磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究

磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究 磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研 究 .==J77D 2012年3月 第33卷第3期 食品研究与开发 FoodResearchAndDevelopment生物工程 磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究 王尧,刘逸寒,李玉,刘晓光,王建玲,路福平 (工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津科技大学生物工程学院,天津300457) 摘要:研究重组磷脂酰丝氨酸合成酶达条件及其用于酶法合成磷脂酰丝氨酸的反应条件.结果表明,在50mL培 养基中,菌体浓度为OD~o=0.6时,用O.5mmol/L的IPTG,在温度为2O?,转速为120r/min的条件下,诱导12h后,重 组磷脂酰丝氨酸合成酶活力可达1.33U/mL.是优化前的1.66倍.酶法转化磷脂酰丝氨酸的最适温度为38?,最适 DH为8.0,最适离子是12mmol/LMn2+,最适表面活性剂是1.0%TritionX一100.在最适条件下,磷脂酰丝氨酸转化率 可达33.15%. 关键词:磷脂酰丝氨酸合成酶;发酵条件;反应条件;优化 StudyonFermentationConditionsandReactionConditionsofPhonphafidylserineSynthas e WANGYao,LIUYi—han,LIYu,LIUXiao-guang,WANGJian-ling,LUFu-ping (KeyLaboratoryofIndustrialFermentationMicrobiology,MinistryofEducation,National EngineeringLaboratoryfor IndustrialEnzymes,CollegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScience&Techno logy,Tianjin300457,China) Abstract:Studyontheoptimizationofexpressionofrecombinantph0sphatidylserinesyntha seanditsreaction conditions.Theresultshowedphosphatidylserinesynthaseactivitywas1.33U/mLwhenthe cellconcentrationof OD600was0.6in50mLmediuminductedby0.5mmol/LIPTGandfermented12hunder20oCand120r/min. Thisactivitywas1.66timesbiggerthanpre-optimized.Theoptimumreactionconditionswer e38?.pH8.0. 12mmol/LMn2+and1.0%TritionX一 100.Theconversionratewas33.15%undertheoptimumconditions. Keywords:phosphatidy1seIinesynthase;fermentationconditions;reactionconditions;opt imization 磷脂酰丝氨酸(Ph0sphatidy1serine,PS)是细胞膜 磷脂的一类,自从1942年被发现以来,就以重要的生 理功能吸引着学者的关注.作为大脑中主要的酸性磷 脂,Ps对改善老年痴呆症,提高大脑认知力,舒缓紧张 压抑情绪,抗抑郁均有很好效果.Ps作为一种功能 性因子被广泛应用于食品领域,日本,美国和欧洲各国 相继开发了含有Ps的功能性糖果,奶制品和保健品, 这些食品可以带来抗衰老,抗疲劳等多种健康益处. Ps的传统生产方法是用有机溶剂从豆类或是牛 基金项目:国家自然科学基金面上项目(21076159) 作者简介:王尧(1985一),男(汉),硕士在读研究生,研究方向:微生 物与生化药学. 通信作者 ????????? 脑中进行提取,有机溶剂的大量使用和疯牛病的暴发 对食品安全性造成隐患嘲.因此,研究重点开始转向利 用微生物发酵生产Ps.