不同柑橘品种间柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因序列的分析及表达分析

不同柑橘品种间柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因序列的分析及达分析 不同柑橘品种间柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因 序列的分析及表达分析 不同柑橘品种间柠檬苦素类似物葡萄糖基 转移酶基因序列的分析及表达分析 王斌杨汶源张军李名扬眭顺照 5 10 西南大学园艺园林学院重庆市花卉工程技术研究中心南方山地园艺学教育部重点实验 室重庆 400715 摘要根据 GenBank 公布的柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶LGT基因的核苷酸序列 并合成特异性引物通过 PCR 扩增从费米耐劳酸橙总 DNA 中克隆得到该基因与温 州蜜柑GenBank accession numberAB033758梁平柚 GenBank accession numberEU304828 的 LGT 基因序列进行比较分析结果表明这几个品种间的核苷酸序列差异很小对四个柑 橘品种的果实及叶片不同时期 LGT 基因进行实时荧光定量 PCR 分析结果 表明 LGT 基因 在不同时期的表达量有差异推测该基因的表达量可能与柠檬苦素类似物含 量有关 关键词柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶克隆实时荧光定量 PCR表达分析 中图分类号S666 15 Sequence analysis and expression analysis of Limonoid-UDP-β-glucose transferase gene between different citrus varieties Wang Bin Yang Wenyuan Zhang Jun Li Mingyang Sui Shunzhao 20 25 30 35 40 College of Horticulture and Landscape Southwest University Chongqing Engineering Research Center for Floriculture Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions Ministry of Education Chongqing 400715 Abstract Based on the nucleotide sequences of 1imonoid-UDP-β-glucose transferase gene LGTpublished on GenBank a pair of specific primers was designed and synthesized The whole coding sequence of LGT gene was obtained by PCR from total DNA in young leaves of Citrus limon L(Burm(F( Femminel and Citrus aurantiuml L Compaired with the LGT gene sequence of Citrus unshiu Marc and Citrus ima cv Liangping You further analysis shows that the sequences of four citrus varieties were similar In different organizations and times the expression levels of LGT were different according to expression studies by real- time quantitative PCR Key words 1imonoid-UDP-β-glucose transferaseCloningreal- time quantitative PCRexpression studies 0 引言 柠檬苦素类似物是一类三萜类的物质而且是种重要的植物次生代谢产物其主要存在 于芸香科和楝科的多种植物中是引起柑橘汁延迟苦味的主要原因之一[123]迄今为止已 从柑橘属植物中分离出 36 种柠檬苦素类似物及 19 种配糖体[4]完整的果实组织中含有无苦 味的柠檬苦素类似物前体柠檬苦素 A-环内酯 limonin A-ring lactone简称 LARL [5]榨汁时 无苦味的前体在 pH 65 酸性条件下逐渐转变为有苦味的柠檬苦素从而引起苦味除苦味特 性外研究还发现柠檬苦素类似物具有抗肿瘤[67]昆虫拒食[8]抗炎镇痛[9]等多种药理活 性已有研究表明柠檬苦素类似物葡萄糖苷具有水溶性且无苦味等特性而且其生物活性与 基金项目教育部博士点基金200806351015 作者简介王斌1986-男在读硕士研究生植物细胞工程 通信联系人眭顺照1971-男副研究员从事林果花卉植物生物技术研究 E-mail sszcq126com -1- 和柠檬苦素类似物相似[10]柠檬苦素类似物的葡萄糖苷化是在柠檬苦素-UDP-葡萄糖转移酶 的催化作用下在有苦味的柠檬苦素类似物上连接一个葡萄糖分子而将其转化为无苦味的柠 檬苦素类似物葡萄糖苷[11]Kita 等已经从温州蜜柑和脐橙中分离得到编码该酶的基因并 对其功能进行了一些研究[12]眭顺照等从梁平柚中分离出 CmLGT 基因并进行了初步的分 45 50 析[13] 本试验根据 LGT 基因编码区设计特异引物从费米耐劳和酸橙基因组 