耐糖鼠李糖乳杆菌发酵生产L-乳酸的研究

耐糖鼠李糖乳杆菌发酵生产L-乳酸的研究 2007.VoL28.No.”食品研究与拜发科学研究 耐糖鼠李糖乳杆菌发酵生产L一乳酸的研究 于雷’,裴晓林.雷霆 (1.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春130118; 2.吉林大学分子酶学工程教育部重点试验室,吉林长春130021) 摘要:对一株耐糖鼠李糖乳杆菌在高浓度葡萄糖条件下发酵生产L一乳酸进行研究.考察了接种量,发酵温度, pH和中和剂对乳酸发酵的影响.结果表明最适发酵条件为接种量15%(w/w),温度40oC,pH6,3,中和剂为氨水.当 初始葡萄糖浓度为200L时,在16L罐中分批发酵90h,L一乳酸浓度达到182.8g,L,转化率为91.4%,产酸速率 为2.03g/(h’L1. 关键词:L’乳酸;耐糖;鼠李糖乳杆菌 SI’UDY0L—lJACIIJCACIDPRODUCTIOBYGLUCOSE—TOLERANT lACToBACILLUsRHAMNosUsGS2 YULei’,PEIXiao-lin2,LEITing2 (1.CollegeofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,C hangchun130118,Jilin,China; 2.KeyLaboratoryforMolecularEnzymologyandEngineeringofMinistryofEducation,JilinUniversity, Changchun130021,Jilin,China) Abstract:ProductionofL-lacticacidbyglucose-tolerantLactobacillusrholrt - no$11.8GS2inhighglucosecon— centrationwasstudied.Theeffectofinoculumvolume,temperature,pHandneutralizeronL-lacticacidpro— ductionwasinvestigated.Theresultsshowedthattheoptimuminoculumvolume,temperature,pHandneutraliz- 基金项目:吉林省农业科技发展资助项I~t(200302202) 作者简介:于雷(1973一),男(汉),讲师,博士,研究方向:食品微生物学 及发酵工程. ???…??h?’11?,111?qI??r?…?}h?’11 65%;木瓜蛋白酶(精)的酶解小麦面筋蛋白后,蛋白含 量为2.81%,回收率为76.60%,水解度为58.22%, 水解产物DPPH自由基的清除率为76.5%. (2)对比小麦蛋白水解专用酶和木瓜蛋白酶(精), 其水解小麦面抗氧化产物的能力均较理想,但考虑到 小麦蛋白水解专用酶为经过精心研究蛋白酶,成 本价格均相对较高.因此,可以考虑选择木瓜蛋白酶 (精)作后面的研究. 参考文献: 【1】唐振兴,石陆娥,易喻.谷朊粉的开发与利肺J】_粮油加工与食 品 机械,2005(3):60-62 [2】王叔全.谷朊粉应用概述[J】_粮油食品科技,2000,8(2):5—7 【3】魏本军.小麦面筋蛋白在面包专用粉中应用研究[J】_粮食与油 脂, 2002(6):7—8 f4】齐军茹,王兰,李瑜.中性蛋白酶对小麦面筋蛋白的水解改性研 b?IIII?h?-???II 究【J].郑州工程学院,2001,22(4):46_49 【5】袁超,刘亚伟,杨宝,等.小麦淀粉与小麦面筋蛋白生产[J].西部 粮油科技,2003(1):34—36 【6】Adler—NissenJ.Enzymatichydrolysisoffoodprotein【M】.London: Elsevierappliedsciencepublishers,1986:12-14 【7】高福成.食品加工过程模拟,优化,控制[MI.北京:中国轻工业出 版社,1999:112—117 [8】MargotA.,FlaschelE.,RonkenA.ContinuousmonitoringofeIlzy__ maticwheyproteinhydralysis:correlationofbaseconsumptionwith solublenitrogenconten[J].ProcessBiochemistry,1994,29:257-262 【9】陈建芬,何卫华,钱伏刚.荷叶提取物口腔抑菌有效成分的定性 定量分析[J1.