门静脉注射D-氨基半乳糖和脂多糖建立猪急性肝功能衰竭模型

门静脉注射D-氨基半乳糖和脂多糖建立猪急性肝功能衰竭模型 门静脉注射D-氨基半乳糖和脂多糖建立猪 急性肝功能衰竭模型 中华医学杂志2oo5年6月8日第85卷第21期NatlMedJChina,June8,2Oo5,V0l85,No.21 门静脉注射D一氨基半乳糖和脂多糖 建立猪急性肝功能衰竭模型 彭承宏肖卫东吴伟顶周光文张明均舒明陈辉星李宏为 【摘要】目的通过门静脉注射D-氨基半乳糖(D-Ga1)和脂多糖的方法建立一种接近临床条件 的猪急性肝功能衰竭(AHF)模型.方法22头健康家猪随机分为5组.组I:门静脉注射生理盐水 (3头);组I1:门静脉注射1/kg脂多糖(5例);组11I:门静脉注射0.5g/kgD-Gal(5例);组IV:门静 脉注射0.5g/kgD?Gal+1g/kg脂多糖(6例);组V:门静脉注射0.5g/kgD-Gal+1g/kg脂多糖, 接受辅助性部分原位肝移植术(APOLT)(3例).观察各组动物的临床表现,生化指标和病理改变. 结果组I和组?动物全部存活,生化指标轻度改变.组?动物1周内死亡率为40%(2/5).组? 中5例(5/6,83%)在120h内死亡,注药后48h血清天冬氨酸氨基转移酶达最高峰(4912U/L? 759U/L),同时伴有总胆红素,乳酸,血氨明显升高和凝血酶原时间延长.组V动物行APOLT治疗后 AHF逆转,第3天起各生化指标开始恢复,至第7天基本恢复正常,病理结果显示原肝得到部分再 生.结论通过门静脉注射0.5g/kgD-Gal和1g/kg脂多糖的方法可建立一种理想的猪急性肝功 能衰竭模型.该模型可用于辅助性部分原位肝移植治疗急性肝功能衰竭的研究. 【关键词】肝功能衰竭,急性;D.氨基半乳糖;脂多糖 EstablishmentofaporcinemodelofacutehepaticfailurebyintraportalinjectionofD-galactosamine andHpopolysaccharidePENGCheng-hong,XIAOWei—dD,Wei-d,ZHOUGuang-wen, ZHANGMing-ju~,SHU,CHENHui-xing,LIHong-ttJeDepartmentofSurgeryandOrgan TransplantationCenter,RugnHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200025,China 【Abstract】ObjectiveTodevelopaclinicallyrelevantporcinemodelofacutehepaticfailure (AHF).MethodsTwenty-twohealthypigswererandomlydividedinto5groups:groupI(n=3. intraportallyadministeredwithnormalsaline),groupII[n=5,intraportallyadministeredwithlg/kg0f lipopolysaccharide(LPS)],group? [n=5,intraportallyadministeredwith0.5S/kgofD-galactosamine (D-Ga1)],groupIV(n=6,intraportallyadministeredwith0.5S/kgofD-GalpluslkgLPS),and groupV[n=3,intraportallyadministeredwith0.5g/kgofD— Galpluslg/kgLPSandthenreceiving auxiliarypartialorthotopiclivertransplantation(APOLT)],Bloodsampleswerecollectedtoexaminethe arpartatetransaminase(AST),totalbilimbin,lacticacid,bloodammonia,prothrombintime(PT),blood sugar,andcreatineatdifferenttimepoints.Autopsywasperformedonthedeadanimals.Eightdaysafterthe APOLTlaparotomywasperformedagainonthesurvivingpigstotakespecimensoftheoriginaland