应用光镊子拉曼光谱鉴别阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的研究

应用光镊子拉曼光谱鉴别阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的研究 应用光镊子拉曼光谱鉴别阴道毛滴虫和口 腔毛滴虫的研究 第27卷,第3期 2010年5月 光谱实验室 ChineseJournalofSpectroscopyLaboratory Vo1.27.NO.3 May,2010 应用光镊子拉曼光谱鉴别 阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的研究? 梁裕芬韦俊彬毛丽华黄庶识@ "(广西中医学院基础医学院南宁市明秀路179号530001) 6(广西师范大学物理科学与技术学院广西桂林市541004) f(广西科学院生物物理实验室南宁市530003) 摘要应用激光镊子拉曼光谱技术比较分析阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的拉曼吸收峰.寻找具有分 类学鉴别价值的特征拉曼峰.通过光镊随机俘获单个大小一致,有活力的虫体,记录其拉曼光谱,收集数据 并做主成分分析在937cm,,1002cm和1446cm谱峰的强度和谱型上有差异,根据1002cm-1峰的信号 强度,并结合937cm和1002cm峰强度比值(../i...)以及1002cm和1446cm峰强度比值 (,...//)可以作为区分阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的量化指标.该法是简便,快捷,有效地鉴别两种人体 毛滴虫的新方法. 关键词光镊子;拉曼光谱;阴道毛滴虫;口腔毛滴虫 中图分类号:0657.37文献标识码:A文章编号:1004—8138(2010)03—1143—05 1引言 阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,TV)和口腔毛滴虫(Trichomonastenax,TT)都是动鞭纲毛 滴虫科毛滴虫属的原生动物,均为人体常见寄生虫.基于两种毛滴虫形态结构非常相似(图1),使 用传统病原学诊断方法不易鉴别,有学者应用具有较高敏感性和特异性的聚合酶链反应(PCR)技 术和新型培养基方法使毛滴虫的检出率增加,也提高了两种毛滴虫的鉴别度n],但这些技术过程过 于复杂.拉曼光谱可以表征物质结构,构象,反映样本中所含物质分子组成,结构及含量差异的信 息,因此拉曼光谱技术是研究物质分子结构的有用工具,多年来,此项技术在微生物的鉴别以及分 类方面已得到应用].但拉曼光谱技术需要使用物理或化学方法固定研究对象,致使研究对象在 形态结构,物质组成等方面都可能发生改变,影响研究结果.近年来在拉曼光谱技术基础上推出的 激光镊子拉曼光谱技术(ITRS),可以使研究对象在接近自然的生理状态下进行观察分析,弥补了 拉曼光谱技术的不足,在单个细胞或细胞器研究方面,包括单个细菌[4],细菌孢子],血红细胞[6], 血小板[8的研究已显示出独特的优势,在肿瘤诊断等研究中也得到了较好的应用.本研究首次利 用LTRS对阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的活体虫株进行拉曼光谱分析,寻找具有分类学鉴别价值的 特征拉曼峰,利用主成分分析的统计分析方法对光谱进行分析,判别两种毛滴虫的差异,进一步探 讨鉴别两种毛滴虫的更为简单,快速,灵敏,准确的新方法. ?广西自然科学基金项目(No.0728177);广西中医学院自然科学研究基金 (P2008099)资助 ?联系人,E—mail:hshushi@yahoo.corn.cn 作者简介:梁裕芬(1964),女,广西北流市人,副教授,主要从事人体寄生虫学教学与科研工作. l稿日期:2009一ll一16;接受Ft期:2009一l2—29 光谱实验室第27卷 2实验部分 2.1实验材料来源及准备 2.1.1仪器 TE2000U倒置生物显微镜(日本Nikon公司);spectraPr023Ooi拉曼光谱仪(美国Acton公 司);Spec—lOCCD(美国PrincetonInstruments公司). 2.1.2TV虫株的来源 TV均来自广西中医学院直属门诊部检验科,共收集5个虫株,分别编号为TV.,TV.,TV., TV和TV.虫株样品经广西中医学院陆森然副教授鉴定为毛滴虫属的阴道毛滴虫(丁.vaginalls, TV). 