日用化学工业,2003,33(1):49_51 【1O】IJuY,FooLY.Antioxidantandradicalscavengingactivitiesof polyphenolsfromapplepomace[J].FoodChemistry,2000,68:81—85 【11】ShonMY,KimTH,SungNJ.Antioxidantsandfreeradicalscaveng- ingactivityofPhellinusbaumii(PhellinusofHymenochaetaceae)eX-- tracts[13.FoodChemistry,2003,82:593—597 收稿日期:2007—07—02 科学研究食嚣讲究与并发2oo7.Vo1.28.No.1185 erwas15%(w/w),40?,6.3andNH40H,respectively.ThehighL-lacticacidconcentrationinbatchfermen— tation,182.8g/L,wasobtainedwith200g/Linitialglucosein16Lbioreactorat 90h.Theyieldwas91.4%and theaverageproductivitywas2.03g/(h.L1. Keywords:L-lacticacid;gluc0se—t0lerant;lactobacillusrhatnno$u3 乳酸作为世界上公认的三大有机酸之一,广泛应 用于食品及与食品相关的行业.由于人体和动物体内 只含有L一乳酸分解酶,只能代谢自身产生或摄人的 L一乳酸,因此L一乳酸在食品,饲料和医药行业中备受 重视【.研究还发现以L一乳酸为原料制得的生物可降 解材料一聚乳酸具有良好的初期机械性能,透明性,抗 菌性和防霉性;其膜材具有良好的透氧性和透水蒸汽 性,使用寿命可达2年,3年.聚乳酸可用来制造塑料 食品器具和食品包装材料等[3-5]. 目前,L一乳酸的生产方法主要为发酵法.利用根 霉发酵生产L一乳酸存在转化率低,副产物多,发酵过 程中需要通气搅拌使生产成本上升等不足.基于上述 原因,近年来人们逐渐将目光转向同型发酵的乳酸菌. 其中,鼠李糖乳杆菌生产L一乳酸,转化率高,产品光学 纯度高,已成为研究人员关注的热点之一.在乳酸分 批发酵中,提高底物浓度可以有效提高发酵液中乳酸 浓度,降低下游过程的成本【lOl.因此,研究耐糖鼠李糖 乳杆菌发酵特性不仅对L一乳酸的工业化生产将起到 重要的作用,而且还将有助于推动聚乳酸产业的发展. 本试验以一株耐糖鼠李糖乳杆菌为研究对象,考察了 在发酵罐中的分批发酵条件,并且在较高的初糖浓度 条件下得到了满意的结果. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种 耐糖鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhalnnoslz$GS2) 为I,_乳酸同型发酵乳杆菌:由吉林大学分子酶学教育 部重点实验室提供. 1.1.2主要试剂及仪器 L一乳酸标样:Sigma公司;玉米浆干粉:吉林省黄 龙食品工业有限公司;糖蜜:吉林省大成集团. AB104一N电子天平:MetflerToledo公司;Fresco Heraeus微量台式高速冷冻离心机:德国科峻(Kendro1 仪器公司;SW—CJ一1C标准型洁净工作台:苏净集团苏 州安泰空气技术有限公司;LC一9A高效液相色谱:日 本岛津;Cary一50紫外光谱仪:美国瓦里安(VARIAN) 技术有限公司;MCO一15ACHeraeusCO:培养箱:德国 科峻仪器公司;ZHWY一211C自动开启型恒温培养振 荡器:上海智城分析仪器制造有限公司;L1523型16L 发酵罐:瑞士比欧生物工程公司. 1.1.3培养基 种子培养基:酵母粉12g,葡萄糖80g,蒸馏水 1000mL,酵母粉和葡萄糖分别灭菌,121oC灭菌20min, 冷却后混合. 发酵培养基:葡萄糖120.0g,糖蜜37.0mL,玉米 浆43.Og,Tween8015mL,MnSO40.3g,蒸馏水1000mL. 葡萄糖,糖蜜和玉米浆分别灭菌,调节合适pH值,115oC 灭菌20min.在此基础上,根据实验需要按比例改变其 组分含量. 1.2方法 1.2.1种子培养 将保存菌种传代活化后,以10%的接种量接人种 子培养基,在37?恒温培养振荡器(200r/min)中培养 18h. 1.2.2分批发酵培养 在16L发酵罐中加入12L发酵培养基,以6%的 接种量接种.发酵温度40?,pH由25%的氨水控制 在6,3,转速为200r/min. 1.2.3乳酸发酵液的检测 发酵液采用日本岛津LC一9A高效液相色谱法分 析.色谱分离柱为SCR一101H排阻离子色谱柱;检测 器为SPD一6AV紫外检测器;流动相为0.01mol/L高 氯酸水溶液(pH:2.5);流动相流速为0.7mL/min;紫外 检测波长为220nm;柱压为4xl&Pa;柱温为室温;进 样量为5IxL.葡萄糖检测采用DNS法.细胞密度用紫 外分光光度计(Cary一50)测定OD600,并转换为菌体 干重. 2结果与讨论 2.1接种量对发酵过程的影响 通常采用较大的接种量可缩短细菌生长达到高峰 的时间,使产物的合成提前.但是接种量过大,会使菌 种生长过快,培养液粘度增加,菌体早衰,造成发酵后 劲不足,影响产酸量及转化率.反之,接种量过少,菌体 增长缓慢,会延长发酵周期,不利于菌株高产.为此,确 定最适接种量是十分必要的.选择接种量分别为4.6, 8,10,12%进行发酵实验结果见图1. 862oO7.Vo1.28.No.11震磊研究麓拜科学研究 接种量/% Inoeulumvolume/% 图1接种量对发酵过程的影响 Fig.1Effectofinoculumvolumeonlacticacidfermentation 如图1所示,当接种量超过6%时,乳酸的产量变 化不明显.