毛囊角化病的基因突变研究

毛囊角化病的基因突变研究 安徽医科大学 硕士学位 毛囊角化病的基因突变研究 姓名:孙良丹 申请学位级别:硕士 专业:皮肤病与性病学 指导教师:张学军;杨森 20040501 童盈医叠本堂盈土芏焦诠塞 英文缩略词表 缩写词 中文名称 英文名称 DD 毛囊角化病 keratosisfollieularis NPDD 神经、精神型毛囊角化病 DD neuropysehiatfic CDD 粉刺型毛囊角化病 cornedoilalDD LDD 线型毛囊角化病 linear DD LDD 肢体末端型毛囊角化病 acralDD VBDD 水疱一大疱型毛囊角化病 vesieo-bullous DD AD 常染色体显性遗传 autosomal dominant AR 常染色体隐性遗传 autosomal recessive CAP 钙离子泵 calcium ATPase pumps HH 家族性慢性良性天疱疮 disease Hailey-Hailey PBS 磷酸盐缓冲液 saline phosphate??buffered HD 半桥粒 hemidesmosome PCR 聚合酶链反应 chain reaction polymerase 塞徼医叠左堂亟士堂焦诠塞 中文摘要 毛囊角化病的基因突变研究 一 毛囊角化病是一种罕见的常染色体显性遗传性皮肤病。临床上以皮脂分 泌旺盛的部位如前胸、腹部、腋窝、头面部等处角化性、脂溢性丘疹及过度 增生性损害为特征，有时可伴有掌跖及指甲的损害。人群中的患病率约为5 万一10万分之一。尽管毛囊角化病在成年人的外显率很高，但是它的临床表现 可以是多种多样的。毛囊角化病多于20岁前发病。有时毛囊角化病的病情可 能是非常严重的，皮损的范围也很广泛如疣状增生性丘疹、疼痛性溃疡、水 疱、大疱及粘膜的损害，也可以表现为大面积的瘙痒，并且在皮损处可以散 发出令人不悦的气味。通常可以伴发继发性的感染。在一般情况下，毛囊角 化病都是在夏季皮损加重，病情恶化。因为阳光、高温、出汗等因素都可以 加重毛囊角化病的发生与发展。一般情况下，毛囊角化病很少可以自愈，但 是目前已经知道口服维A酸类药物可以有效的降低毛囊角化病的角化过度。 在最近的一些报道中有人发现，一些患有毛囊角化病的家系中可以同时患有 其他的一些神经、精神性疾患如癫痫、智力发育迟缓、慢性进行性脑萎缩等。 毛囊角化病的组织学特征为棘层和角质层中的角化不良细胞形成圆体 和 谷粒。棘层松解形成裂隙、角化过度、毛囊角栓。近些年来的研究表明本病 存在ATP2A2基因的突变，并将该致病基因定位于染色体上12q23―24区域。 ATP2A2基因编码肌浆网,内质网钙离子ATP酶2，是一种钙泵，负责调节细胞 内外的钙离子浓度，是人体内的一类广泛存在，且具有重要作用的基因。自 从该致病基因被发现以来，现在全世界范围内的所有已经报道的不同人群、 不同类型的毛囊角化病的基因突变已经达到了140多种。这些突变几乎包括 4 一 塞煎医叠去生亟?芏焦论塞 了目前已经知道的所有的突变类型。但是到目前为止，对于毛囊角化病的基 因型与表型之间是否有一定的相关性还不被人所知。其中大多数的突变都是 特异性的，且以错义突变为主。本研就旨在对我们所收集的国内的,个毛囊 角化病家系，进行基因突变检测。 通过对所采集的1个2代的毛囊角化病家系的资料进行系统的收集，临 床和遗传特点，同时采用普通病理对该家系的先证者进行研究。该家系 诊断毛囊角化病明确。 用PCR扩增ATP2A2基因，产物直接测序的在该家系患者中发现存有 导致了该致病基因的第12外显子上的514位赖氨酸被精氨酸所替代。该突变 同时也存在于先证者的儿子，而在该家系内的正常成员及100位正常对照者 中均未发现该突变。 本研究证实K514R是引起该家系临床病变的特异突变，不是多态性变化。 这是一个新的ATP2A2突变，在以前的文献中未见报道。该研究对进一步探讨 ATP2A2突变和DD之间的关系以指导基因治疗及遗传咨询和产前诊断具有一 定的意义。 关键词:毛囊角化病突变分析ATP2A2基因 Abstract 安徽医叠太堂亟?堂焦论塞―一 disease:mutation Darier’s analysis disorder inheritedskin arare Darier’S dominantly disease DD is in seborrheic and characterized areas central bywartypapulesplaques anddistinctivenail and pits trunk，flexures，scalpforehead palmo-plantar estimatedas tO of diseasehasbeen the abnormalities(The 1,55， 000 prevalence of is thedisease is in highadults，the 1,100，000(Althoughpenetrance expression be malodorous variable(Involvement severe，with itchy may widespread extremely andmucosal erosions，blistering crustedplaques，painful is and