2.1.3TT虫株的来源 TT取自广西中医学院在校学生,共收集4个虫株,分别编号为TT,TT,TT.,TT.4名学生 分别来自口腔医学,壮医学等4个不同专业,相互间不认识,平时无接触.虫株样品经广西中医学院 陆森然副教授鉴定为毛滴虫属的口腔毛滴虫(丁.tenax,TT). 2.2实验虫体的收集 用0.01mol/IPBS缓冲液(pH7.4)对收集的TT和TV各株进行离心(2500r/min)洗涤2次, 每次10min.然后进行拉曼光谱测量. 2.3拉曼光谱实验 2.3.1激光镊子拉曼光谱系统 系统原理如文献[4,9]所述.一束波长为785nm的半导体激光(DI)经过滤波(IF)后被导人一 台尼康倒置生物显微镜(TE2000U,Nikon).激光束经油浸物镜(100×,N.A.=1.30)聚焦后在焦 点附近形成了一个单光束光势陷阱.这束激光也用来激发被囚禁细胞的拉曼散射.在收集光路里, 物镜也作为透镜收集来自细胞的拉曼散射光.一个150~m的针孔(PL)用来去除离轴的散射光.两 个干涉陷波滤波器(HNF)用来滤除波长与激发波长相同的弹性散射光.然后拉曼散射光被聚焦进 光谱仪(SpectraPro23OOi,Acton)输入狭缝,测定拉曼光谱.光谱仪的衍射光栅参数是闪耀波长为 650nm,600线/ram.光谱仪耦合到电荷耦合器件CCD(Spec一10,PrincetonInstruments)上,用液氮 冷却CCD温度到一120V.样品池是在一个75×25×4mm有机玻璃载玻片中心开一个上部直径 6mm,底部直径4mm的圆孔,下部用0号石英片将圆孔密封.被俘获的细胞通过一个摄像机系统 (VC)连续监视. 2.3.2拉曼光谱的测定 分别吸取含有虫体的悬浮液200gL于样品池中,加盖玻片,光镊随机俘获单个大小一致,有活 力的虫体,以17mW,785nm激光激发,积分时间30s,每个样本分别测定3O个虫体的光谱.用同样 方法收集来自溶液,盖玻片和光学部件的背景光谱. 2.3.3光谱数据的处理 将光谱数据转换为ASCII数据,利用基于Matlab7.0自编程序进行光谱预处理,将背景先平 均,后5点平滑;每个虫株光谱减去平均平滑后的背景,然后再5点平滑.最后输入软件Micro Origin8.0处理,截取信号峰集中的600--1800cm-1的指纹区进行光谱分析. 第3期梁裕芬等:应用光镊子拉曼光谱鉴别阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的研究 每个样品随机选择20个虫体的光谱,选取信号峰集中的600--1800cm的指纹区域,以 1446cm_1峰的强度做归一化,应用PyChem1.0.2软件做主成分分析(PrincipalComponents Analysis,PCA),输出两维PCA结果.另外,阴道毛滴虫5个虫株各随机取2O个虫体的光谱共100 个光谱做一组,口腔毛滴虫4个虫株各随机取2o个虫体的光谱共80个光谱做一组,用The Unscrambler9.7软件做PCA,然后将数据导入软件MicroOrigin8.0绘三维PCA图. 3结果与讨论 3.1结果 图1左侧是所测定的阴道毛滴虫(TV)5个虫株和口腔毛滴虫(TT)4个虫株单个细胞的平均 拉曼光谱;图1右侧是对应的TV和TT活体的100×油镜显微照片,照片显示两种毛滴虫形态 结构相似,都呈倒梨形,用显微镜不容易辨认.图1各拉曼信号峰所对应生物大分子的归属,主要峰 值代表的是碳水化合物,蛋白质(氨基酸)和脂肪的基团(表1),结果显示两种毛滴虫的拉曼光谱基 本相似,都有基本的光谱峰型,而在一些谱峰的强度和谱型上有差异,反映了TV,TT这两种毛滴 虫有类似的化学组成成分,但某些成分的含量或构成是不同的;具有指标性质的1002cm峰的信 号强度,TV明显高于TT,TV.一TV虫株1002cm峰的信号强度均比TT一TT虫株的强度大 2倍左右;TV1一TV5虫株1002cm与937cm强度之比(937/i1..2)平均值分别为0.867,0.666, 0.853,0.928,0.582,而TTl—TT4的1937/z1.o2值分别为1.601,1.926,1.186,1.096,TV 的值均小 于TT值;TVl—TVs虫株1002cm与1446cm之比(1..2/Il446)平均值分别为0.417,0.394, 0.396,0.440,0.424,而TTl—TT4的平均值分别为0.212,0.210,0.276,0.255,TV的值大于TT 值大约2倍.1002cm是苯丙氨酸苯环的伸缩振动,在各种生物样品中其拉曼信号明显而且稳定, 与其他信号谱峰几乎没有重叠或叠加,可以直接用于表征细胞内物质的变化,所以常作为生物样品 的内标.1445cm是生物细胞内碳水化合物,蛋白质和脂类的CH.