【doc】膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义的研究

【doc】膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义的研究 膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7 的表达及其临床意义的研究 四川肿瘤防治2006年第19卷第1期5 膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的 表达及其临床意义的研究 廖洪,唐国民,张荣荣,江琪琪 (i.四川省肿瘤医院泌尿外科,四川成都610041;2.四川大学华西医学中心,四JIf成都610041) [摘要]目的:探讨膀胱移行细胞癌(BTCC)患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义.:采用逆 转录聚合酶链反应(RT-PeR)检测42例BTCC患者,40例对照者尿脱落细胞中MUC7的mRNA表达,B.aetin作为 内参照.结果:40例对照组中有2例MUC7mRNA表达阳性,阳性率为5.O%;42例BTCC患者中36例尿脱落细 胞中MUC7mRNA表达阳性,阳性率为85.7%,其诊断特异性为95%.不同临床分期尿脱落细胞中MUC7mRNA 的阳性表达率:Ta.T1期为64.3%(9/14).T2.4期为96.4%(27/28).浸润性BTCCMUC7的阳性表达率显着高于浅 表性BTCC(P<0.05).不同病理分级BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的mRNA的阳性表达率为G158.3%(7/ 12),G293.8%(15/16),G3100%(14/14).MUC7mRNA的表达与BTCC的病理分级呈正相关.MUC7诊断BTCC 的阳性预测值为94.7%,阴性预测值为86.3%.结论:BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的阳性表达率明显高于对 照组.尿脱落细胞中MUC7表达与临床分期,病理分级呈正相关.采用RT.PCR法检测尿脱落细胞中MUC7表达 诊断BTCC的敏感性和特异性好,阳性预测值高,特别对T2.4期肿瘤的诊断敏感性 好. [关键词]膀胱肿瘤;MUC7;逆转录聚合酶链反应;尿脱落细胞 [中图分类号]R737.14[文献标识码]A[文章编号]1007—0281(2006)O1—0005一o4 MUC7ExpressioninCast--offCellsinUrineofPatientswithBladderCancer LIAOHong.TANGGuo.min,ZHANGRong.rong,ctal (1.TheUrologyDepartmentofSichuanCancerHospital.Chengdu610041,China;2.TheWestChinaMedicalCen— terofSichuanUniversity,Chengdu610041,China) [Abstract]Objective:TostudythesignificanceofMue7expressionincast— offcellsintheurineofpatientswithbladder transitimalcellcarcinoma(BTCC).Methods:42patientswithBTCCwerecoUectedinstudygroupand40patientswithoutBTCC (2Owithurinarycancersotherthanbladdercai~cer,10withnonneoplasticuninarydiseases,10healthyvolunteers)incontrdgroup. RT— PCRmethodwasusedtodetectMuc7mRNAexpressionand13-aetinasintemalpositivecontrolinallcases.Results:Only2of 40(5%)casesshowedpositiveexpressionofMuc7mRNAincontrolgroup.36of42(85.7%)casesshowedpositivityinstudygroup- ThesensitivityandspecificityofMuc7examinationfordiagnosisofBTCCwere85.7%and95%respectively.Accordingtodifferent clinicalstaging(Ta-T1.T2.4),thepositiveexpressionratsofMuc7mRNAwere54.3%(9/14)and96.4%(27/28)respectively. TheexpressionofMuc7hadapositivecorrelationwiththeclinicalstagingofBTCC.AsforthepathologicalgradeofBTCC,thepositive