exacerbatethedisease(DDnever infection common(Sun，heat sweating hasbeen tobe oralretinoidsreduce remits，but may hyperkeratosis(DDreported with mildmental associated abnormalities retardation including neuropsyehiatric and inafew families epilepsy The focal of featuresincludeareas between typicalhistological separation cellsandabnormal epidermal suprabasal of andelectron reveallossdesmosomalattachmentsand microscopy perinuclear that ofkeratinfilaments(Theseobservations defectsina aggregations suggested moleculeinvolvedin be desmosomeformationand,or could in stability implicated the ofthe has been that demonstrated pathophysiologydisease(Now,it ATP2A2， 6 (―――― 主盘医叠盍堂亟?芏鱼诠塞 Ca2+ATPase reticulum encodesthe which sarco,endoplasmic that ATP to of cation the familyP-type pumpscouplehydrolysis large belonging membranesisthedefectivein SO across withcation DD(AlthouIgh gene transport far 140differentATP2A2 approximately mutations，including been and mutationshave in frameshiR，deletion,insertion splice-site reported formsof relationbetween has different DD，no genotype, phenotype apparent emerged( In this a with examined reported DD，and study,we family three―generation ATP2A2mutationsinthis direct novel missense gene familyby sequencing(A WaS mutation A―G identifiedinexofl to lead 12，nucleotide1704，which predicts tothe substitutionof atcodon will arginine lysineby 514 K514R (This study contributeto in databaseonATP2A2 DD，andfurther illustratethe expand extensive ofmutationalthatledto events thedifferent ofDD( diversity phenotypes disease,mutation Keywords:Darier’S analysis,ATP2A2 7 安徽医整太堂亟士堂焦逾塞 毛囊角化病的基因突变研究 孙庭丹 硕士研究生 一 导师张学军杨森教授 1(前言 毛囊角化病又称Dafter’S(White病，是一种罕见的常染色体显性遗 传性皮 肤病，特征性的临床表现是以皮脂分泌较多的地方如躯干、腋窝、前额等处 角化性、油脂性丘疹及掌趾部、指甲等部位的损害为特征川。流行病学的调查 研究表明毛囊角化病的发病率大约为5万一10万分之一，尽管毛囊角化病在 成人中具有较高的外显率，但是该病的临床表现是多种多样的m“。有时毛囊 角化病的病情可能是非常严重的，皮损的范围也很广泛如疣状增生性丘疹， 疼痛性溃疡，水疱、大癌及粘膜的损害，也可以表现为大面积的瘙痒，并且 在皮损处可以散发出令人不悦的气味。通常可以伴发继发性的感染。在一般 情况下，毛囊角化病都是在夏季皮损加重，病情恶化，因为阳光、高温、出 汗等因素都可以加重毛囊角化病的发生与发展。一般情况下，毛囊角化病很 少可以自愈，但是目前已经知道口服维A酸类药物可以有效的降低毛囊角化 病的角化过度。最近的一些报道中有人发现，在一些患有毛囊角化病的家系 中可以同时患有其他的一些神经、精神性疾患，如癫痫、智力发育迟缓、慢 性进行性脑萎缩等叹 毛囊角化病的典型组织病理学上特征是局部区域的表皮细胞分离及细胞 囊盘医登太生亟士堂焦诠塞 一―― 一 的角化异常。免疫组织病理及电子显微镜研究发现，毛囊角化病的皮损中可 见桥粒间连接的破坏及角蛋白丝核周围的分离f3】。这些研究结果可能提示 ATP2A2致病基因分子的突变缺陷可能参与了桥粒的形成与稳定，进而可能 参 与了毛囊角化病的发生机制。