本试验对前期已经构建的高效 表达磷脂酰丝氨酸合成酶(Phosphatidylserinesynthase, PSS)的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22-pss的摇瓶发 酵工艺进行研究,同时也研究了酶法转化Ps的基本 条件,旨在为进一步提高Ps的生物合成量提供参考, 促进PS在我国食品领域中的应用. 1材料与方法 1.1试验材料与试剂 菌种:EscherichiacoliBL21(DE3)/pET22b-pss,为 表达PSS的基因工程菌株,由天津科技大学工业发酵 ?…???…?????????,??????? [3]肖建辉,将依辉,梁宗琪,等.食药用真菌多糖研究进展[JJ.生命的(3):9—10 化学,2002,22(2):148—151 f4]刘建华,张志军.灵芝多糖提取与应用现状fJJ.保鲜与加工,2003,3 ????? 收稿日期:2011—07—11 生物工程王尧,等:磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究 微生物教育部重点实验室构建保藏. 培养基:LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L, 氯化钠10s/L,pH7.2). 胆碱氧化酶,过氧化物酶,磷脂酰丝氨酸:Sigma 公司;色谱纯乙腈,色谱纯甲醇;卵磷脂,丝氨酸,苯酚, 4一氨基安替比林,磷酸,氯仿等试剂均勾国产分析纯. 1.2仪器与设备 ZHWY211B控温摇床:上海志诚设备厂;TU一1810 型紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公 司;高速冷冻离心机GL20A:日本日立有限公司; SHA—B水浴恒温振荡器:江苏国华仪:器厂;安捷伦高 效液相色谱:安捷伦科技有限公司. 1.3培养方法 1.3.1菌种活化 从一70?保存的甘油冻存管中挑取一环菌液,在 含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中划线,37? 培养过夜.挑取一环单菌落接种于含有氨苄青霉素抗 性的5mLLB液体培养基中培养过夜,:进行菌种活化. 1.3.2发酵培养 重组大肠杆菌经活化后,按1%接种量接种于装有 50mLLB培养基的250mL三角瓶中,37?,180r/min 振荡培养至菌体浓度为OD~o=0.4.优化试验初始诱 导条件为:菌体浓度达到OD~0=0.4时,加入终浓度为 1.0mmo1]L的IPTG,于25oC,140r/min条件下诱导12h. 诱导结束后离心收集菌体,取菌体破碎液测定酶活. 发酵条件优化根据试验结果逐次改变试验条件. 1.4PS的酶法转化 菌体诱导后经离心收集菌体,用溶菌酶处理30min 后用于PS的转化.转化反应初始条件的总体系为 2mL:500g蛋白,1.0%卵磷脂和丝氨酸,50%氯仿, 0.5%TritonX-lO0,10mmol/LMnC12,125mmoLTris— mleat(pH7.0),在30?下进行4h,然后取样检测,计 算Ps转化率.根据试验结果逐次调整反应条件. 1.5检测方法 酶活测定:胆碱显色法砑;蛋白含量测定:改良的 Bradford法川;菌体量测定:比浊法嘲.PS测定:在文献基 础上将柱子改为phenomenexLunaNH2,具体条件为: 流动相:乙腈:甲醇:85%磷酸=100:3:1;紫外检测波长: 205nm;柱温:25oC;流速:1mlJmin;进样量:15ILL. 2结果 2.1发酵条件优化 2.1.1诱导时菌体浓度对发酵产酶的影响 诱导时菌体浓度对产酶水平具有明显的影响.一 呈 婕 溢 171==一 菌体浓度OD 图1菌体浓度对产酶的影响 Fig.1EffectofcellconcentrationontheyieldofPSS 般选择在对数生长期的中,后期进行诱导可以获得较 高的产酶水平.结果如图1所示,在OD=0.4时进行诱 导并不能得到最优结果,由于此时菌体浓度较低,加入 诱导剂会过早的抑制菌体生长,减少菌体量,影响产酶 水平.在OD~o=0.6时,达到最高的产酶水平0.93U/mL. 随着菌液浊度的增加,产酶水平不断下降. 2.1.2诱导剂量对发酵产酶的影响 在菌体浓度达到OD~oo=0.6时进行诱导,对诱导剂 量进行优化,结果如图2所示. 3 翅 龌 IPTG浓度,(mmol/L) 图2诱导剂量对产酶的影响 Fig.2EffectofdosageofIPTGontheyieldofPSS 从图2中可以看出,在0.1mmo]/L,0.5mmo]/L范 围内,蛋白表达水平随着IPTG用量的增加而升高.