expressionratesofMuc7mRNAwere58.3%inG1.93.8%inG2,100%inG3respectively.ThemRNAexpressionofMuc7was positivelycorrelatedwiththepathologicgradeofBTCC.ThepositiveandnegativepredictivevaluesfordiagnosisofBTCCwere94.7% and86.3%respectively.Conclusions:1.ThepositiveexpressionrateofMuc7incast.offcellsi nurineofpatientswithBTCCis 85.7%,whichissignificantlyhigherthanthatincontrolgroup(P<0.05);2.ExpressionofM uc7ispositvielycorrelatedwiththe stagingandgradingofBTCC;3.DetectingMuc7expressionwithRT-PCRmethodfordiagno sisofBTCCisamethodwithhighsensitivi? ty,specificityandpositivepredictivevalue. [Keywords]BladderTransitionalCellCarcinoma;MUC7;ReverseTranscriptasepolymera seChainReaction;Cast-offCellsin Unine [收稿日期】2005,l0—17;[修回日期]2005一l1—25 [作者简介]廖洪(1971一).男.四川阆中人,临床医学 硕士,主治医师,主要从事泌尿系统肿瘤研治工作. 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,90%以 上为移行细胞癌(BladderTransitionalCellCarcino. ma,BTCC).80%以上的BTCC为无浸润的浅表性 6廖洪等.膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的袁达及其临床意义的研究 肿瘤,初次治疗后复发率约为50%一70%,多数于1 年内复发,且约有15%一25%的病例复发肿瘤的恶 性程度呈上升趋势….因此,早期诊断BTCC和术 后的随访尤为重要.目前,膀胱镜检加病理活检是 确诊BTCC的金标准.由于膀胱镜检查具有创伤 性,且有增加尿路感染的机会,因此病人的接受程度 受到影响.而无创伤性的尿脱落细胞学检查对于分 化中等和良好的BTCC敏感性差,除受到医生主观 性的影响外,诊断准确性还受到诸如标本采集,方法 处理是否得当以及是否伴有泌尿系炎症等因素的干 扰和影响"J. 本研究拟通过检测BTCC患者尿脱落细胞中 MUC7的表达,并与健康志愿者,非膀胱泌尿系肿瘤 患者以及泌尿系非肿瘤性疾病患者的表达率相比 较,探讨MUC7作为BTCC肿瘤标志物的特异性和 敏感性,并观察其与不同临床分期和病理分级 BTCC间的关系. (2)Human13-aetin184bp Pl:5'一CAACTCCATCATGAAGTGTGAC-3'22bp P2:5'一CCACACGGAGTACTFGCGCTC~'21bp 1.2.3常用试剂和低耗品由四川大学人类疾病 生物治疗国家重点实验室提供. 1.3实验方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR),检测42例 BTCC患者,20例非膀胱的泌尿系肿瘤患者,10例泌 尿系非肿瘤性疾病患者以及1O例健康志愿者.150ml ~ 200ram晨尿中脱落细胞的MUC7mRNA表达. PCR反应阴性对照以灭菌ddH20代替PCR反 应的cDNA,每个尿脱落细胞标本均使用B.ac. tin作为PCR反应内参标准. 1.4统计学处理 应用SPSS12.0统计软件包,根据样本例数进 行四格表检验,四格表确切概率法或行x列表 检验,P<0.05为有统计学意义. 1材料和方法2结果 1.1临床资料 1.1.1实验组收集2003年l2月至2004年12 月期间四川大学华西医院和四川省肿瘤医院泌尿外 科BTCC患者42例,均经手术和病理石蜡切片证实 诊断.其中男性34例,女性8例,年龄23岁,82 岁,平均51.5岁.按UICC(国际抗癌协会)TNM分 期标准Ta—T1,T2,T3和T4期分别为l4例,14例, 12例和2例;按WHO病理分级标准G1,G2,G3分 别为l2例,16例,l4例. 1.1.2对照组对照组共计4o例,其中(1)2o例非 膀胱的泌尿系肿瘤患者一肾癌6例,肾上腺肿瘤4例, 前列腺癌4例,睾丸肿瘤6例;(2)10例非肿瘤的泌尿 系疾病患者一尿路结石3例,前列腺增生症5例,肾囊 肿2例;(3)10例健康志愿者.