现在已经研究发现，ATP2A2被证明是毛囊角化 病的致病基因，该基因编码肌浆网,内质网钙离子(ATA酶2，而后者是钙离子 泵家族中的一员，负责调节细胞内外钙离子的浓度，以此来维持细胞内外钙 离子的平衡，进而参与机体内钙离子信号的传导n 尽管到目前为止，所有已经报道的毛囊角化病的ATP2A2基因的突变位 点已经达到140多个，这些突变包括错义突变、无义突变、剪切位点突变、 单个碱基的缺失、插入及移码突变等，[51。但是到目前为止，至于毛囊角化病 的基因型与表型问是否具有一直性，还有待于进一步探讨16]。 本研究对我 国 一个毛囊角化家系成员进行详细调查、体格检查及采用普通病理等方法研究 先证者皮肤组织病理，同时应用提取基因组DNA，PCR特异扩增ATP2A2产物 直接测序等分子生物学方法对此家系进行了基因突变的检测，以探讨该家系 发病的分子遗传学机制，进而有助于今后对于开展毛囊角化病的遗传咨询和 产前诊断，并为进一步探讨ATP2A2突变和叻之间的关系。 2(材料与方法 2(1实验试剂 2(1(2 DNA提取试剂 DNA 1 基因组DNA提取试剂盒 GenomicPurification Kit ，包括细胞裂 解液 Cell Lysis Solution ，核裂解液 Nuclei Lysis Solution ，蛋 白沉淀液 Protein Precipitation 9 蛊盈医拄太鲎亟士芏焦盗塞 一 Solution 和RNA酶 RNase Rehydration 公司 。 2 异丙醇 isopropan01 ， 蚌埠化学试剂厂 。 一 3 75,7,醇 ethan01 ， 蚌埠新科电化试剂厂 。 2，1(3 PCR反应、电泳用试剂 司 。 2 一套特异扩增COL7A1基因外显子的引物， 上海生工生物工程公司合成 。 l， 上海生工生物工程公司 。 3 Taq酶5U,u 4 25mmol,L MgClz( 同Taq酶配套 。 Reaction 5 10×PCR Buffer:500mmol,LKCl，lOOmmol,L Gelatin。 同Taq酶配套 。 25? ，img,ml 6 超纯水。 7 Tris碱， 上海生工生物工程公司 。 8 硼酸， 上海生工生物工程公司 。 9 EDTA， 上海生工生物工程公司 。 10 溴酚蓝， 上海生工生物工程公司 。 11 蔗糖， 上海生工生物工程公司 。 12 Tris-硼酸电泳缓冲液 TBE : 0(5mol,L Tris碱，27(59硼酸，20ml 浓贮存液 每升 ，5×:549 EDTA pH8(O EDTA 使用液，0(5x:0，045mol,LTris硼酸，0(001mol,L 13 6×加样缓冲液:0(25,溴酚蓝，40, w,v 蔗糖水溶液 14 琼脂糖 Agarose ， 美国Promega公司 。 15 溴化乙锭，lOmg,ml贮存液， 上海生工生物工程公司 。 16 pUCl9 DNA,Mspl 安越医拄盘堂煎士鲎焦途盆 MBI公司 2(1(4PCR产物纯化和测序试剂 1 外切酶I ExoI ， BIOLAB公司 。 一 acid 2 shrimpphosphatase， USB公司 。 determinator， PerkinElmer公司 。 3 Bigdye 4 醋酸钠 NaAE 3M，P l 4(6 。 2(2实验仪器 2(2(1DNA提取器材 in 1 蚂IMinishaker振荡器， MadeMalaysia 。 in 2 Microtec1542R低温高速离心机， MadeJapan 。 3 BS60型电热恒温水浴箱， 北京市医疗设备厂 。 4 100,1000?l Pipet―mate， HTL公司产品 l 5 20,100uPipet-mate， HTL公司产品 6 2,20ul Pipet-mate， HTL公司产品 7 EDTAk3 或EDTAN“ 抗凝真空管 8 50ml试管架。 9 1(5ml离心管， QSP产品 。 10 752紫外光栅分光光度计， 上海光学仪器厂 。 11 192型超低温冰箱 -850c ， 日本三洋公司 12 Haier一20?冰柜， 中国海尔集团公司产品 。 13 美菱BCD一238型冰箱， 中国美菱集团公司产品 。 2(2(2 PCR反应、电泳仪器 ulPr01ine in 1 0(5,lO Finland 。 Pipettor， BIOHIT，Made lProliae in 2 5,50u Finland 。 Pipettor， BIOHIT，Made u1Proline 3 50,200 inFinland 。 Pipettor， BIOHIT，Made 童盘医叠盘生亟?生j垂诠塞 in 200,1000lProline Finland 。 4 u Pipettor， BIOHIT，Made 5 inFinland 。 连续加样器， BIOHIT，Made 6 MSIMinishaker振荡器， MadeinMalaysia 。 7 BiometraMadein Tgradientthermocycler， Germany 。 8 DYY一?I型电泳槽， 北京市六一仪器厂 。 9 FD201稳压稳流电泳仪， 北京通用分析仪器厂 。 0 TN―IOOB型托盘式扭力天平， 上海第二天平仪器厂 。 1 ElectronicU(V(Transilluminator， AAB，MadeinUSA 2 Halor一20?