新生隐球菌的AFLP分析

新生隐球菌的AFLP分析 新生隐球菌的 A FL P分析 1 2 2 3 2 4邹先彪 温海 廖万清 吴建华 仇芸 杨金水 ( 1. 北京市解放军总医院 304临床部皮肤科 ,北京 100048; 2. 第二军医大学长征医院皮肤科 ,上海 200003; )3. 第二军医大学长海医院皮肤科 ,上海 200433; 4. 复旦大学遗传所 ,上海 200433 【摘要 】 目的 评估 A FL P2DNA 指纹技术在新生隐球菌分类中应用情况 。方法 新生隐球菌基因组 DNA 用双酶酶切 ,双 链接头连于其酶切末端 ,用与接头和酶切位点互补的引物扩增 DNA 片段 ,其产物在高分辨的变性聚丙酰胺凝胶上电泳分 离 ,然后进行银染 。结果 分析来自 5种血清型和临床分离株的 18 株新生隐球菌 ,可见有 30 多条大小在 30 ,500 bp 的 DNA 2A FL P指纹 ,相同的血清型有不同的指纹图谱 ,来自同一患者不同病期的两株分离株和来自同一患者患者的不同部位 的两株分离株都显示出相同的带型 。结论 显示了 A FL P的高分辨率 ,是适用于新生隐球菌流行病学调查的有力工具 。 【关键词 】 新生隐球菌 ; DNA;扩增片段长度多态性( ) 【文章编号 】 1673 23827 20100220101 204 【中图分类号 】 R 379. 5 【文献标识码 】 A Am p l if ied fra gm en t len g th po lym orph ism ana ly s is of C ryp tococcu s n eofo rm a n s 1 2 2 3 2 4ZOU X ian2b iao, W EN H a i, L IAO W an2q ing, WU J ian2hua, Q IU Yun, YAN G J in2shu i ( 1. D epa rtm en t of D e rm a to log y, 304 th H osp ito l A ff ilia ted to PLA Gen e ra l H osp ita l, B e ijin g 100048, C h in a; 2. D epa rtm en t of of D e rm a to logy, C ha n gzh eng H osp ito l, T he S econd M ilita ry M ed ica l U n ive rs ity, S ha ng h a i 200003, C h in a; 3. D epa rtm en t D e rm a to logy, C ha n gh a i H osp ito l, T he S econd M ilita ry M ed ica l U n ive rs ity, S ha n gh a i 200433, C h ina; 4. In sititu te of Gen e tic of )F u da n U n ive rsity, S h an gh a i 200433, C h ina 【A b stra c t】 O b jec t ive To eva lua te A FL P2DNA finge rp rin ting m e thod in the d isc rim ina tion of C. n eofo rm a ns. M e thod s Genom 2 ic DNA from C. n eofo rm a n s wa s d ige sted sim u ltaneou sly w ith two re stric tion enzym e s. Doub le2stranded adap te rs we re liga ted to the end s of re stric ted fragm en ts and DNA fragm en ts we re amp lified by PCR u sing p rim e rs comp lem en ta ry to the adap te rs and the re stric2 tion site sequence s. A FL P p roduc ts we re sep a ra ted u sing h igh re so lu tion dena tu ring po lyac rylam ide ge l e lec trop ho re sis and visua lized by silve r sta in ing. Re su lts DNA finge rp rin t p a tte rn s of 18 C. neofo rm a ns iso la te s from five se ro typ e s and c lin ica l iso la te s we re ana2 lyzed by A FL P. A FL P finge rp rin ts comp rised ove r 30 band s de tec ted in size range 302500 bp. D iffe ren t A FL P p a tte rn s we re de tec