大多细菌由于接种量增加会引起营养物质 消耗过快,导致氧气消耗抑制生长,而这情况对该厌氧 鼠李糖乳杆菌可能影响不大.从减小由种子液带入到 发酵培养基中对菌体有抑制作用的代谢产物角度考虑 选取最小的接种量,即6%接种量用于耐糖乳杆菌 GS2的乳酸发酵. 2.2发酵温度对发酵过程的影响 温度不仅会影响各种酶反应的速率,还会影响发 酵液的物理性质.发酵温度升高酶反应速率增大,生长 代谢加快,产物生成提前.但是温度过高,酶本身容易 失活,菌体加快衰老,最终影响产量.因此,发酵过程中 应该维持适当的温度,才有利于乳酸生产的顺利进行. 分别采用37,40,43o【=三个不同培养温度,对发酵乳酸 的影响进行研究,结果见图2. l 要 专 发酵时间/Il Fermentationtime/h 图2发酵温度对发酵过程的影晌 Fig.2Effectoftemperatureonlacticacidfermentation 从图2中可以看出,当发酵温度为40o【=时,乳酸 产量最多,可是与在37o【=发酵温度下相比,乳酸产量 提高不十分显着.但考虑到40?时乳酸产量有少许提 高,并且较高的温度在实际生产中也有利于减少冷却 水循环量和降低污染杂菌的机会,因此将发酵温度选 为40o【=.而温度为43o【=时,乳酸产量有较大减少,可 能是温度太高导致菌体提前进入衰老期所至. 2.3pH对发酵过程的影响 在乳酸发酵过程中随着乳酸的不断积累,会使发 酵液中的pH下降.pH的下降往往会影响菌体的生长 和产物的生成.Goncalves等【lI研究了pH在5-6.8之间 时对鼠李糖乳杆菌发酵乳酸的影响,发现pH对乳酸 发酵速率的影响比最大比生长速率对乳酸发酵速率的 影响大,所以在发酵时为得到较高产量需要调控发酵 液的pH.分别采用pH6.8…635.8,5.3对发酵乳酸的 影响进行研究,结果见图3. 要 弯 发酵时I司/Il Fermentationtime/h 图3对发酵过程的影响 Fig.3EffectofpHonlacticacidproduction 如图3所示,当发酵培养基中的pH为6.3时,乳 酸产量最高.而当pH高于5.8时乳酸的产量差别不 大,这表明耐糖乳杆菌适合pH范围相对较宽.值得注 意的是,当pH为5.3时耐糖乳杆菌GS2发酵生产的乳 酸产量有较大下降.这可能是由于pH低于5.5以下, 乳酸以解离和非解离两种状态存在,非解离的乳酸分 子可通过细胞膜使细胞内部乳酸浓度增加,从而降低 了与代谢相关的酶活性,抑制了菌体生长和产酸. 2.4中和剂对发酵过程的影响 传统乳酸发酵过程中采用CaCO作为中和剂,以维 持最适pH值.但是乳酸钙结晶细小,结晶过程不易控 制,30%乳酸钙残留在结晶母液中,不能结晶出来,大量 的副产物膏浍造成环境污染.因此,现在的乳酸发酵 研究大都倾向采用NaOH或NH40H作为中和剂,见图4. 毫 糖 耀 发酵时间/Il Fermentationtime/h 图4中和剂氨水(A)和氢氧化钠(B)对发酵过程的影响 Fig.4EffectofNI-LOH(A)andNaOH(B)onlacticacid fermentation 【1),pIg00日rI )/辞 (1%g.笛,,咖划 加84O (r,%.%rI 科学研究究与拜麓2007.VoL28.No.11 从图4可以看出,用氨水作中和剂调节pH无论 是在菌体生长,生产L一乳酸还是消耗葡萄糖方面均比 NaOH效果好.加入前者菌体干重比后者高59.7%,这 可能是由于NH4+部分被菌体作为氮源利用,促进其快 速增长,而Na+的积累对菌体生长有一定的抑制作用. 同时,加入NHOH作为来中和剂乳酸的产量是NaOH 的1.6倍,这个差别可能是由于NaOH对乳杆菌乳酸 生产存在较大抑制作用,并且NaOH的浓度较大进入 罐中对接触的菌体有毒害作用.如果采用低浓度的 NaOH会使发酵液稀释效果加强,不利于后处理过程; 而采用NH4OH有利于用酯化法分离乳酸,因此本实验 采用NH4OH作中和剂. 2.5高糖条件下L_乳酸分批发酵 ~kerberg等【.习报道了在葡萄糖浓度为40药,L,82g,L 时底物抑制对L.1acticATCC19435产酸的重要影响.由 于高葡萄糖浓度能带来高的乳酸终浓度从而减少了乳 酸的浓缩工作,近年来也出现了关于在初始糖浓度 200g/L以上时乳酸生产的研究.Goncalves等【-狮0用. delbrueckii分批发酵70h,80h,从200g/L葡萄糖中生 产了140g/L乳酸.白冬梅等?分批发酵217g/L葡萄 糖,发酵时间174h,L_乳酸产量为210g/L.如图5所示 ,本文采用的耐糖乳杆菌GS2在发酵罐中初始葡萄糖 浓度为200g/L时,扣除了种子液中和玉米浆中的乳酸 含量,发酵90h,得到乳酸的产量182.8g/L,转化率为 91.4%,产酸速率为2.03g/(h?L).高的转化率和产酸 速率有利于充分利用底物和缩短生产时间,提高L一乳 酸发酵的经济性.可见,在本研究中高浓度葡萄糖对乳 酸生产的底物抑制在最大程度上被解除了,通过各发 酵条件的优化,耐糖鼠李糖乳杆菌表现出优良的产酸 特性. 