冰柜， 中国海尔集团公司产品 。 3 200ulPCR薄壁管， QSP产品 4 0(5ml离心管， OsP产品 15 1(5ml离心管， QSP产品 。 2(2(3 PCR产物测序仪器 ABl377钡U序仪 PerkinElmer公司 。 2(3临床资料 图1(先证者照片 先证者117，女，34岁，因“全身皮肤反复出现角化性丘疹，瘙痒30余 年”于2003年7月来我科就诊。一岁左右面部、前胸、背部出现角化性丘疹， 每逢夏季加重。难以自愈。2―3岁时起，皮损开始加重，逐渐累及小腿、 躯 干等部位出，并在腋窝、头面部出现密集成簇的角化性、油脂性丘疹伴瘙瘁， 搔抓或磨擦后皮损可出现过多的增生，甚或疣状增生。皮损持续存在数年难 以愈合。严重时口腔粘膜可因饮用热水或咀嚼粗糙食物而引起水疱、糜烂。 患者指趾甲自10岁起逐渐变形脱落，新长出的指甲也变形、萎缩。皮肤科检 查:一般情况较差，伴发轻度智力障碍。头面部及躯干部可见散在的或密集 成片的角化过度性丘疹，皮损表面稍微隆起、被覆油腻性、灰黑色鳞屑，融 合呈疣状 见图la b 。上胸部、上背部也可见许多散在或密集的油腻性丘疹， 稍隆起。全部指趾甲变形、萎缩或增厚，甲板面粗糙、甲缘不规则、失去正 常的甲光泽。 家系调查:家系系谱图如下，家系中无近亲结婚。调查三代共11人， 患 病2例，其中，在世9人，男4例，女5例，家系系谱图见图2。 I II Ill 图2毛囊角化病患者家系图 安盔 医整太堂塑?堂焦诠塞 Darier’sdisease of 1 The pedigree Figure 一―― 2(4实验方法 2(4(1皮肤标本采集 在局麻下用角膜环钻器切取先证者皮损部位皮肤。正常对照皮肤取自本 院整形外科及普外科手术切除的健康人或外伤患者新鲜正常皮肤。所取的皮 肤标本立即用OCT包埋、液氮速冻后置一80?冰箱中保存备用。另取一块 先证 者皮损部位标本立即放入10,的甲醛溶液中4小时以上。 2。4。2组织病理检查 2(4(2(1脱水 75,、85,、95,、100,的乙醇中梯度脱水各I小时。 二甲苯中脱水2小时。 2(4(2(2石蜡包埋 把脱水后的组织块浸入70?的液体石蜡中，2^4小时以上; 2。4。2。3皮肤组织切片 包埋后的组织块在冰冻2-3分钟后，作6um厚的切片，放入50。C的水中 展开以便捞至玻片上，然后烤片 20-30分钟 。 2。4。2(4脱蜡 从烤箱中取出放入二甲苯中10分钟，无水乙醇2分钟，95,的乙醇5秒， 然后用清水冲洗一下。 2(4。2(5 HE染色 苏木素染色5分钟，然后用水清洗。 50?温水蓝化3分钟。 伊红染色30秒，然后用水清洗。 中性树胶封片。 14 塞擞医叠左堂盈?堂焦论奎 最后，在显微镜下观察结果。 2(4(5基因组DNA的提取 2(4(5(1标本采集 一 抽取DD家系2位患病成员及先证者的母亲和i00位正常人静脉血lOml 置EDTAk3 或EDTANa4 抗凝管中。 2(4(5(2基因组DNA提取 DNA Purification 采用Genomic Kit提取外周静脉血中的基因组 DNA 参 照本Kit说明书并略作改动 1 细胞解冻: 将血标本从一85?超低温冰箱取出，放置在--20?低温冰箱24小时， 再从一20?低温冰箱取出放置4?冰箱解冻24小时。 2 红细胞裂解: 转混合5,6次 不需要震荡 。 2(混合液室温下孵育10分钟使红细胞裂解 其间颠倒混匀3次 。 3(室温以15，000Xg转速离心20秒，尽可能去除上清液 为破坏的红 细胞 ，保留下面的沉淀 沉淀主要为白细胞 。 4(剧烈振荡离心管15秒至白细胞重悬。 3 核裂解和蛋白质沉淀: 1(向重悬的白细胞中加入300ul核裂解液。吹打液体5次以使白细胞裂 解。此时液体变得粘稠。 2(将离心管置于37?水浴箱中30分钟。 4(加入i00Hl蛋白沉淀液，剧烈振荡20秒。 5(室温以15，000Xg转速离心3分钟。离心管底部可见一棕色蛋白团块。 1S 安徽医整盍堂塑士生鱼论塞 6(将上清液转移至一洁净的离心管。 4 DNA沉淀和溶解; lt室温下向上清液中加入300“1异丙醇，轻柔翻转混合液体a可见白色 线状DNA形成团块。 一 2(室温以15，000×g转速离心3分钾。 1 u 70,乙醇至离心管。轻柔颠倒离心管清洗 3(弃去上清液，加入300 DNA团块和离心管壁。按步骤2离心。 4(小心吸出乙醇，将离心管倒置于洁净吸水纸上15分钟晾干团块。 l 5(加入100uDNA溶解液，65"C水浴1小时使DNA充分溶解。 6(将DNA溶液置于4?保存备用。 5 DNA原液纯度，浓度的测定及模板DNA的配制: 1 算出DNA原液的纯度和浓度。根据DNA原液浓度配成浓度为long,u 的模板洲A。 