递呈细胞维持免疫耐受...CD8Treg同CD4 Treg一样均参与CIMThl自身反应性T细胞的免疫 抑制效应,用抗体清除CD4CD25Treg,CD8Treg 促进EAE的发生J.Najafian等研究发现清除 CD8T细胞使CD28基因缺陷小鼠易患EAE, CD8一,CD28一双基因敲除小鼠EAE易感,被动 转移CD8CD28一T细胞给CD8一小鼠能明显抑制 疾EAE发生,证实了CD8CD28一T细胞对EAE的 保护作用. Viglietta,Haas等一..对不同亚型MS患者外周 血中CD4CD25Tr的研究发现,这些细胞的表达 水平与健康对照组相比变化不明显,但对CIM和 CD8T细胞的抑制功能明显减弱.在我们的实验结 果中,EAE组小鼠脾脏CD8CD28一Treg明显低于对 照组,CD4CD25Treg淋巴细胞数较对照组变化不 明显与文献报道相符.结果中比较值得关注的是在 EAE模型组小鼠CNS,不管是CD4CD25Treg还 是CD8CD28一Treg的表达水平均明显高于外周,这 与Feger,Venken等对MS患者外周血及脑脊液 (CSF)中淋巴细胞改变的研究结果相似.Feger等 发现MS患者CD4CD25FOXP3Treg在脑脊液中 的分布高于外周血.Venken等?的研究结果表明 CD4CD25highFoxp3细胞数量在RRMS患者CSF中 表达增加但存在着抑制功能障碍.这些结果均提示 着在EAE致病过程中外周Treg细胞通过血脑屏障进 入中枢,被招募到炎症部位参与调控中枢局部炎 }o—一-0一一0Il曼芑一b一色一色一苦一 《【Ju《?U ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2010,26( 症?. 我们的研究表明CD8CD28一Treg同CD4 CD25Treg一样,在EAE中枢高表达并参与调控 EAE的发病,然而Treg细胞在中枢的高表达和EAE 或MS疾病的缓解是否相关仍不清楚.如上所述,不 论是对CD4CD25Treg还是对CD8CD28一Treg的 研究均证实它们对EAE的保护作用,在我们的研究 结果中,虽然有Treg细胞的高表达,但EAE小鼠中 枢仍然有典型的炎症反应,显然Treg细胞数量的增 加并不能拮抗中枢的病理反应.Weaken提出MS患 者Treg细胞存在功能障碍,Treg在MS患者CSF聚 集试图拮抗和下调中枢的慢性炎症反应?.由此我 们推测在EAE中由于Treg细胞存在功能障碍,虽然 在EAE中枢表达的数量增加,但由于免疫无能反而 促进治病T细胞的活化造成疾病的进展.一般认为 Treg细胞通过局部免疫抑制调控疾病的进展,Treg 细胞数量和功能的增加与致病T细胞的数量和功能 的下降是否存在相关性还需更多的研究证实. 综上所述,本研究采用FCM首次检测到EAE小 鼠中枢及外周各淋巴细胞亚群变化及两类重要的调 节性T细胞亚群的改变.结果提示CIMCD25 Treg,CD8CD28一Treg均参与EAE的病理过程, CD4CD25Treg,CD8CD28一Treg在EAE小鼠中枢 及外周分布及变化的不同,提示其进入CNS并参与 调节局部炎症.此外,由于目前有关CD8CD28一T 在MS发生发展中的作用的研究报道甚少,我们分析 EAE小鼠中枢及外周CD8CD28一Tr细胞的变化,希 望能为探讨MS发病的免疫学机制提供新的途径. 参考文献: [1]HailerDA,SlavikJM,AndemonDE,eta1.Multiplesclerosis[J]. 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