应用RAPD技术证实节节麦和光稃野燕麦的六倍体与八倍体杂种

应用RAPD技术证实节节麦和光稃野燕麦的六倍体与八倍体杂种 应用RAPD技术证实节节麦和光稃野燕麦 的六倍体与八倍体杂种 段,其中包括只在节节麦和杂种中出现的特异DNA片断,只在光稃野燕麦和杂种中出现的特异DNA 片断,以及同时出现在节节麦和光稃野燕麦的特异性DNA片段.第一种情况约占29,第二种情 钓占17,第三种情况约占5 美?诲RAPD技术添加系分子标记 眼制性片断长度多态性 (Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)租 随机扩增多态性的DNA(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD) 是用于检测 DNA序列多卷性的技术,郾为进行遗传标记的方法.RFLP是应用限制性内切酶将基因组 DNA内切成不同长度,然后用同位素标记的探针检测给定位点的长度多态性的同源性. RAPD~法是甩一个随意序列的10个寡聚核苷酸作为聚合酶链式反应(PolymoraseChai Reaction,PCR)的引物,扩增的多态性DNA片断,RAPD方法(Williamseta1.1990) 同于随意引物的 PCR(ArbitraryprimedPCR,AP-PCR)(WelshandMcClelland 1990),较之RFLP,是一种快速而简便的技术.目前巳广泛应用于遗传作图(Reiter,et 81.1992),外源染色体的检测(Qzias—Akinsetaj.1993),种属特异性及物种演化(Susan. EWllkie.1993)(IsmailDweikat.1993)的研究.在小赛中,用RAPD方法鉴定外源 DNA通过露加和替换进入小麦染色体中,或者外源DNA片断通过易位,重组等的基因渗 入.都巳得到证实(K.M.DevosandM.D.Gale1992). 节节麦t,我们称之为节燕八倍体,而从节燕八倍体中分离出的普通小麦型,其 染色体数目为6n=6×7=42,它的外形也有很大的改变,同普通小麦类似,我们称它为节蒸 六倍体,这次将它们一起进$~RAPD分析,目的是证实它们的真实性,这对以后的研究和应 用都会有报大的帮助. 收穗日翔1.-州_船 1995年第4期 1实验与方法 1.1材料 节节麦(Aeg/~opstau*chii(Cross.)Sch.2n=2×=14)1987年引自山西小麦研究所. 光稃野燕麦(A~er离心管中,加入2/3体积的异丙醇,捞出DNA,用70%的酒精洗两次,干燥后,溶解于 TE中,再JJg~,RNA酶,使其最终浓度选到1Omg/ml,在室温中放置20rain.用已知浓度的 NA与提取的DNA进行电泳,使用0.8%琼酪糖,EB染色后在紫外灯下比较出DNA的浓度 大小. i.3RAPD分析.. 反应条件是在Williams等《1990)的基础上,稍微修改而成反应总体积为25l,其中 包括20ug的DNA,200nm的随机引物(Operon),100P~m的4种dNTP(Promga>, 1.25U的TAG聚合酶(遗传所),l×的反应缓冲液(10raMTris—Hcl,pH8.3,50ramKCI,一 15mMMgC1),每个反应管加上30~tl的石蜡油,PCR反应在PE-480热循环仪(美国)上完 成.开始5个循环为97.Clmiu,3.Clm!u,72.C2rain.接下来进行40个循环:94.Cr1min, 38.C1min,72.C2min.最后在花.C保持10mi~.扩增产物在1.4%的琼酯 糖上电棘,电压 为7V/cm,电泳缓冲液为l×TBE,电泳后用EB染色20分钟,紫外灯观察并照相. 2实验结果及分析 基因组DNA的PCR反应,随机选用了A,B,H,F,N,M,V,O,Q,K等试剂盒 共72个引物进行扩增,大部分引物都能扩增出特异的DNA片段,多巷性的DNA片断的分子 量约为O.5,2Kb,其中有44个引物扩增的产物有多态性,经过多次(5次以上)重复,结果 重复性较好,实验结果与我们预计的相符,经过电泳观察可分为3种类型(1)亲本特异带 在杂交后代中同时出现,这样的引物有4个,约占5%,它’们是OPK09OPQ04,OPY01 OPN04,如图12所示,我们可以看到节节麦和光稃野燕麦特征带都能在节燕八倍体和节燕 六倍体中找到,(2)燕麦的特异性片断出现在杂交后代中,这样的引物有2个,约占1, 图中所示有4个;OPQ07,OPO15,OPN12,OPA18,我们可以看到光稃野燕麦的特征片 断出现在节燕八倍体和节燕六倍体,(3)节节麦的特异性片断出现在杂交后代中,这样的 引物有21个,约占29,如图1,2巾的引物OPK09,OPQ0aOPN04就扩增出现这样的片 段.