2(4(6 ATP2A2基因引物 根据文献‘51扩增ATP2A2基因引物，从上海生工生物工程公司合成的 引物如下: IExon‘ oflP耐uct Annealing 【Primer s[primel- 3[prirae| 2IPoatio( ，Iprimer lsize in the intron| “p temperature co I ‘-60’ 155 11 1271 ICGAGGCGGAGG-CGAGGAG GGAGCCGAAGCCCACGCG l |l+93 12+3[ACCTCCCTCTTGACACATrG l-45 i1464 随 j[OAC舭CTCCTAACCACACTOI+227 -20 55 ]222 14 ICGT唧CATTrCTCTl?TAG- ] CTCAACACATCAGGAAAAACAG +98 l l 55 15 IAGTGTCAGGCAGGTCTITAC; _45 1368 16 +184 I [AGGAAGGGAGGTGCTAAAAC 455 i155 6 1-224 [AGCCTCATrCTCTTCCTTCC 蛊擞医叠盘堂亟士堂焦讼客―一 ATG-GAGCGAGACTAAAGCAC2I 1+150 (50 ]238 150 7 ;[CTTGGTGTGGGTCGCAGAG +】02 ICCTTrAGAATGATAGCCAGTG 657 55 -147 8 GTTGTATGGCTGGTTGCTTG ,45 GAACAAAGAACCACGACACG 426 50 f(98 9 [GGTTGT'ITGCCTITGTCCTAA 、 1+239 IATAACAAACACAAATCCCTCTT c 1202 (42 55 10 GoCGACC―?ACCCTGCTC CCCACCCCACCCTTGAAC +1+57 389 50 11 TCAGAGGAGGATAAAAATGCJC 一136 1+121 I ICTGTAAGTTTGAGGAGATAAGG + 568 -39 55 2 ArrGCCACCCAGTAGTATCC 3 i+88 [GAACTGTI'TGACCTTTTGCTTG 14 lCTAGAACTrGCCACTr】兀ArrTA 1436 150 ? +57 GAGGCTACTATGTGCTTGTG 400 155 15 ?1。-91 11TrCCTCCTGCTI'CCCATrC GCAATCTGGAGAGCAAACTG+88 f 55 J16 忑cKr,tKfffCIcTGGAGGAGG |-100 f430 +127 CATCTCTGTCTYITCrCTACCC 一94 26l 55 TGATCTTCGTCCTTGTGGGG 117 心拱6埘JZDCGAAACCAC4G‘+81 312 18 卜65 55 lGGGTI'GGAGCCTGGAC'YI'G +114 盯TTTGGGAAGG-GAAGAACTGT + 19 609 55 TCCCCACCTCTCCTrGCTC一24 20 ICCTCCATCACCAGCCAGTAT +1156 21。 50 GTTCCTnvrCATCTGTCGCTG |-105 1228 ’TCTrr(ITCCCCAACATCAGTC|+1090 引物稀释: 新到的合成引物先离心使粉末聚集在Eppendorf管底部，加入适量纯水 按引物合成公司提供的公式计算方法 稀释成40洲的贮存溶液，置于一20 ?保存。同时取部分贮存液稀释成20州的引物使用液置于一4"C备用。 17 圭擞医叠太堂塑?堂焦诠塞 2(4(7PCR反应 1 原理 一一 Chain 聚合酶链式反应 Polymerase 已知序列之间的DNA区域。每一个PCR循环，反应混合体系都在模板变性、 引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序 的温度热循环仪而达到自动化。 变性阶段:在94‘C热变性，两条模板链发生分离。 退火阶段:两条引物在大约50"C时分别与模板链杂交。 延伸阶段:在最适温度72。C时，聚合酶能合成与模板分子相互补的新的 DNA链，使引物序列延伸、靶片段的拷贝数加倍。重复该PCR循环过程25-38 次，使PCR产物呈指数累积增加。 在PCR扩增反应中，产物的大小是由两条引物退火位点5’端间的长度决 定的。特定PCR产物一般可通过琼脂糖凝胶电泳进行检验 可借分子量标记 Markers 。 2 PCR反应体系 以25ng基因组DNA为模板，PCR反应用200HiPCR薄壁管进行，在20? of each U 反应体系里扩增，其中包括4 pmol primer，1 Taq M mM u dNTPs，l_5 MgCl2(PCR反应在Tgradient 行。 3 PCR反应程序 退火温度 annealing 试验中采用温度梯度法探索每一对引物的最佳退火温度。 具体扩增循环数可根据不同引物的扩增效率来调节。 PCR反应程序如下: 塞微医疆太堂亟?堂焦诠塞 I预变性:94。C5分钟 6C 45秒; ?变性94 根据温度梯度实验所得退火温度45秒 一 延伸72?50秒; ?终末延伸:72"C延伸8分钟。 4 PCR反应: 由于PCR反应能够使形单影只的一个DNA分子得以扩增，所以应当注意防 止反应体系被痕量DNA模板污染。 1(凡不用工作台时应打开紫外灯，工作台内应置有PCR专用的微量离心 机，一次性手套、整套移液器和其他必需品。所有缓冲液、吸头和离 心管使用前必须经过高压处理。 2(一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套， 并勤于更换。 3(准备专供PCR使用的成套试剂，分装成小份。配制这些试剂时，要用 从未接触过实验室内任何DNA的新用具。 4(必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反 应。 2(4(8 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 1 用高压灭菌指示纸带将洗净、干燥的电泳装置配备的塑料盘的开口封 住，形成一个胶模。