DNA 中克隆到该 基因并与温州蜜柑和梁平柚的序列进行比较分析通过对四个品种不同时期的果实和叶片 进行实时荧光定量表达分析来探寻该基因与果实苦味的联系 1 材料与 11 植物材料 供 试 材 料 为 温 州 蜜 柑 Citrus unshiu Marc 费 米 耐 劳 Citrus limon L(Burm(F( Femminel 梁平柚 Citrus ima cv Liangping You 酸橙 Citrus aurantiuml L 成年树材料取自中国农科院柑橘研究所 12 菌株载体及主要试剂 55 60 65 大肠杆菌感受态菌株 DH5α 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ExTaq 酶克隆 载体 pMD19-T反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit 均购于大连 TaKaRa 公司RNA 提取试剂盒为天根公司生产的 RNAprep pure Plant Kit 试剂盒SsoFastTMEvaGreenSupermix 试剂盒购于 Bio-Rad 公司引物合成及 DNA 测序由北京六合华大基因有限公司完成 13 叶片 DNA总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 温州蜜柑费米耐劳梁平柚酸橙四个品种叶片总 DNA 的提取参考熊光明等的方法 进行[14]取这四个品种开花后 30 天60 天90 天120 天150 天180 天的果实及叶片 用 RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒 天根 提取上述材料的总 RNA 然后以 1μ L 总 RNA 为模板按 PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time 试剂盒 TaKaRa 的说明书合 成 cDNA 第 1 链 14 柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因的序列分析 根据 GenBank 上发表的梁平柚柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因 CmLGT 全长 cDNA 序列 GenBank accession numberEU304828 利用 Premier 50 软件在 CmLGT 基因全长 cDNA 开 放 阅 ORF 的 5′ 和 3′ 末 端 设 计 1 对 特 异 性 引 物 上 游 引 物 P15′-ATGGGAACTGAATCTCTTGTTCAT-3′ 下 游 引 物 P25′-TCAATACTGTAC 70 75 ACGTGTCCGTCG-3′取费米耐劳和酸橙 DNA1uL 为模板进行 PCR 扩增反应条件为 94?5min94 1min58 45s72 90s28 个循环72延伸 10min 15 基因表达分析 使用 SYBRGreen 荧光染料法在 CFX96 Bio-Rad 实时荧光定量 PCR 仪上对 LGT 基因 在四个品种不同组织不同月份中的表达情况进行实时荧光定量 PCR real-timequantitativePCR 分 析 选 取 柑 橘 β-Actin 基 因 作 为 目 标 基 因 定 量 表 达 的 内 参 基 因 表 1 根 据 SsoFastTMEvaGreenSupermix 试剂盒 Bio-Rad 说明配制反应体系每个样品设 3 个重复反应 体系中含有 5μLSsoFastEvaGreenSupermix上下游引物 10μM 各 05μL模板 05μL 50ngμL -2- ddH2O35μL总体 10μL 反应程序98预变性 30s95变性 5s57退火-延伸 5s 每次 循环后采集荧光 40 个循环95变性 10s65,95做熔解曲线分析每个温度以每步 80 05上升每个温度停留 5s 试验数据通过 Bio – Rad ManagerTM Software Version1 1 进行 分析用 , 2CT法 Livak et al(2001 获得获得 LGT 基因的相对表达量 [15] 表 1 实时荧光定量 PCR 引物序列 Tab1 Primer sequences used in real- time quantitative PCR 基因名称 上游引物 下游引物 β-Actin LGT CCAAGCAGCATGAAGATCAA ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG GCTGCTTATTACCATCACTTTCACGG GAAAGGATAAGGAGTTGACGGATGC 85 2 结果与分析 21 柑橘基因组 DNA总 RNA 的获得及 LGT 基因的克隆分析 对得到的 DNA 进行紫外分光光度计检测测得其 A260A280 为 18- 20取 5μL DNA 溶液在 l,琼脂糖胶电泳得到清晰的一条带表明所提 DNA 比较完整无降解RNA 除 90 去干净图 1获得的总 RNA 条带完整A260A280 接近 20表明其纯度高无基 因组 DNA 污染图 2以四个品种的基因组 DNA 为模板用特异引物进行 PCR 反应结果显 示四个品种均在 1600bp 左右有一条清晰的带 图 3 95 MDNA Marker DL2000 1温州蜜 柑2费米耐劳3梁平柚4酸橙 12 为温州蜜柑果实和叶片总 RNA34 为费米耐 劳果实和叶片总 RNA56 为梁平柚果实和叶片 总 RNA78 为酸橙果实和叶片总 RNA 100 图 1 基因组 DNA Fig1 Genomic DNA 图 2 总 RNA Fig2 Total RNA 