transplantedlivertoundergopathologicalexamination.ResultsAllthepigsinthegroupsIandIIsurvived withminimalchangesinliverfunctiontests.Twoofthe5pigsinthegroup? died(加%),5pigsinthe groupIV(5/6.83%)diedwitl1in120h,witl1asignificantincreaseinaspartatetransaminase4 8hafter (4912U/L?759U/L).Incomparisonwiththoseof山 egroupland2,tl1eTBIL,bloodammonia,lactic acid,andPT48hafterofthegroup4wereallsignificantlyhigherandthebloodsugarwassignificantlylower (allP<0.05).ReversalofAHFinthepigsinthegroupVfollowingAPOLTwasobservedandtheliver functionreturnedneartonormallevelonthe7tl1postoperativedayandregenerationofthenativeliverwas confirmedhistologically.ConclusionTheporcinemodelofAHFinducedbyacombinationofD.gal (0.5S/kg)andLPS(1ttg/kg)willbeofmuchuseinthedevelopmentofAPOLTforAHF. 【Keywords】Liverfailure,acute;D-Galactosamine;Lipopolysaccharide 基金项目:上海市科技发展基金资助项目(02DJ14038) 作者单位:200025上海第二医科大学附属瑞金医院外科及器官 移植中心 . 论着. 急性肝功能衰竭(acutehepaticfailure,AHF)常 由病毒性肝炎,药物中毒,毒性物质中毒及自身免疫 等原因引起,发病急,死亡率高达80%.近年来的 临床经验表明,相对于传统的全肝移植,辅助性部分 2005年6月8日第85卷第2l期NatIMedJChina,June8,2Oo50l堕 原位肝移植(auxiliarypartialorthotopicliver transplantation,APOLT)对于肝功能可以逆转的 AHF患者是更理想的治疗方法,但目前国内外对 APOLT治疗AHF的研究仍缺乏一种理想的大动物 模型.本研究旨在采用门静脉注射D一氨基半乳糖 (D—galactosamine,D—Ga1)和脂多糖的方法建立一种 可用于APOLT研究,符合人体AHF发展过程的猪 AHF模型,以期应用于解决临床实际问题.现将研 究结果报道如下. 材料与方法 一 ,材料 选择23,27kg的健康雌性家猪22头,随机分 为5组.组I(3头):门静脉注射生理盐水;组?(5 头):门静脉注射1g/kg脂多糖;组?(5头):门静 脉注射0.5g/kgD—Gal;组?(6头):门静脉注射 0.5g/kgD—Gal+1g/kg脂多糖;组V(3头):门静 脉注射0.5g/kgD—Gal+1g/kg脂多糖,接受 APOLT术.实验动物购自上海松江松联实验动物 中心,脂多糖购自Sigma公司,D—Gal购自重庆医科 大学生物医学工程研究所. 二,方法 1.组I,?:动物术前禁食12h,禁水6h.术 前常规给予阿托品0.5mg肌注.肌肉注射氯胺酮 10mg/kg基础麻醉后,行气管插管静脉复合麻醉, 呼吸机控制呼吸.右颈外静脉置Arrow导管备作抽 取血标本.上腹正中取一小切口进腹,经胃网膜右 静脉置管注药.注药完毕后关腹.动物麻醉醒后置 饲养笼内,次日晨自由饮水,进食. 2.组V:门静脉注药24h后行APOLT术.供 受体体重相当.每次APOLT时另备一重75kg左 右成猪作供血用.采用气管插管静脉复合麻醉.按 常规方法获取供肝.将供肝左叶在体外修整时切 除,右叶肝作为移植肝,切除受肝左叶,供体肝上下 腔静脉与受体肝上下腔静脉行端侧吻合,供体门静 脉与受体门静脉行端侧吻合,受体脾动脉在结肠后 与供体肝动脉端端吻合,胆总管置管外引流.