将胶模放在一个水平工作台上。 2 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液。在已加入有 一定量的电泳缓冲液的瓶盖未拧紧的玻璃瓶中加入准确称量的琼脂 糖粉。本试验采用2,琼脂糖凝胶。缓冲液不宜超过玻璃瓶的50,容 量。 在电泳槽和凝胶中必须使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度 或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，影响DNA片段的迁移率 19 塞徽医叠太堂煎?堂位论塞―― 3 在微波炉中加热悬浮液至琼脂糖溶解。 4 使溶液冷却至60。C。加入溴化乙锭至终浓度为0(5pg,ml，充分混匀。 5 用吸管取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，任其凝固。在距离底板 0(5-1(Omm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加 样孔。 6 将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-Smm之间。检 查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。 7 在室温放置30分钟凝胶完全凝固后，小心移去梳子和高压灭菌纸带， 将凝胶放入电泳槽中。 8 加入恰好没过胶面约1哪深的足量电泳缓冲液。 9 DNA样品与加样缓冲液混合后，用微量移液器慢慢将2u1混合物加 入样品槽中，此时凝胶已浸没在缓冲液中。在其中一孔中加入DNA marker。 10 盖上电泳槽并通电。采用卜5V,cm的电压降 按两极间距离计算 。 电泳至溴酚兰在凝胶中迁移出适当的距离。 11 切断电流，从电泳槽上拔下电线，打开槽盖。在紫外灯下检查凝胶 并扫描图像。 2(4(9 POR产物纯化和DM测序 根据末端终止法原理进行序列测定，主要步骤为: 1 PCR产物的纯化:在8“1 PCR产物中加入IOU外切酶I及2u acid 的shrimp ?下孵育15分钟以去除多余的酶。 2 l 单序列扩增反应:在3u PCR产物中加入0(2“M正向引物 或 反向引物 ，及2岱1的Bigdye 列反应条件为:96。C 12秒，50?5秒，及60?4分钟，扩 塞鲎医整盘堂煎?生焦诠玄 增33个循环。 3 产物的纯化:离心的方法去除未反应完的试剂及杂质:即在反 应产物中加入4pl双脱氧水及1?l 放置10分钟;加入25 u195,的乙醇后封膜，在一20?下放置 1 再加入15011 l 离心1分钟，再加50u 70,的乙醇重复上述操作一次后，在空气 中 软件上进行分析。 3(结果 3(1系谱分析 51 ，隔代遗传，男女均患病， 3代共11人中患病2例 男4例，女5 表现为常染色体显性遗传的不规则显性的特点 见图1 u 3(2普通病理 表现为局部的角化过度、角化不良的细胞形成的毛囊角栓、圆体及谷粒 r 棘层松解形成细胞裂隙，，真皮血管扩张、增多，少量炎症细胞浸润 见图2 。 3(5 DNA测序 12外显子中1704位碱基 以起始密码子ATG为第一位 呈腺嘌呤与鸟嘌呤 双峰杂合。表明等位基因之一有异常，第514位密码子AAG为AGG代替 也证实此突变 图3 。其儿子也存在同一突变。家系中其他成员及lOO个常 对照者中测序束发现有此突变。该突变以前未见有报道，是一个新的错义 突 变。 2I 耋微医登左堂亟?堂焦论塞 囤2毛囊角化痛患者的组织病理学表现HE*100 2 featuresofDarier’SdiseaseHE*100 Histopathology Figure offocal onthe leftabdomenrevealedthefeatures proband’S Fig(2(Skinbiopsy cleftsand with hyperkeratosis cells( acanthosytic dysteratotic G ^ ^ ^ ^ G C- ^ C- T B T A B B C 磊 G 鱼 鱼 T G T G A W C- 6 C AA b K514R Wild Type 图3第12外显子PCR产物台勺铡序结果 3DNA ofthe12thexon sequencing Figure of PCR from Direct the DNAofthe Fig(3 sequencing productsgenomic proband anormal showeda mutation A―G a and control b (Theproband heterozygous transition 1704inexon12ofATP2A2(Asa result，the atposition codonforlysine toacodonfor mutation K5 AAG is 14R( changed arginine AGG ，adesignated 量堂压型蔓坳士堂焦诠塞 4(讨论 3(1毛囊角化病的研究概况 毛囊角化病是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病，目前国内对此研 究较少。