ted in iso la te s of the sam e se ro typ e and iden tica l band ing p a tte rn s we re ob se rved from in iso la te s from the sam e p a tien t a t d iffe ren t tim e in te ra ls and d iffe ren t sou rce s from one p a tian t. C on c lu s ion s A FL P is h igh ly d isc rim ina to ry, and powe rfu l ep idem io logica l too l fo r imp roving ou r unde rstand ing of C. n eofo rm an s. 【Key word s】 C ry p tococcus neofo rm an s ; DNA; A FL P ( ) [ Ch in J M yco l, 2010, 5 2 : 101 2104 ] [ 1 22 ] ,易受环境因 已显示了基因分型的优越性 , A FL P技术是一种建立在型基础的真菌分型方法 素和菌体变异的影响 ,而且特异性和敏感性差 ,不 新的分子标记技术 ,国内外在人类 、植物 、水稻和细 [ 3 ] 菌等方面已进行了相关研究 ,在新生隐球菌的研 能确定亚型的分类及感染的复发或再染 ,而基因分 究上 , 国 内 外 尚 未 见 报 道 , 该 技 术 兼 具 RA PD 和 型因是建立在分子水平上的研究 ,具有很好的稳定 R FL P的优点 ,克服了二者的缺点 ,具有丰富的多态 性 、特异性和敏感性 。既往所进行的新生隐球菌的 性和稳定性 ,可靠性好 ,分辨率高 。我们应用该技 RA PD、R FL P、PCR 2SSCP和微卫星标记技术的分析 术首次对新生隐球菌不同的血清型和临床分离株 ( ) 基金项目 : 国家自然科学基金 39770002 . 进行了初步的研究 。 () 作者简介 : 邹先彪 , 男 汉族 , 博士 , 副主任医师. E2m a il: xbzou @ 126. com A FL P实验中所用的接头和引物 表 1 1 材料和方法 Ta b. 1 A dap te rs and PCR p rim e rs u sed in A FL P 1. 1 材料 菌株 和 8 株 本 科 真 菌 室 从 1981 , 培 养 基 名 称 序 列 2000 年分离的临床株用于本项研究 , 包括 2 对各 5 ’2CTCGTA GACTGCGTACC23 ’ E coR I接头 (分离自同一例患者的 4 株分离株 其中 1 对分离 3 ’2CA TCTGACGCA TGGTTA 25 ’ 自同一个患者的不同组织来源的 ,另一对分离自同 M se I接头 5 ’2GACGA TGA GTCCTGA G23 ’ ) 一患 者 的 不 同 时 期 ; 10 株 标 准 株 新 生 隐 球 菌 3 ’2TACTCA GGACTCA T25 ’ () () () () YD 23 A 、Y10 A 、BL S2 B 、BL S3 B 、BL S65 P rim e r E20 5 ’2GACTGCGTACCAA TTC23 ’ ( ) ( ) () () () C 、Y43 C 、Y30 D 、Y26 D 、Y37 AD 和 P rim e rE2AC 5 ’2GACTGCGTACCAA TTCAC23 ’ ()YD 49 AD 均由意大利米兰大学卫生和预防医学 P rim e r M 20 5 ’2GA TGA GTCCTGA GTAA 23 ’ (研究所真菌实验室惠赠 原新生隐球菌血清型 B、 5 ’2GA TGA GTCCTGA GTAAC23 ’ ) ( P rim e r M 2C C现称格特隐球菌 。 Sabou raud ’s培 养基 1 %蛋 ) ( 白胨 , 2 %葡萄糖 , 1. 8 %琼脂 , YPD 培养基 2 % ) 蛋白胨 , 2 %葡萄糖 , 1 %酵母抽提物 。 A FL P扩增 将予扩增产物稀释 10 倍 选择性 (主要器材 Sova llRC 25B 高速冷冻离心机 美 μ后 ,取 5 L 与进行 PCR 反应 。前 12 个循环 : 94 ?) D upon t 公 司 ; Pe rk in2E lm e r Ce tu s 9600 the rm a l 国 (() (30 s, 65 ? 30 s, 72 ? 60 s一个循环 每个循环的 Cyc le r 美国 PE公司 ; 紫外凝胶成像仪 上海复 ) 退火温度降低 0. 7 ?。后 23 个循环 : 94 ? 30 s, ) 日生物技术研究所 ; Sequenc ing Ge l E lec trop ho re sis 56 ? 30 s, 72 ? 60 s一个循环 。 选择性扩增产物System s, Mode l 4001 P P rogramm ab le E lec trop ho re sis 变性聚丙烯胺凝胶电泳分离 Powe r Supp ly, A FL P Co re R eagen t Kit, A FL P Co re ( ( ) (制备 6 %变性聚丙烯胺凝胶 ,预电泳 1 h 电泳R rim e r Kit G IBCOBRL 公司 ; 酸洗玻璃珠 直径 ) 条件 : 1 200 V , 400 mA , 400 W 。