一,一CH:一,一C一0H弯曲振 动信号的叠加,拉曼信号也是比较明显而且稳定,也常常作为生物样品的内标. 蕙 6000 4000 0 600l0001400l800 拉曼位移/cm.1 图1阴道毛滴虫(TV)和口腔毛滴虫(TT)平均拉曼光谱图及其对应的显微照片 上述结果从PCA分析也可以看出,在TV和TT拉曼光谱PCA的三维图中,它们的光谱各自 相对集中分布在两个不同的空间,区分明显,很容易判别[图2(c)-I.TT的4个虫株之间拉曼光谱 光谱实验室第27卷 差异不明显,PCA互有重合,光谱落人大致相同的区域[图2(6)];但是,阴道毛滴虫TV,TV, TV.,TV的4个虫株的光谱几乎分布在相同的区域,差异很小,而TV的光谱落人不同的区域[图 2(n)],说明同一种阴道毛滴虫不同虫株之间还是有差异的,从图1的拉曼平均光谱图也可以看出 它们的差异. 表1毛滴虫主要拉曼光谱信号峰归属[103 拉曼峰位置(cm--)归属 腺嘌呤 核酸0一P—O伸缩振动 酪氨酸/或葡聚糖c—o,C—C,C—H弯曲 蛋白质c—c伸缩振动,碳水化合物的?_乙酰基葡萄糖 苯丙氨酸环内c—c对称伸缩振动 淀粉和纤维素的c—OH弯曲振动或苯丙氨酸c—H键 糖类c—c,c—O键伸展振动模,蛋白质,脂类c—c,c—N键伸缩振动 核酸的O—P—O对称伸缩振动,脂类的C—c扭曲振动 蛋白质c—N伸缩振动 碳水化合物,核酸,蛋白质的CHzOH基团 脂类 葡聚糖的一c—OH弯曲振动.碱基.蛋白质c—H变形振动 碳水化合物和蛋白质的CH3一,一cH2一,一cH2一OH弯曲振动 酪氨酸和苯丙氨酸C—c键振动模 螺旋 0:TV.?:TT t【l1(90.j6u/0J 图220个阴道毛滴虫(TV)和口腔毛滴虫(TT)主成分分析二维(n,6)和三维(f)图 3.2讨论 拉曼光谱技术是一种比较成熟的分析测试技术,目前主要应用于生物医学,药物学,微观力学, 材料学等领域.从拉曼光谱的特征峰的位置,强度和线宽可以获得样品的分子组成 及结构信息,因 此拉曼光谱巳成为研究物质分子结构的有效手段.尽管TV和TT亲缘关系较近,但通过拉曼光谱 可以测量它们之间的物质分子组成及结构差异.经综合分析,实验结果表明单个活体TV虫株细胞 中含有苯丙氨酸成分的蛋白质含量明显高于TT虫株,所以,1002cm-1峰的信号强度结合1937/11oo2, 第3期梁裕芬等:应用光镊子拉曼光谱鉴别阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的研究l147 Ilooz/I…的比值可以作为区分阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的量化指标. 在本研究中,TV的5个虫株分别来自南宁市和周边地区,在拉曼光谱PCA的三维图中,TV 的光谱落入了与其他虫株不同的区域,表明不同虫株之间物质组成和结构存在差异,这与袁丽杰 等t的结果也相符.而4个TT虫株之间的差异较小,它们的拉曼光谱比较一致.LTRS结果显示 的是两种毛滴虫真实生理状态的特征,尽管TV--TV虫株之间,TT--TT虫株之间的拉曼光谱 不完全相同,但它们之间的变化均在一定范围内,差异不明显,而TV和TT在一些谱峰的强度和 谱型上却有明显差异,反映了TV,TT这两种毛滴虫有类似的化学组成成分,但某些成分的含量或 构成是明显不同的. 两年来,本研究组研究了鉴别两种毛滴虫的多种方法,结果表明,LTRS技术和同工酶分离技 术均为灵敏,准确的鉴别两种人体毛滴虫的新方法,但应用LTRS从人体取出样本后即可进行光 谱观察和分析,不必进行毛滴虫的培养,扩种以及后续的蛋白酶提取过程,所以相比较同工酶分离 技术而言,应用I.TRS鉴别阴道毛滴虫和口腔毛滴虫,具有更为简便,快捷和样品量 少的特点. 番考衙i'L ' [1]徐敏,尹跃平,余艳华等.男性毛滴虫性尿道炎215例致病情况调查[J].中华皮肤 科杂志,2004,37(10):603. 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Abovevaluescanbeusedasanindexquantificationa1lytoidentifyTVandTT.Themethodcanbe usedtorapidlydiscriminatetrichomonadsfromvariousspecies. KeywordsIaserTweezers;RamanSpectroscopy;Trichomonasvaginalis;Trichomonastenazc