典型的组织病理学上特征性的表现为棘层松解及角化不良、角化过 度及由角化不良的角质形成细胞形成的圆体与谷粒。临床上可以在油脂分泌 较多的地方出现角化性、脂溢性丘疹及痂屑等皮损。目前国外对于毛囊角 化 病的基因突变研究已经取得了突破性的进展。90年代以来人们通过了连锁分 囊角化病外，临床上还可以见到其他一些少见类型的毛囊角化病包括过度增 生型、水疱一大疱型、粉刺型、肢体末端型、直线型、出血型等。最近的一些 临床研究证实存在有毛囊角化病同时合并有神经、精神疾患包括情绪障碍、 癫痫、智力发育迟缓、慢性进行性脑萎缩等“1。目前所报道的ATP2A2基因突 变大约共有140多种包括错义突变、无义突变、同义突变、剪切位点突变、 移码突变、单个碱基缺失或插入及动态突变等，但是对于ATP2A2基因而言没 有所谓的突变热点，这些突变位点分散在整个ATP2A2基因中，且到目前为 止 的研究表明毛囊角化病的基因型与表型之间缺乏相关性”,，因而对于不同的 基因突变与不同的表型之间是否具有一直性，还是一个很值得研究的问题。 对于毛囊角化病的治疗，口服类故醇激素是非常有效的，但通常治疗后的副 作用也是不容忽视的。局部的应用维A酸、类固醇激素、手术、激光等各种 治疗手段治疗毛囊角化病也各有其利弊，但通常都很少有明显的疗效。 本研究报道了国内首例典型的脂溢性毛囊角化病同时合并有神经、精神 疾患即智力发育迟缓。同时发现并证实了一个新的错义突变即ATP2A2基因 该位置的赖氨酸被精氨酸所替代。 主盔ll医登盍生亟?堂焦论袁 4(2钙离子泵及其与角化性疾病的相关性 ATP2A2编码SERCA2蛋白，此蛋白为一种钙泵，在调节胞浆内外钙离 子浓度及维持细胞间的钙离子信号的传导上具有重要的作用m”’12】。 中的一员，同为ATP2A2编码，只因剪切位点的不同而在羧基端稍有不同。 其广泛存在且功能十分重要，因而是一种非常重要的基因。SERCA2的结构 包括:颈亚区、B链亚区、磷酸化亚区、ATP结合亚区和10个跨膜螺旋亚区 等14]。在不同的物种中，SERCA2具有高度的同源性，在氨基酸水平上人与其 他生物如兔、猪、大鼠和猫存在99,以上的一致性。它们通过偶合ATP的水 解作用释放的能量而维持细胞内外的钙离子的浓度，进而维持细胞间钙离子 信号的传导。目前已经发现钙离子在维持、调节表皮角质细胞的分化、桥粒 组装以及细胞间的相互连接等方面具有重要的作用。因此毛囊角化病患者中 的棘层松解很可能是由于桥粒的损害而导致了细胞间的连接功能丧失。而且 在几乎所有的毛囊角化病家系中ATP2A2基因的突变都是发生在高度保守的 B链上，这说明钙泵对于细胞功能的完整性维持极为必要。SERCAB2主要表 达于表皮。但是目前已经有人发现典型的毛囊角化病的变异类型即肢体末端 型的毛囊角化病的临床表现与错义突变具有相关性。因为对每一个独立发病 的家系或散发病例而言，这些突变大多数都是特异性的即每一个患病家系或 个体都有其各自特异的突变，从而使得对每一个患病个体的ATP2A2基因进 行基囡组全扫是非常困难的。另外有入发现毛囊角化病同时患有神经、精神 性的疾患与错义突变之间没有明确的相关性【13】。这与以前的报道似乎有 所抵 触。 最初所被报道的两种由于编码钙离子泵的基因突变而引发的疾病是 圭篮医叠太生耍?堂焦论塞 一 相反，都是常染色体隐性遗传。因而就有人置疑为什么同样都是由于同,种 基因的缺陷而导致的疾病，会出现两种明显不同的遗传模式呢?很快就有人 一 推测，毛囊角化病是一种由于单不饱和性而引发的一种疾病。在此种情况下， 一种基因的突变将不足以破坏正常细胞功能的维持【1”。因此很有可能还存 在 有其他的一些相关的因素如感染、日晒、潮湿等，这些因素的共同作用下， 导致了毛囊角化病的发生即出现了临床上常见到的角化性、脂溢性丘疹。到 目前为止，对于毛囊角化病患病个体的其他部位皮损的出现还无法解释。 在 节段型毛囊角化病中，局限性的皮损起因于杂合子的嵌和性基因突变，该病 的致病基因为一种编码SERCA2钙泵的一种蛋白。但是在患者正常的力皮肤 中此基因的表达却是正常的四。 虽然理论上是可以的，但到目前为止，在泛发性的毛囊角化病中还没发 现致病基因的突变可以从上一代传给下一代。而在其他的类似的疾病中如节 段性神经纤维瘤l型、表皮松解性表皮痣中已经发现了这些疾病的泛发性同 样也可以在后代中看到类似的疾病，也就是说这些疾病的致病基因的突变可 以从上一代传给下一代，尽管临床上是很少见的。 4(3临床表现特点分析 典型的毛囊角化病的特征性皮损是位于皮脂分泌旺盛的部位如前胸， 背 部、发际边缘及皱褶等部位的油脂性、角化过度性、坚实性丘疹‘1们。丘疹可 以具有不同的颜色从肉色到棕黄色不等。在一些部位，尤其是在皱褶部位独 立分布的丘疹可以融合成大片丘疹并呈疣状增生。通常情况下，毛囊角化病 患者都在20岁或30岁以后才表现明显的皮损，但有时也可能在4岁就发病， 并表现出典型的皮损。一般情况下，毛囊角化病不发生于老年人。毛囊角化 病的患者中，瘙痒是最常见的一个症状，大约88,的患者都会出现这种现象。 通常情况下一部分患者中可能也存在疼痛现象，而且有时丘疹的分布也可以 不对称。一部分患者中，经常抱怨在皱褶的部位散发出令人难以忍受的气味， 特别是在继发性感染时。通常情况下，日晒、汗液、热及精神方面的压力可 以加重毛囊角化病的皮损[1“。 