预电泳结束后 ,将 ) 0. 45,0. 50 mm , Sigm a。( 扩增产 物 加等 体积 甲 酰胺 染料 98 %甲 酰 胺 , 10 1. 2 方法) mM ED TA , 0. 05 %二甲苯青和 0. 05 %溴酚兰 94 ? DNA 抽提与酶切 玻璃珠法快速抽提基因组变性 3 m in,点样于 6 %变性聚丙烯胺凝胶加样孔 DNA。以 E coR I和 M se I酶 切 基 因 组 DNA 后 在(中 ,在 1 ×TB E缓冲液电泳 电泳条件 : 1 360 V , 33 ) mA , 45 W 。 70 ?下孵育 15 m in 以使限制性内切酶失活 , 收集 银染显色反应 以 1 /1 000 硝酸银显色 ,显影 反应液 。 液需冷却至 10 ,12 ?以控制显色进程 , 从而降低 接头连接 在上一步骤中的已消化的 DNA 加 染色后的背景 。凝胶在空气中干燥后 ,即可照相记 ( 入接头连接溶液 0. 4 mM A TP, 10 mM M gA c, 50 2 录并记录实验结果 。 mM KA c, 10 mM Tris2HC l pH7. 5 , 5 pmo l E coR I接 ) μμ头 , 50 pmo lM se I接头 24L , T4 DNA 连接酶 1L 室温下温和混匀 ,简短离心收集反应液 ,并在 16 ? 2 结果 (?2 ?下连接 5 h。按 1 ν 10稀释连接混合物 接 ) 头序列见表 1 。 图 1所示的是予扩增产物的电泳 ,由于基因组 DNA 被一个多酶切位点酶和一个少酶切位点酶的 预扩增反应 将下列成分加入至 0. 2 mL 的薄 μ 双酶组合酶切成许多小片段 ,而普通的琼脂糖凝胶 壁离心管中 ,稀释的模板 DNA 5L , p rim e r E20 2. 7 μμμ() L , p rim e r M 20 12 L 含 dN TP , 5 L 10 ×PCR 因分辩力差 ,不能将这些小片段区分开来 ,因而在 ( buffe r 100 mM Tris2HC l pH8. 3 , 15 mM M gC l, 500 胶上显示出近溴酚蓝处比较集中的弥散带 ,这样的2 予扩增 产 物 才 能 进 一 步 用 于 选 择 性 扩 增 ; 经 过 ) mM KC l, T a q DNA po lym e ra se 1 un it, D istill wa te r E coR I/ M se I酶切新生隐球菌基因组 DNA ?人工 μμ 25. 3 L , 总体积 51 L。温和混匀并简短离心收双链接头连接 ?预扩增 ?选择扩增 ,最后扩增产物 集反应液 ,加入 2 滴硅油覆盖 。反应条件 : 94 ?变 在 6 %的变性聚丙烯胺凝胶上电泳并银染 ,结果显 性 30 s, 56 ?退火 60 s, 72 ?延伸 60 s,进行 20个循 示出 A FL P2DNA 指纹 有 丰富 的多 态 性 , 可 以 产 生 () 环 引物序列见表 1 。 () 存在着明显的差异 见图 2 , 通过对相同患者不 ,因而很难为临 存在着操作烦琐 、耗时过长等不足 床医师提供及时准确的诊断 。而基因分型是 同组织来源的的 DNA 指纹分析 ,发现二者的多态 建立在分子上的 ,可以进行表型所不能确定的亚型 性完全一致 ,显示该患者的病原体为同一个亚型的 分型 ,亚型分型在确认感染的爆发性流行 ,感染的 新生隐球菌 ,对同一患者不同时期的新生隐球菌的 来源 ,菌株的毒性株 、监测疫菌效应 ,医院的交叉感 [ 6 ] DNA 指纹分析 ,也得到了完全一致的带型 ,说明该 染等方面具 有重 要的 流 行病 学意 义 。M eye r等 患者的新生隐球菌感染为未愈而非再感染 。重复 用 8 种重复序列的寡核苷酸为引物进行新生隐球 菌的基 因 分 型 , 获 得 了 三 个 可 用 于 新 生 隐 球 菌 实验 ,结果一致 ,显示了 A FL P2DNA 指纹的稳定性 DNA 扩增引物 ,对 B 型和 C型的扩增结果表明 ,二 和高分辨率 。另外 ,在银染图谱中 ,可见条带染色 者有比 A 和 D 型更近的亲缘关系 。作者认为基因 () 有强弱不一之分 见图 2 , 这种差异的存在是各 分型不仅能确定不同的血清型 ,而且在相同血清型 酶切片段扩增产物量不同引起的 ,也说明不同的片 不同株中也能产生多态性 。这对临床上确认疾病 段在基因组中的拷贝数不同 ,条带着色较深的可能 的复发和再感染及流行病学调查都具有重要的意 其在基因组中的拷贝数不只一个 。 [ 7 ]( ) ( 义 。温海等 以 3个简单重复序列 GTG、GA 25 ( ) ) CA 和 GA TA 为 引 物 对 新 生 隐 球 菌 基 因 组 4 4 DNA 进 行 微 卫 星 DNA 多 态 性 分 析 , 结 果 显 示 ( ) GA TA 产生的电泳条带比前两个引物清晰且分 4 辨率更高些 ,对 A、B、C、D 四种血清型的 PCR 扩增 结果显示各型的 DNA 多态性均有明显的不同 ; 顾[ 8 ]( ) 菊林等 用微卫星引物 GACA 进行 PCR 扩增 ,4 发现新生隐球菌与白念菌的指纹存在着明显差异 , 新生隐球菌不同血清型也表现出一定程度的差异 , 即使相同血清型不同株也显现出不同程度的变异 。 (图 1 新生 隐 球 菌 A FL P 的 预 扩 增 产 物 电 泳 泳 道 1 ,7: YD10, 对 5 对分离于同一患者不同时期的标本进行检测 , ) YD23, YD30, BLS2, BL S3, YD37, BL S65; 泳道 M: M arker2000 图 2发现其中 4对呈完全一致的 DNA 指纹 ,而另一对 (A FL P选择性扩增产物银染结果 从左至右 : Y23, Y37, Y10, C43, B2, 则出现差异性条带 ,由此可验证患者的感染是复发 ( ) )Y49, B65, B23, B3, Y26,M arker pUC19 DNA /M sp I,余为临床株 还是再染抑或同时存在新生隐球菌混合株的感染 。 F ig. 1 The first amp lified p roduct ana lyzed on a 0. 8 % 2agaro se gel ( con ta in ing e th id ium b rom ide L ane 1 27: YD10 , YD23 , YD30 , BL S2 , [ 9 ] Cu rrie等 应用 CNR E21和 URA 5探针对新生隐球 ) BL S3 , YD37 , BL S65; L ane M: M a rke r2000 F ig. 2 A FL P se lec tive ( amp lifica tion p roducts by silve r sta in ing from left to righ t: Y23 , Y37 , 菌的环境株和临床分离株进行 R FL P 分析 ,结果显 ( ) Y10 , C43 , B2 , Y49 , B65 , B23 , B3 , Y26 , M a rke r pUC19 DNA /M sp I. 示 25个菌株存在着 16 种 R FL P型 ,说明各株间存 )The o the rs a re c lin ica l stra in s 在着广泛的遗传差异 ,同时也显示了 2 例患者的分 离菌与环 境 点采 染的 分 离菌 间存 在 相 同 的 R FL P 3 讨论 [ 10 ] 类型 。 End tz等 检测了 18 株空 肠弯 曲 杆菌 , 有 目前对隐球菌鉴定及实验室检查目前对隐球 菌鉴定及实验室检查有以下几种方法 、直接镜检 、 12株显示了不同的 DNA 指纹 ,由此而将菌株分为分离培养 、生理生化指标测定 、抗原抗体检测和动 2 个组群 ,但血清型与 A FL P指纹并不十分吻合 ,有物实验 。通过乳胶凝集试验检测新生隐球菌的多 3 株在 RA PD、PFGE和 R FL P中不能确定的同系繁 ,比直接镜检法的敏感性要高 ,但无论 糖荚膜抗原 [ 11 ] 殖株 在 A FL P 中 得 到 了 印 证 。 R e strepo 等 和 血清或脑脊液样本都可能会产生假阳性或假阴性 , 而且尚有不能定型的菌株 。脑脊液样本在沙氏培 W endy等 [ 12 ]认为 A FL P 可以不仅可以分型和鉴 养基上培养 ,至少 4 d 才能检测到阳性结果 , 相当 定新的菌株 ,而且对监测不同地区菌株的动力学变 [ 4 ] 耗时 。印度墨汁对脑脊液有新生隐球菌存在的 化和寻找菌株的毒性因子都有很好的帮助 。 我们的结果也显示 A FL P2DNA 指纹在不同的 m en ingitis by m ic ro scop ic exam ina tion of cen trifuged ce reb ro sp i2 血清型之间 、相同血清型之间和各个株之间均存在 ( ) na l flu id sed im en t[ J ]. J N eu ro l Sc ience, 1999 , 164 1 : 72 275. 着丰富的多态性 ,但相同的血清性之间有更多的相 [ 6 ] M eye r W , M itchell TG. Po lym e rase cha in reaction fingerp rin ting 似性 。新生隐球菌的 A FL P 指纹图所产生的多态 in fungi u sing single p rim e rs sp ecfic to m in isa te llites and simp le 性较前述的 RA PD、R FL P 及微卫星方法 所 产生 的 rep e tivive DNA sequence s: stra in va riation in C ryp tococcu s ( ) 多态性要丰富的多 ,前者每株菌可产生超过 30 条 n eofo rm a n s [ J ]. E lec trop ho resis, 1995 , 16 9 : 1648 21656. [ 7 ] 温海 ,廖万清 ,姚志荣 ,等. 新生隐球菌随机扩增 DNA 指纹分 以上的 500 bp 以下大小的带型 , 而后者仅能产生 ( ) 型研究 [ J ]. 中华皮肤科杂志 , 1998 , 31 5 : 295 2297. 