从上我们可以得出这样的结论t节节麦燕麦和它们的杂交后代有着同源性,也就是说 我们基本上肯定节燕八倍体和节燕六倍体是节节麦和光稃野燕麦杂交的真实杂种. 贵州农业科学 另外,从图中我们还可以看到OPQ04,OPYoI,OPO15,OPN12,OPAl8 这些引物所 扩增的产物中,节燕八倍体和节燕六倍体的扩增相似,在图3中,我们还可以看到基本上完 全相同的扩增.这足可以证明:节燕六倍体和节燕八倍体具有同源性,虽然它们在外部形态 和染色体数目Echt等(1992)在研究二倍体苜藉的 RAPD遗传分离,也发现类似现象. 本次实验的男一个目的是调查RAPD~记作为一种工具在小麦杂交研究中的应甩,这个 过程相对来说是比较倚单的,并且多态性的饺谢也是具有可重复性和稳定性t相对于RLFP, RAPD~有的优点是随机日l物可以通过购买而得蓟,就不需要象RFLP那样为了扫描而克隆 和标记了. 现在,RPAD技术又被Southern杂交所补充,这种方法对于羁的扩增产物能比EB检测更 为灵敏,所以使甩Southern杂交分析可以得到更多的分子标记.RAPD技术被证明为确定基 因多态性的一种有效的方法,如果通过对RAPD产物定位,我们可以得到更多的关于DNA;~ 列的信息.另外更避—步的研还需考虑这样的同题t通过不同的步骤和不同的实验条件是 否能得到重复的实验绪果. 从上讨论中,我们可以想到,光稃野燕麦所具有的抗霸性,也许可以进行更深一步的研 究,对抗霸基因进行定位,最终分离抗府基因,将其直接导入品种中,这将极大地推动育种 』 工作进展. ?11? ?考文慧 1Ism~il~eikat.SallyM.MorrisL?HerbertO,eta1.TheorAppl(耙blq93(Bs)卅7一SOS 2K.M.DevosandM.D.o|lTheo:ApplC-clot1992(84)567~572 3Qd耶 Akin3BLubbersEL.HannaWW.vtaI.TheorApPlGenct.,L993(8S):623 4RelierRS.WilliamsJ,FoldmanK,eta1.pz’oc.Nat1.sci.USA-1992(89)147 ,lSTUDYONHYBRIDBETWEENAEGILOPSTAUSCHIlAND AVENAFATUABYUSINGRAPDMETHoD ZhangLiyiJiangLongZhangQingqin (Gffiizlm~AgriculturalCollege,G?#550025) TherandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPT)analysiswasusedforprovingthe tmtllofadditionlinebetweenAegilopstuuschiiandA伽dm”? wlth72randoat primers.Fortyofsevcnwtested删 mrsamplifiedthepolymorphicDNAinadditionline.The sKmer~Sultsw&sobtainedinmorefivereplications.Thesittmt~onwhichthepolymorphle DNAappearedinAegilopst?sch”andtheadditionlinewas29,thesecondstitv,afioa whichthepolymorphicDNAappearedinAvane如批 andtheadditionllncwfts17%,the thirdsituationwhichthepolymorphlcDNAappearedinAegflopstauckii,ArenaIatuaand theadditionlinesimulraucous]ywas5%.SothismethodWaSusefultoprovet he productionofwheat/ationchromjomadditionandsubstitutionline. 哪W咖S:RAPD;addltiommolec~larmarker 更正: 《贵州衷业科学》1995年第3期《光音截肥应用于本稻生产的肥效试验初报》—文的内容. 1.p471.2.2条第2行第1字鬻掉’理’. 2.p4S2.1条倒强第2行聊圭第2享磕改为’增’. 3.P482.2条第4行I1.7,s.4及0~3.9g’改为’0,3.9g厦1.7,s.4H’ [标签:快照]