在 IPTG浓度为0.5mmol/L时,表达水平达到最大值为 1.14U/mL,之后表达水平随着IPTG用量的增加而下 降.在初始条件中所用诱导剂浓度严重的抑制了产酶 水平,主要是因为IPTG作为一种非代谢的诱导物,在 菌体内积累的浓度过高就会对菌体产生毒害作用,抑 制菌体生长,进而降低蛋白的表达水平. 2.1_3诱导温度对发酵产酶的影响 重组菌体在诱导状态时,在较高的诱导温度下蛋 白合成的速度过快容易形成包涵体,调整诱导温度,有 利于目的蛋白的表达.在以上试验结果条件下对诱导 温度进行优化,结果由图3可知,温度为20?时酶活 -==72王尧,等:磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究生物工程 诱导温度/? 图3诱导温度对产酶的影响 Fig.3EffectoftemperatureontheyieldofPSS 力达到最高1.23U/mL.35?虽然接近大肠杆菌最适 的生长温度,但在该温度下酶活明显降低. 2.1.4诱导转速对发酵产酶的影响 转速影响发酵液中的溶氧量,适宜的转速可以促 进菌体生长,有利于蛋白的表达.由图4可知,转速为 120r/min时酶活最高为1.33U/mL. 0l00l2Ul4Ul6U 转速/(r/min) 图4诱导转速对产酶的影响 Fig.4EffectofspeedontheyieldofPSS 2.1.5装液量对发酵产酶的影响 装液量直接影响着发酵体系中的供氧能力,进而 影响菌体生长状态和蛋白表达水平.由图5结果可知, 在250mL摇瓶中,装液量在30mL,50mL之间时,酶 活逐渐提高,在50mL时达到最大值1.33U/mL.此 后,随着装液量的增加,发酵系统中的供氧能力开始 下降,产酶水平随之降低. 吕 炮 窿 3O507090l10 装液量/mL 图5装液量对产酶的影响 Fig.5EffectofvolumeofmediumOiltheyieldofPSS 2.1.6诱导时间对发酵产酶的影响 菌体在表达蛋白时会消耗大量能量,使菌体提前 进人衰亡期,发生溶菌和表达的蛋白被降解等现象,因 此,控制诱导表达的时间尤为重要.由图6结果可知, 在12h内,随着诱导时间的延长,蛋白的表达量不断增 加,在8h后增加幅度趋于平缓,酶活力为1.30U/mL.在 实际操作中,为缩短发酵时间,可选择诱导时间为8h. 暑 言 蛭 韶 4681012 诱导时间/h 闰6诱导时间对产酶的影响 Fig.6EffectofinducementtimeOiltheyieldofPSS 通过对重组菌株BL21(DE3)/pET22-pss发酵产酶 条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:在50mL培养 基/250mL摇瓶中,当菌体浓度为OD~=0.6时,用终浓 度为0.5mmol/LIPTG,在20?和120r/min条件下,诱 导12h后磷脂酰丝氨酸合成酶活力可稳定在1.33U/mL, 是优化前的1.66倍. 2.2反应条件对Ps转化的影响 2.2.1PS检测方法的建立 Ps标准品的高效液相色谱图,试验样品的高效液 相色谱图,见图7,图8. 磊 薹,萎萋 02468l01214 时间/rain 图7PS标准品的高效液相色谱图 Fig.7DetectionofPSbyHPLC 在所用色谱条件下,在1.686rain处出现了氯仿的 溶剂峰,而Ps标准品的出峰时间约为7.176rain,其余 小峰为杂质所产.试验样品在1.55lmin,2.201rain处伴 随溶剂峰的出现,出现了多个杂质峰,但在7.100rain处 同样检测到一小峰,表明样品中成功转化获得Ps. 321O987654 4208642O 1l1OO0OO lll?00OO 一_I【IJ/\蜒避 OO0OO0???如 22l1 {\怄磐 420864 1l】O00 生物工程王尧,等:磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究 0 { 植 鹫 时间/rain 图8试验样品的高效液相色谱图 Fig.8DetectionofsamplebyHPLC 2.2.2反应温度和pH对转化率的影响 在3O?,pH=7.0,10mmol/LMn和1.0%Trition X一100的初始反应条件下,以5?为温度梯度,在25? 至45~C范围内研究了反应温度对Ps转化率的影响, 结果如图9所示. 蒋 辩 反应温度/qc 图9反应温度对转化率的影响 Fig.9EffectoftemperatureontheconversionrateofPS 在反应温度为40?时,有最高的转化率,可达 20.40%.