然而也有的在一小部分女性患者中，大约10,，可在绝经前期出现病情 加重，皮损增多的情况。其中大部分的患者分别有96,、98,在手背和手掌 患有点状角化过度性丘疹同时伴有指甲的损害。有时候，这些患者的皮损可 能与婴儿期出现的扁平疣难以区分。通常情况下毛囊角化病的家系中，很少 可以出现出血性斑疹，但往往都可以有一个典型的皮损轮廓【17]。而且指甲的 损害是非棠典型的?18】。一般情况下，患有毛囊角化病的患者中指甲可有从 半月板到指甲的边缘出现红色或白色的纵向条纹状改变、V型槽以及纵向的 背脊、甲下角化过度性增生等改变。在口腔的损害中，通常在上额可以见到 细小的颗粒至比较粗糙性鹅卵石样损害。也可以较少见有语言障碍及两颊部 的损害。在不同的人群中，毛囊角化病同时合并口腔部的损害是不同的，有 人调查研究发现，在163个大家系中，大约有15,的同时合并有口腔部损害 116]。口腔手术的研究中发现，24例病人中有12人患有口腔部的损害[19】。通 常情况下毛囊角化病患者的口腔损害是没有症状的，因而往往是不需要治疗。 然而在一些患病家系中，由于唾液分泌腺的阻塞及腮腺组织的化生而导致了 腮腺的间断性的肿胀，在这种情况下就要进行对症的处理。通常情况下，毛 囊角化病是不合并有其他疾病的，但是在一些患者中，确实也可以合并有其 他的一些精神、神经性症状包括双极症状、智力发育迟缓、早发性痴呆、癫 痫等，在一些家庭还可能同时患有慢性进行性脑萎缩‘16-201。令人感到惊 奇的 是，在一个有关询问生活质量的调查表中，发现毛囊角化病对于患者心理压 力上的影响远不如异位性湿疹对患者的生活质量影响大‘2“。毛囊角化病的患 者在经历了疾病的症状后，大部分仍然可以保持良好的社会人际交往关系。 壹徵医整盘堂塑?堂焦诠盍 尽管，这些结果可能由于这个调查表本身的设计缺陷而导致，但它确实反映 了毛囊角化病的患者依然具有良好的心理调接状态。 4(4组织病理特点分析 毛囊角化病是一种以局部皮损棘层松解性角化不良为特征的一种遗传性 皮肤病。局部的细胞分离伴有基底层细胞裂隙的形成同时伴有角化过度及一 定程度的角化不良是毛囊角化病的特征性组织病理学特征。 这些组织病理的特征性表现是异常角质形成细胞的角化不良即在患有该 病的患者表皮的颗粒层中可以见到较大的角质形成细胞，该细胞具有较大的 细胞核，同时核周围绕有晕环。在诊断毛囊角化病时(该病必需在组织病理 学上与其他的一些棘层松解性角化不良性疾病相鉴别。实际上，家族性慢性 良性天疱疮、 ;rover’s病是毛囊角化病的重要的变异形式。 4(5错义突变与神经、精神型毛囊角化病的相关性 本试验根据家系患者的临床表现、组织病理以及系谱分析诊断为毛囊角 化病明确。扩增ATP2A2第12、13外显子的PER产物测序结果表明，家系中 结合亚区。这一ATP2A2点突变迄今国内外还未有报道。此突变不存在于该家 系内的正常人群及100位健康志愿者中，表明此突变不是多态性变化。 同时有研究表明，ATP2A23’端特别是位于ATP结合区的错义突变与神 经、精神型毛囊角化病具有一定的相关性，这很可能是由于特异性错义突变 在第二易感因子的共同作用下导致了此种类型毛囊角化病的发生[6】。尽管目前 还不确切知道sERcA2的功能丧失是如何导致了毛囊角化病的发生，但选择性 抑制及钙泵的单不饱和性可能参加并干预了细胞间的连接及粘附，进而导致 圭微医整盘堂亟?堂焦诠塞―― 了显性遗传性毛囊角化病的发生H，2”。总之，ATP2A2的错义突变可能导致 SERCA2的功能丧失即导致了ATP、钙离子的亲和力降低以及对ATP的磷酸化、 去磷酸化等一些过程的影响。最终这些改变将影响表皮角质形成细胞润的粘 附及分化【23】，同时合并有第二易感因子如神经特异性蛋白A986S多态 CASR 基因的受体 可能决定了毛囊角化病的一些亚型的发生，如神经、精神型毛 囊角化病【6041。 总之本研究在国内报道了首例典型的脂溢性毛囊角化病同时合并有 智力障碍，并通过PCR、DNA测序的方法发现了一个新的错义突变。此突变 以前未见报道。此结果将进一步支持现存的一种观点即大多数的ATP2A2基因 突变是特异性的，特别是错义突变在一些其他的易感因子的协同作用下构成 了大多数毛囊角化病尤其是合并有神经、精神型毛囊角化病的发病基础。此 结果表明ATP2A2基因的突变特别是错义突变将影响钙离子的转运，使表皮 的细胞的连接和分化出现异常。该研究将为本病的遗传咨询，产前诊断，探 讨毛囊角化病的发病机制及将来的基因治疗奠定了基础。 5(小结 1 本研究通过运用组织病理、结合患者的家族史、发病经历及临床表现和家 系分析，诊断毛囊角化病明确。 2 运用提取家系基因组DNA，PCR扩增和直接测序等分子生物学技术检测出 该家系中存在K514R突变。 了ATP2A2突变数据库。 4 本研究有助于将来对于患有毛囊角化病的遗传咨询和产前诊断并为将 来 的基因治疗提供了依据。 蛊擞医叠盘堂叠?堂焦论蛊 6(参考文献 ofthe reviewclinical disease:a SM，WilkinsonJD 1992 Dafter―White 1(Burge AmAcadDermatol27:40-50( feanl?sin163 patients(J 一 and ofDarier's The 2(Munro 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