不超过 10 条的大片段 , 由此可见 A FL P 技术的高 顾菊林 ,廖万清 ,柴建华. 新生隐球菌的 PCR 指纹分析 [ J ]. [ 8 ] ( ) 中华皮肤科杂志 , 1998 , 31 5 : 313 2314. 分辨能力 。 Cu rrie B P, F reund lich L F, Ca ssadeva ll A , e t a l. R e stric tion frage2 A FL P技术具有高度的分辨率和稳定性 ,我们 [ 9 ] m en t length po lymo rp h ism ana lysis of C ryp tococcu s n eofo rm an s i2 采用测序胶的银染法 ,在每个泳道得到了 30 条左 ( ) so late s from environm en tal p igeon exc retaand c lin ica l sou rce s 右的多态性片段 ,显示出了良好的分辨效果 。我们 ( ) in the N ew Yo rk C ity[ J ]. J C lin M ic rob io l, 1994 , 32 5 : 1188 2 的研究也显示 A FL P 是适用于新生隐球菌的分子 1192. 生物学分类和流行病学调查的有力工具 。 End tz H P, A ng CW , B raak N , e t al. Mo lecu la r cha rac te riza tion of [ 10 ] C am py loba cter jejun i from p atien ts w ith Gu illan2B a rre and M ill2 参 考 文 献 ( ) e r F ishe r Synd rom e s[ J ]. J C lin M ic rob io l, 2000 , 38 6 : 2297 2 2301. [ 1 ] L uc iana T, L az ra M S, W anke B , e t a l. R egional p a tte rn of the R e strepo S, D uque M , Tohm e J , e t a l. A FL P finge rp rin t: an effi2 mo lecu la r typ es of C ryp tococcu s n eofo rm a n s and C ryp tococcu s [ 11 ] c ien t techn ique fo r de tecting gene tic va ria tion of X a n th om ona s ( ) ga ttii in B razil [ J ]. M em In st O swa ldo C ruz, 2008 , 103 5 : ( ) an on opod is pv. m a n iho tis [ J ]. M ic rob io l, 1999 , 145 P t 1 : 455 2462. 107 2114. R e in s E, Tanaka k, B u rge r G, e t a l, Mo lecu la r d iagno sis and [ 2 ] W endyW J , Go rk ink R , Simon s G, e t a l. Geno typ ing ofM ad u rella ep idem io logy of funga l infec tion s [ J ]. M ed M yco l, 1998 , 36 [ 12 ] m ycetom a tis by se lec tive amp lifica tion of re stric tion fragm en ts ( ) Supp l1 : 249 2257. ( ) A FL P and sub typ e2co rre la tion w ith geograp h ica l o rigin and Yang CD , Zhang JW , XU Q , et a l. E stab lishm en t of A FL P tech2 [ 3 ] ( ) le sion size [ J ]. J C lin M ic rob io l, 2005 , 43 9 : 4349 24356. n ique and a ssessm en t of p rim er com b ina tion s fo r m e i flowe r[ J ]. ( ) P lan t Mo lecu lar B io logy R epo rte r, 2005 , 23 3 : 79 a279 l. D ay JN. C ryp tococca l m en ingitis[ J ]. P ractica l N eu ro logy, 2004 , [ 4 ] 收稿日期 ] 2010 202 211 [ ( ) 4 5 : 274 2285. [本文编辑 ] 王 飞[ 5 ] Sato Y, O sabe S, Kuno H , e t al. R ap id d igno sis of cryp tococcal