这一最适温度与目前已知的:托多数PSS的最 适温度相近.在反应温度40?,10mmol/LMn和1.0% Tritionx一100条件下,以0.5为pH值梯度,在pH6.5 至8.5范围内研究了反应pH对Ps转化率的影响,结 果如图10所示,pH8.0是反应最适的pH,转化率可 达26.17%,在酸性和强碱性条件下,转化率较低. o 蜱15 lO 5 6.57.O7.58.O8.5 反应体系pH 图1O反应pH对转化率的影响 Fig.10EffectofpHvalueontheconversi0nrateofPS i73==I 2.2.3离子和表面活性剂对转化率的影响 目前已经清楚大多数微生物来源的PSS专一依赖 Mn舢.对于某些PSS,如产气荚膜梭菌的PSS可以在高 浓度的Mg2+条件下保持较低活性. 3O 25 20 15 lO 5 30 25 20 l5 10 5 05l0152O 反应体系中Mn+浓度/(ramoI/L) 图IIMn"浓度对转化率的影响 Fig.11EffectofconcentrationofMn 一 00.51.01.5 反应体系中TritionX一100浓度/% 图12YritionX一100浓度对转化率的影响 Fig.12EffectofconcentrationofTritionX-IO0 在40c【=,pH=8.0和1.0%TritionX一100的条件下, 本试验结果发现,Mn+是最适的离子,当其浓度为10 mmo]/L时,转化率达到最高为26.17%.ca舢,Mg都不 能替代Mn2+进行有效的Ps转化.在以上试验结果的基 础上研究了表明'浯陛剂对转化率的影响,结果表明1.0 %的Tritionx一100是最适的表面活性剂,转化率达到 29.87%.当使用离子型表面'浯j生剂SDS代替TritionX一 100时几乎检测:不到PS,说明SDS对转化反应有强烈 的抑制作用. 2.2.4最适反应条件的确定 本试验在单因素实验基础上,以温度,pH,Mn:+浓 度,Tition—X100浓度为因素,每个因素取3个水平,进 行L9(Y)t交试验设计,具体因素水平见表1,反应条 —===174王尧,等:磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究生物工程 件正交试验表,见表2. 表1反应条件正交试验因素水平表 Table1Factorsandlevelsarrayoforthogonalexperimentof reactionconditions 表1-2反应条件正交试验表 Table2Orthogonalexperimentofreactionconditions 根据表1和表1进行9组试验,得出转化率最优 水平组合为:ABc,D,即反应条件为:温度38?, pH8.0,Mn2馓度12mmol/L,TitionX一1001.0%.进一步 通过摇瓶发酵试验进行验证,结果表明转化率达到 33.15%,高于正交试验中出现的所有结果. 3结论 研究基因工程菌最优发酵条件的目的是使外源 基因实现高效表达,以获得大量的外源基因表达产物. PSS的表达量直接影响了Ps含量,其高水平表达不仅 涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且 与宿主所处的环境条件息息相关.通过对工程菌株产 磷脂酰丝氨酸合成酶的条件的优化,发现菌株产酶的 最佳培养条件:在50mL培养基,250mL药瓶中,诱导 时菌密度OD60.6,诱导剂IPTG终浓度为0.5mmobCL, 诱导时间为12h,诱导温度为20?,转速120r/rain.在 最佳啭涤件下,酶活可达133U/mL,是优化前的1.66倍. 在Ps的酶法转化反应中,最适反应条件是38?, pH8.0,12mmol/LMn2+和1.0%TritionX一100.在最适条 件下,磷脂酰丝氨酸转化率可达33.15%. 参考文献: [1】AmaduceiL.UseofphosphatidylserineinAlzheimer'Sdisease[J1. AnnNYAcadSci,1991,640:245—249 [2】BloklandA,HonigW,BrownsF.Cognitionenhancingpmpe~iesof subchronicphosphatidyIserinetreatmentinmiddle-agedrats: comparisonofbovinecodexPSwitheggPSandsoybeanPS[J]. 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