所有患者中男性27例, 女性13例,年龄23岁,8o岁,平均59.1岁. 1.2主要实验试剂 1.2.1主要试剂包括细胞总RNA提取试剂盒 Trizol(1nvitmgenU.S.A),逆转录试剂盒(TaKaRa), TaqDNA聚合酶(TaKaRa),X174.HincIIDNA Marker(TaKaRa),DEPC(Sigma). 1.2.2引物由上海博亚生物工程技术服务有限 公司合成. (1)Mucin7237bp P1:5'一CACAGAAGGCATCATCAC一3'18bp P2:5'-GGr兀'GTAGCCACTAAGGTA-3'19bp 2.1PCR产物检测 尿脱落细胞PCR产物:凝胶电泳的结果,MUC7 可见在237bp,13-actin在184bp处出现清晰的条带, 与阳性对照条带完全一致,阴性标本则无此条带. 2.2尿脱落细胞中MUC7mRNA表达 42例BTCC患者及4O例对照组尿脱落细胞中 MUC7的表达情况见表1.36例BTCC患者尿脱落 细胞MUC7mRNA里阳性表达,阳性率为85.7%. 20例非膀胱的泌尿系肿瘤患者和lO例健康志愿者 尿脱落细胞MUC7均阴性表达,1O例泌尿系非肿瘤 疾病患者中有2例血尿患者尿脱落细胞中MUC7呈 阳性表达,阳性率为5.0%.BTCC组与对照组 MUC7mRNA阳性率比较具有统计学差异(P< 0.01). 表lBTCC和对照组尿脱落细胞MUC7表达 2.3尿脱落细胞MUc7表达诊断BTCC的效能指标 检测尿脱落细胞中MUC7的表达诊断BTCC的 敏感性为85.7%,诊断特异性为95%,见表l. MUC7诊断BTCC的阳性预测值为94.7%,阴 性预测值为86.3%. 2.4尿脱落细胞中MUC7的阳性表达率与BTCC 临床分期的关系 四川肿瘤防治2006年第19卷第1期7 42例BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的阳性 表达率与肿瘤临床分期的关系见表2.按临床分期 尿脱落细胞MUC7的阳性表达率在Ta-T1期为 64.3%(9/14),在T2.4期为96.4%(27/28). 表242例BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的 阳性表达率与临床分期的关系 十P<U.O5 浸润性BTCC中MUC7的阳性表达率显着高于 浅表性BTCC(P<0.05). 2.5尿脱落细胞中MUC7的阳性表达率与BTCC 病理分级的关系 42例BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的阳性 表达率与病理分级的关系见表3.按病理分级尿脱 落细胞中MUC7的阳性表达率为Gl58.3%(7/ 12),G293.8%(15/16),G3100%(14/14).MUC7 mRNA的阳性表达与BTCC病理分级呈正相关. 表342例BTCC患者尿脱落细胞中 MUC7表达率与病理分级的关系 十P<0.05 3讨论 膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一, 90%以上为移行细胞癌,对BTCC的早期诊断尤为 重要.目前,诊断和随访膀胱癌的金标准是膀胱镜 检查加病理活检,但膀胱镜检查有创伤性,有增加尿 路感染的机会,且不易发现早期病变,对预测复发也 没有指导意义.因此,从尿中检测能早期诊断 BTCC的肿瘤标志物一直是人们努力的目标之一. 为了探索一种既敏感又特异的BTCC肿瘤标志物, 学者们作了大量的研究工作,目前比较常用的标志 物有NMP22,BTA,端粒酶,CK20等,其中NMP22已 被美国FDA批准用于临床. 粘蛋白(Mucins,MUC)是一类分子量>200000 的由上皮细胞特异性分泌的糖蛋白.早期研究显 示,Mucins对泌尿系具有润滑和保护作用,并可作 为选择性的上皮屏障结构J.近年来多项研究显 示:MUC的表达增高及异常糖基化都与肿瘤的侵袭 力,转移力有关.目前,MUC可从血清学,组织学, 分子生物学等方面用于对BTCC的诊断L6J,主要包 括:(1)作为BTCC早期诊断的辅助性参考指标; (2)用于监测BTCC术后复发和判断疗效;(3)用于 预测BTCC患者的预后发展方向.国内尚无相关报 道. 3.1尿脱落细胞MUC7表达在BTCC诊断中的意义 肿瘤标志物是在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤 细胞合成,释放,或由宿主对癌肿反应而产生的一类 物质.其可在细胞,组织或体液中出现,并可通过化 学,免疫,分子生物学技术进行定性或定量检测,以 此作为筛查或诊断肿瘤的标志.Hubenj认为临床 上理想的BTCC标记物应该具有以下特征:?在肿 瘤组织,血和尿中存在并且其含量逐渐减少;?不仅 能预示肿瘤的存在,而且能够预示肿瘤的生物学特 性;?标记物的水平同疾病的严重程度相一致;?对 相应的检测方法具有高度的敏感性和特异性;?标 本收集,保存和处理方法简单实用,获取结果迅速, 检测成本不高等. 目前比较常用的膀胱肿瘤标志物中的NMP22 已被美国FDA批准用于临床.但这些标志物均存 在敏感性和特异性不一致的缺点,且对鉴别浸润性 ,本课通过 或浅表性膀胱肿瘤无指导意义.