术中 采用脾静脉,股静脉至颈外静脉的转流方式.具体 手术过程见文献[1].术中无肝期静脉注射甲泼尼 龙250mg和FKS060.04mg/kg.术后禁食3d,每 日补葡萄糖水和生理盐水1500,2000ml,3d后给 予常规的饮食.术后前3d每日静脉滴注青霉素 4OO万u和庆大霉素16万u.免疫抑制剂FKS06 0.04mg?kg,?d维持7d,术后前5d静脉注射 甲泼尼龙(剂量分别为125,100,75,50,25mg/d). 3.观察指标:组I,?:(1)观察动物的精神状 态和生存情况.(2)注药前(0h),注药后24,48, 72,96h分别经右颈外静脉置管抽血,测血清天冬 氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(T—Bil),乳酸,血 氨,凝血酶原时间(IT),血糖和肌酐.(3)对死亡动 物即刻作尸检,观察有无腹水及肝脏大体情况,同时 获取肝脏,心脏,肾脏,肺脏和小肠组织标本,行常规 病理检查.组V:(1)观察动物术后的精神状态和 生存情况.(2)注药前,APOLT术前(即注药后 24h),APOLT术后第1,3,7天分别经右颈外静脉 置管抽血,测血清AST,T—Bil,乳酸,血氨和PT.(3) 对死亡动物即刻作尸检,观察有原肝及移植肝的大 体情况,有无腹内感染,吻合口出血或血管栓塞等异 常,分析死亡原因.存活动物于APOLT术后第8天 再次进腹获取原肝及移植肝组织标本行常规病理 检查. 4.统计学处理:计数资料以平均值4-误表 示,进行单向方差分析(SPSS10.0统计软件).P< 0.05认为差异有统计学意义. 结果 1.临床特征及生存结果:组I和组?动物在麻 醉清醒后迅速恢复正常活动,全部动物均存活.组 ?部分动物第1,2天出现精神萎靡,食欲减退,呕 吐和活动减少,2例分别于第3,5天死亡(2/5, 40%),其余3例存活,存活的动物在第3天起上述 症状渐消失.组?动物术后除出现上述表现外,还 出现步态不稳,反应迟钝等表现,其中死亡5例(5/ 6,83%),1例于第1天死亡,3例于第3天死亡, 1例于第4天死亡.病猪死亡前均出现肝昏迷,不 能站立.另1例第5天起症状开始好转,存活7d 以上.组V动物在APOLT术后12h左右清醒,第 3天起开始进食,1周后动物基本正常,1周存活率 为100%. 生化指标变化:组I和组?动物的的生化指 2. 标无明显变化.组?动物,注药后AST中度升高, 48h达高峰(1354U/L4-227U/L).组?动物注药 后AST明显升高,48h达高峰(4912U/L4-759U/ L)并显着高于组11I(P<0.05).正如表1所示,48 h时组?的总胆红素,血氨,乳酸和PT均明显高于 组I和组?,血糖水平则明显降低.组?中存活的 动物72h后异常的生化指标开始恢复.血肌酐水 平各组间以及各时点间均无明显变化.组V动物的 中垡瞑学杂志2005年6月8日第85卷第21期 NailMedJChina.June8,2005,Vol85,No.21 表14组猪在不同时间点生化指标的变化(面?s) 注:与组I相比较,'P<0.05;-q组?相比,P<0.05;与组?相比,P<0.05 表2组V猪不同时间段的生化指标的变化(面?s) 生化指标变化见表2,可见行APOLT治疗后AHF可 逆转,至第7天各生化指标基本恢复正常. 3.病理检查结果:组I,?中1周内死亡7例 (组11I2例,组?5例),尸检发现全部死亡病猪有淡 黄色腹水300,800ml,肝脏表面有多处散在的出血 点,常规病理见大量肝细胞坏死伴出血(图1),心 脏,肾脏,肺脏和小肠无明显异常病理变化.组V动 物APOLT术后均存活7d,第8天获取的肝脏组织 常规病理检查发现:原肝肝小叶结构基本正常,部分 肝细胞具双核的表现,提示肝细胞增生活跃(图2); 移植肝肝小叶结构正常,可见肝细胞轻度变性和汇 管区单核细胞,淋巴细胞浸润(图3). 讨论 AHF的治疗十分棘手,肝移植是目前惟一有效 的治疗手段.AHF虽然发病急,死亡率高,但是具 有可复性的特点.施行APOLT则可避免全肝移植 后应用免疫抑制剂,增加药物副作用和致癌的危险, 全肝移植反应.国外研究报道,AHF施行APOLT 术后的1年及5年生存率与肝移植相当,并且有 65%的患者可在1年内停用免疫抑制剂].