105 MDNA Marker DL2000 1温州蜜柑 2费米耐劳3梁平柚4酸橙CK阴 性对照 110 图 3 LGT 基因 PCR 扩增 Fig3 PCR amplification of LGT gene -3- 使用 DNAStar20 软件对温州蜜柑梁平柚费米耐劳酸橙的 LGT 基因序列进行比较 发现除了费米耐劳的 ORF 为 1530bp 外其他三个品种 ORF 都为 1536bp氨基酸序列分析 表明四个品种的 LGT 蛋白质在 UDP-葡萄糖结合域2 个含有 4 个氨基酸残基的糖基化位点 115 均一致图 4与其他三个样品相比费米耐劳在第 490 位和第 491 位缺失两 个氨基酸残 基 120 代表糖基化位点, 代表 UDP-葡萄糖结合域 comcomcom 125 130 135 140 com 图 4 蛋白质的序列比对 Fig4 The multiple sequence alignment of LGT proteins 22 LGT 基因的表达分析 在对不同品种开花后 30 天60 天90 天120 天150 天180 天的 图 5 不同组织 及不同时期 LGT 基因的表达分析表明在四个品种的果实中花后 30 天 LGT 的表达量都 最低并且在 150 天达到最高后又降低在叶片中四个品种的 LGT 的表达量都是在花后 30 天最高60 天明显降低90 天又有所上升温州蜜柑梁平柚从 90 天之后一直保持较 低水平费米耐劳酸橙则分别在 150 天120 天达到最低后开始有小幅升高从四个品种 不同时期果实与叶片的表达分析来看在不同时期的分析中花后 30 天每个品种 LGT 的表 达量均是叶片远高于果实花后 60 天除梁平柚果实与叶片表达一致外其他品种果实表达 均高于叶片花后 90 天温州蜜柑和梁平柚果实略高于叶片费米耐劳和酸橙的果实表达都 远远低于叶片花后 120 天和 150 天所有的品种果实的表达量都远高于叶片花后 180 天温 州蜜柑和梁平柚果实的表达量高于叶片而费米耐劳与酸橙则是果实的表达量低于叶片从总 体表达分析来看在果实中梁平柚与酸橙的表达趋势一致温州蜜柑与费特耐一致叶片中 梁平柚与温州蜜柑的表达趋势一致酸橙与费米耐劳一致 -4- Citrus unshiu 温州蜜柑Citrus limom 费米耐劳 Citrus ima 梁平柚 Citrus aurantiuml 酸橙 145 150 155 160 165 图 5 LGT 基因的表达分析 Fig5 Expression analysis of LGT gene 3 讨论 已有研究表明柑橘果实中不同部位的柠檬苦素含量差别很大一般种子含量最高果 皮次之果汁最低并且品种之间的柠檬苦素类似物含量为柚类大于甜橙大于宽皮柑橘[16] 本试验选取宽皮柑橘柠檬类柚类和橙类四个品种进行研究通过其序列的分析发现四个 品种 LGT 蛋白质在功能结构域上保守在其他位置出现氨基酸突变推测其催化功能未发 生变化序列差异可能是在进化过程中形成的从 LGT 基因表达分析来看在果实中温州 蜜柑与费米耐劳的最高相对表达倍数为 3 左右而梁平柚和酸橙则达到了 20 左右远远高 于温州蜜柑和费米耐劳随着果实的成熟可溶性固形物和总糖含量开始上升由于其次生代 谢的开始及其产物的积累形成了不同风味[17]由于 LTG 基因编码的蛋白质会将有苦味的柠 檬苦素类似物转化为无苦味柠檬苦素类似物糖苷在 90 天至 150 天果实中 LGT 基因表达一 直升高这与 Fariborz Zaare-Nahandi 等温州蜜柑的 LGT 基因在开花后 60 天就开始表达甜 橙与酸橙开始表达出现在开花后 120 天的研究结果一致[18]而叶片中的总的表达趋势则与果 实相反推测可能由于柠檬苦素类似物向果实中转移导致了叶片中 LGT 基因的表达降低 综上推测LGT 基因的表达量可能与柠檬苦素类似物的含量相关由于梁平柚和酸橙 的柠檬苦素类似物含量较高所以 LGT 基因的表达量也远高于其他两个品种已有研究表 明柠檬苦素类似物的前体合成是在茎中之后逐渐转移到叶片及果实中[19]因此会出现 LGT 基因在果实中开花后 60 天表达量低而 90 天到 150 天中表达量逐渐升高并且在 150 天后 达到最高的的结果 柑橘果实的口味与品质受多方面的影响其中柠檬苦素类似物是对其苦味影响相关的一 个因素从其他多个方面来了解柑橘口味品质形成的原因有助于我们改善柑橘的品质从四 个基因 LGT 蛋白质序列的比较只能说明其功能一致但是不能说明其催化能力是否相同 而且 LGT 基因的表达调控机理也不是很清楚在后续的研究中准备对四个品 种的 LGT 蛋 白进行研究检测其催化能力并且对 LGT 基因调控机制进行研究来探索该基 因的表达模 式为柑橘的品种改良提供理论依据 -5- 170 175 180 185 190 195 200 205 210 [参考文献] References [1] HASHINAGA F FONG C H HASEGAWA S Biosynthesis of limonoids in citrus sudachi[J]Agri Biol Chem1990543019-3020 [2] RAYMOND D BENNETT T HASCGGAWA S 7α-Oxygenated limonoids from the rutaceae[J]Phytochemistry1982212349-2354 [3] CHAMPAGNE D E KOUL O ISMAN M B SCUDDER G G ETOWERS G H NBiological activity of limonoids from the rutales[J]Phytochemistry1992 31377-394 [4] 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