因此 检测MUC7在BTCC和对照组中的表达情况,评价 MUC7在诊断BTCC方面的优越性. 本项研究应用RT-PCR方法检测BTCC患者尿 脱落细胞中MUC7的表达.结果显示:42例BTCC 患者尿脱落细胞中MUC7的阳性表达率为85.7% (36/42);而在包括正常健康志愿者,非BTCC泌尿 性肿瘤和泌尿系非肿瘤性疾病的4O例对照组中仅 有2例MUC7表达阳性,在对照组中的阳性表达率 为5%.MUC7诊断BTCC的敏感性为85.7%,特异 性为95%,阳性预测值为94.7%,阴性预测值为 86.3%. 综上所述,我们认为MUC7用于诊断膀胱肿瘤 具有很高的敏感性和特异性,而在健康对照者中 MUC7均无表达. 3.2尿脱落细胞中MUC7的表达与BTCC病理分 级,临床分期的关系 BTCC患者的预后取决于肿瘤病理及病人本身 的免疫能力,其中以细胞分化程度和肿瘤浸润深度 尤为重要.临床上对浸润性或浅表性膀胱癌的治疗 方案各不相同,预后差别也大.浸润性膀胱癌一般 8廖洪等.膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义的研究 采用膀胱部分切除或膀胱全切,浅表性膀胱癌则采 用TURBt加膀胱灌注治疗.因此,术前对膀胱癌的 类型进行判别,对于选择治疗方式和估计预后具有 重要意义.现有多项研究采用RT—PCR检测尿脱落 细胞中CK20的表达,对予诊断膀胱癌有较高的敏 感性,但特异性较低,特别是在不同的肿瘤分期,分 级方面CK20的表达差别无显着性J.据Rctz【9报 道,MUC7对于浅表性膀胱癌的敏感性为42%,对于 原位癌和浸润性膀胱癌的敏感度为81%.本组 MUC7在G1,G2,G3膀胱肿瘤患者中的阳性表达率 分别为58.3%(7/12),93.8%(15/160)和100% (14/14);在PTa—PT1期患者中阳性表达率为 64.3%(9/14),在-期患者中阳性表达率为 96.4%(27/28);不同病理分级和临床分期肿瘤的 MUC7表达差异均有显着性(P<0.05) 本结果显示,MUC7的表达与肿瘤分期,分级呈 正相关.MUC7与膀胱癌分期,分级存在正相关关 系的可能原因是:高分期和高分级的膀胱肿瘤细胞 由于呈现高恶性的肿瘤生物学特性,细胞质染色增 强,细胞表面的正常极性分布特征消失,结构发生改 变,出现新的抗原表位,糖链的糖基化不全,导致新 的糖链表位形成和新的肽链表位暴露.表现为 MUC在细胞表面均表达,在细胞质中也表达,因此 MUC的表达水平与肿瘤分期,分级呈正相关】,上 述研究显示,MUC7不仅可作为诊断膀胱肿瘤的标 志物,还可用作预测膀胱肿瘤生物学特性及患者预 后的参考指标.采用RT—PCR法检测尿脱落细胞中 MUC7表达诊断BTCC的敏感性,特异性和阳性预 测值高,特别对T2一T4期肿瘤的诊断敏感性高. PCR法在检测BTCC患者尿脱落细胞中 3.3RT— MUC7表达的应用 BTCC患者的移行上皮肿瘤细胞中要脱落到尿 液中,但肿瘤细胞在尿液中仅微量存在,常规尿脱落 细胞学检测虽特异性高,但对于分化中等和良好的 BTCC敏感性差,且带有主观性,准确性也常受到标 本采集方法,细胞炎症反应等因素影响.因此要准 确检测尿脱落细胞中肿瘤细胞的存在,寻找一种敏 感性高,特异性强的检测方法尤为重要. 1983年美国PE-Cetus公司Mellis等人发明了 PCR技术,它以其显着的三大特点即特异性,高效 率,可靠性,很快即在生命科学研究领域发挥着重要 作用,PCR技术目前已成为肿瘤诊断的一种重要方 法.由于PCR的特异性受到诸多因素,例如模板, 引物,Taq酶,Mg2+,dNTP及退火温度,循环次数等 影响,因此本实验在尽量优化PCR反应条件的基础 上,大大提高了反应的特异性,除目的基因条带外无 任何非特异性条带,达到了预期的目的. [参考文献] [I]DrellerMJ,BladderCancer.Stateoftheartc.agnceg【J].CA CancerJClin.1998.48(5):269—284. [2]GrasmanHB.Newmethodsfordeteetlonofblader?[J]. SeminUrolOncol.1998.16(1):l7—22. [3]RamakumarS.BhuiyanJ.BesseJA.eta1.Comparisonof Screeningmethodsinthedetectionofbladdercancer[J].JUrd. 1999,161(2):388—394. [4]BrownFM.Urinecytology:iti8stillthesoldstandardfor??. ing[J].UrolClinNorthAm,2000,27:25—37. [5]LesuffeurT.zWeibanmA.RealFX.Muelnsinnormalandneo_ plastichumansastmintestinaltissues[J].GritRevOneelHema- tol;1994.17:153-180. 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