因此, 理论上APOLT对于肝功能可以逆转的AHF患者是 更理想的治疗方法,但APOLT术本身还存在一些令 人迷惑的问题,对这些问题进行研究迫切需要提供 目I组w特擒见垦肝细眦坏佧mliE蛇(]0目2v端A…LT术^书;8r病理化HEx2? 0 目3v许^m术f第8穆?reef缃舭#鹰变性管棒胞淋口细胞HEx200 与临床过程棚似的^HF大动物模础 Terblanche等提理想『l勺AI|F动物模刊应 具有6个特征:即复件肝衰竭致死,有治疗茴治 疗后肝衰可逆,大动物模型及对实验人员危告小 【==I前凡础物AHF模主要有手术模,药物模型, 药物联合手术模型二大类相比之F,药物模的 建市世为简便,氯化碳,D—Gal,对己酰氨革酚,脂 多精搜硫代乙酰胺讯I"豆素A等均有应j=Ij报道 最近Takada等报道采用fJ静脉注制鹅肯蕈碱 和脂多柑的^法可以存48h内诱导猪产生MtF,该 模刑与临脒LAHF病理变化相近,作者认为较为理 想,但该模型肝功能衰竭过千严24l1时AST升 高至9757U/L?2167U/L,全部动物在96h内死 亡,瀹疗窗较窄且药物a粥膏尊碱过于昂贵为 此,在奉研究c1I我1『J存此基础E作了改进,应用 O5g/kg的D—Gal代许a一鹳膏蕈碱结果发现组? 动物给药后4811AST水平达到最高峰(49I2ll/T.? 759U/L).动物北亡率高达83%m且病绪均出 严重的代十异常,如高乳酸血痛,凝血时延长,商 总脾红素血症,血氧血症和低血精管本研究 中柬监洲顺内和脯也.病猪死前可出州明 显的肝性腩病表现一J1检发现全部病猪有腹水肝 脏表冉多处敞在的出衄点.病肝织常规病理发 现尢量肝细胞坏死伴出血表明该模型接近临珠 AHF病理生理世程为进步证实浚AHF模型碲 为肝衷致北且有一定的治疔寓,往组V中.在诱导 AHF后上L在肝哀高峰前采用APOLT治疗.结果3倒 手术均抉成功.术后1周t2基率正常,动物的1周存 活率为100%,l术后筇8天病理结果显示原肝得到 部分再生该结表明.本幔型所致的^1在得到 具有良好)J能的部分肝脏支持后,t玎渡过危Ji每期,原 肝可以重新完全再生,恢复IE常功能纽?动物多 在48h后死亡,提示48h前的一段时问是本模型的 治疗窗,寸台疗AHF的各种措施町在此趴进秆 实验 在泼模rfi,D—Gal通过抑制肝细胞的RNA千II 浆膜蛋白的台成造成肝细胞破坏,同时电诱导产生 fj静脉内莓索血症组?叶1单用n—Gai门静脉注射 后即自较明显的生化指标变化,全组动物死r率为 40%=而在组?中.联合应用脂彩糖增加f-DGa] 的肝脏损害作用,肠道细菌移位及门静弥内露素血 症.棚药有叫显的同作用:闻此,在短日_J间内引起 为严再的肝损害=术研究表jD—Ga]和脂多糖 直接注入门静脉,作用型为接,与单用D-Gal (1ks)外嗣静脉注射诱导大动物^1相比,I-). GaL矸J量减少丁I/2.我们认为.卒模型方法具有经 济简便可靠仃治疗窗,符合临床AHF的病理生理 变化等优点,是一种理想的AHF大动物模趔.可用 r对APOLT治疗^lIF进行深入『究. 参考文献 jPg1PHEl…— ll1IPIfora…il…ialorthut~)l>]CImrIrtJnsplanlntionNuIlMlJ china2(282:【0541056 露者.斌彭艘牖.荨新辅助忡垃升肝咎动料 模建i【_华学采2(~1282:1054I惦^ 2皿HkndeI'…Jlloudjen,,,KaJAnxiliaJ3"…s nJ?llcliver【?~IJ.|lr目cuIt1j…fmluELTRAIuI{ GroupEumpe~^ux?.LiverI'ra~l/JmaRlJHepatol l9gg30:?70 3Tt!d,laneileJII]ckm~R^nimalmtlr]el~lfrhl…IhepatiI failure.I)igI11sScil99l3677(/-774 4RTn锄1MlIod~n11j^n~moJm,~delsotIIehepticteilum lntJExpl?I】l20(108II45l57 5]'~lkadaYIshib~msFukunagaK"aLI…Illnt…i8I P…inpo~ilJemelf,f[uh1][rltlolIf|c血l…m 一10x?rj"JIj【口KInJIlepat~lJ2{)0134:825#3l 6K~lpansK1JnEHSSotl{dhl…tI? galm…l?P-indnc~dhlI?l?hepati~【Ininikpig.JsL 】t日199982I2It30 收稿?期200410-2I' 4-史辑:陈新亓)