耀 时间/}I Time/h 墨 j 图5高糖条件下L一乳酸发酵性能曲线 Fig.5Batchfermentationoflacticacidinhighglucose concentration 3结论 以耐糖鼠李糖乳杆菌在高浓度葡萄糖条件下进行 87====-1 分批发酵,获得了满意的结果.实验优化了发酵条件: 接种量15%,发酵温度40?,pH6.3,中和剂为氨水. 在16L罐中初始葡萄糖浓度为200g/L时,分批发酵 90h,L一乳酸浓度达到182.8g/L,转化率为91.4%,产 酸速率为2.03g/(h?L1. 参考文献: [1】佟明友,方向晨,刘树臣,等.L一乳酸和聚乳酸的研究进展叨.石油 化工,2003,32:724—728 [2】JehannoD,ThuaultD,BourgeoisCM.Developmentofamethodfor detectionoflacticacidbacteriaproducingexclusivelytheL-(+)-i- someroflacticacid[J1.ApplEnvironMicrob.,1992,58:4064-4067 [3】NiiuN,RoychoudhuryPI(,SrivastavaA.L-lacticacidfermentation anditsproductpolymerizati0n[J】.ElectronicJoumalofBiotechnolo- gY,2004,8:167-179 [4】PeinY,MaokinishinaYO.EnhenceproductionofL-lacticacid fromcorllstarchinacultureofRh&op~o0eusinganair-lift Bioreactor[J】.JFermentBioeng.,1997,84:249-253 [5】OharaI-I.Biorefinery【ApplMicrobiolBiotechnok,2003,62:474-477 [6】SieboldM,vonFrielingP,JoppienR,eta1.Comparisonoftheproduc- tionoflacticacidbythreedifferentLactobaciUianditsroeoveryby extractionandelectrodialysis[J].ProcessBiochem,1995,30:81-95 [7】ZayedG,ZahranAS.Lacticacidproductionfromsaltwheyusing freeandagarimmobilizedcells[J】_LettApplMicrobiol,1991,12: 241—243 [8】MelzochK,VotrubaJ,HabovaV,eta1.Lacticacidproductionina cellretentioncontinuouscultureusinglignocellulosichydrolysateas asubstrate叨.JBiotechnol,1997,56:25-31 [9】SunhoonK,LeeP-C,LeeE-G.,eta1.Productionoflacticacidby LactobaciUusrhemnosuswithvitamin-supplementedsoybeanhy— drolysate[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2000,26:209-215 [10】SenthuranA,SenthuranV,MattiassonB,eta1.Lacticacidfermenta— tioninarecyclebatchreactorusingimmobilizedLactobaciUuscasei 【J].BiotechnolBioeng.,1997,55:841—853 [11】GoncalvesLMD,RamosA,AlmeidaJS,eta1.Elucidationofthe mechanismoflacticacidgrowthinhibitionandproductioninbatch culturesofLactobaciUusrhalnn,o$11~叨.ApplMicrobiolBiotechnol, 350 1997,48:346— [12】AkerbeC,HofvendahlK,ZacchiG,eta1.Modelingtheinfluence ofpH,temperature,glucose,andlacticacidconcentrationsonthe kineticsoflacticacidproductionbyLactococcuslactisssp.fac ATCC19435inwhole-wheatflour叨.ApplMicrobiolBiotechno1., 1998,49:682-690 [13】GoncalvesLMD,XavierANRB,AlmeidaJS,eta1.Concomitant substrateandproductinhibitionkineticsinl~ticacidproduction[J]. 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