兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究

兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究 兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞 转分化的实验研究 重庆医科大学学报2O06年第31卷第2期(JournalofChongqingMedicalUniversity2O06.Vo1.31No.2)一231一 文章编号:0253—3626(2006)02-0231-05 兔眼虹膜色素上皮细胞向品状体上皮细胞转分化的实验研究 汤永强,李立,黄瑶 (重庆医科大学附属第二医院眼科,重庆400010) 【摘要】目的:在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法:采用酶 辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲,透明质酸酶,重组人成纤维细 胞生长因子-4及L-抗坏血酸一2一磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜,电镜观察和免疫组化染色 鉴定.结果:成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹 膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论:酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的 方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶,苯硫脲,L一抗坏血酸一2一磷酸,重组 人成纤维细胞生长因子一4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节. 【关键词】兔;虹膜色素上皮细胞;晶状体上皮细胞;转分化 【中国图书分类法分类号】R77【文献标识码】A【收稿日期】2005—12—27 TheexperimentOntheCOurseOfthetransdI仟erentIationfrOmIrIs pigmentedepithelialcelltolensepithelialcell ?GYongqiang.et (Departmentofophthalmology,theSecondAffiliatedhospitalofcollege,ChongqingMedic alUniversity) 【Abstract】 Objective:Toaccomplishtl1edetachmentandcultureofIPEinvitroandtoinvestigatetl1ecourseoftl1etransdifferentiati0n fromirispigmentedepithelialcelltolensepithelialcellduringthespecificcondition.Methods:TheIPEofrabbitsweredetachedandcu1.. tivatedaccordingtothemethodofenzyme-assistedmicrodissection.ThentheIPEwerecultivatedintheculturemediumappendingwith PTU,Huase,rhFGF—4,Asc一 2PandSOon.Finallytheinitiativeandtheultimatecellswererespectivelyidentifiedbymicroscope,elec— troscopeandthemethodofimmunohistochemistry.Results:TheIPEofrabbitsweresuccessfullydetachedandcultivatedandthecourseof tl1etransdifferentiationWasobserved.TheIPEandLECwereidentifiedbytheirparticularreactiontoimmunohistochemistry. Conclusion: ItisagoodmethodtodetachIPEbyenzyme-assistedmicrodissection.Duringinvitroculture,IPECanundergothecourseoftransdifferen— tiationandturnintoLECfinally.ThisexperimentsuggestthatthosefactorssuchasPrU,Huase,rhFGF-4,Asc一2PandSOonmaybein— volvedtheregulationofthecourseoftransdifferentiation. 【Keys】 Rabbit;IrisPigmentedEpithelialcell(IPE);LensEpithelialCell(LEC);Transdifferential 当Wolff在1895年对晶状体再生进行描述后, 蝾螈的晶状体再生现象便引起了全世界生物学家 的浓厚兴趣和广泛关注.对于这种已完全分化的细 胞,在某些条件刺激下,从其原有的特定分化类型 转入另一完全不同的分化途径,从而在现型上从 色素上皮细胞转变为晶状体细胞的现象,人们称之 为"Wolff晶状体再生".然而对较高等的生物,上 述虹膜色素上皮细胞的转分化过程则研究甚少,本 实验以常见哺乳动物兔为对象,观察了体外培养条 作者介绍:汤永强(1974-),男,主治医师,硕士, 主要研究方向:晶状体疾病. 件下的上述转分化过程. 1材料和方法 1.1实验动物 新西兰大白兔,雌雄不拘,兔龄2O,3O天,体重250, 350g(296?14g).由重庆医科大学实验动物中心提供. 1.2主要试剂 DMEM培养基(美国Hyclone公司); 胎牛血清,透明质酸酶(HUase),苯硫脲(刖),L-抗 坏血酸一2一磷酸(Ase一2P),重组人成纤维细胞生长因子 (rhFGF-4),鼠抗兔角蛋白多克隆抗体,鼠抗兔一晶状体 232重庆^学学报2IHlbjl卷弟(JournalolChongqlngMedicalUn,ve~ity2.?V.l3IN.2) 盎II机f4"T抗I!tl?蜘木化札,IIC]刊盘icI}1 ltj) I3王皿培养鞋配制 I3II_l蚺非1,_lMl?M啃乔JlLfill凡始j.J533011~hlk 址川的腑牛Iff[f!f)). 13.2IIPH柞II}腑砟坫/Jlr苯硫[IM请 I埙腋嘶(OII/j,11),11『_4【2(IJI…?; I3.3IHl,H^JIl?I』?LIL]/Jrl^I-{JmI 1一礴醺{^一2P}c0IM 14宾齄击 I4I兔代I铷JJ帕聃,牲让E蜘" Jl_『键寐鹰索2n万I的H*滴 巾化In1押:J,琢栩肫.r川从m:讣离瞄 IhmL',沈j趟^INIf]Il^l_5性晰l】q情j 晰再I.37蚺辩槲l,化3f|lI剂!I诎谴'』[?他 轩刊I玎乜他I脱浒.地晰化I-…"开』__『^1…莆终 L.fJ…?r#mir~离心I…Ill培柞牡i皿2趺.m 八I)1'蚺雌3-4rLll.37ll5%I_)培#艄lH蚺非 l42IPE如胞恃代培牛止.他聃1.L疑川f】台 件糖蒜k部圩帆嘲障Ill芥IJll,ll!,臻孵I…窟 现性肺M自I】九Ifll婵II消K 暇{j壁圳胜.驯肛钍_嵌离tiI(X)O,Inhi.I(hlfi.jJl- Il}埔捧5.1I接-两帆蚺缱』弗圳1?尘托}满憔IJ 州l述J}辅址"他ft.11选耻刚H I4.3f…咐(IO进蚶U随{察墩1{K状志蚵if'J &J比阡I耸,10ml底离,倍,lr.凡4f々 nPIIS罐液I(t1.I"2(~)Or?mil1l?心I…Ilr澉 聃营雌缨懈J』?凡4'1r々的!*一4.1I4林箱圳刮, 2J1.然用针刺离川眦挫辟i爵谍小I【}LIk]…攫冲滟 ]戚}}-u氧化系刊Ill谴f? 成恻1j世U崦l,l1抽橱 14I圳胞的'定圳胜f01LU,:圳胞掩柑r'也辅IL 扎嘶{L艘凡1H…xm,溢城H1艄教件F 培养E删淮.7取_Il嚣玻H.廿撇鼬lIl:匝.: 廿做饱痤~IIIl膻化血m句I'50扎饱厢难II多虹降 机f,.抗I:tO0物翥他抗fn? j4s魄I1)I-:腿nJIl<I眦转丹化的Jff』l_c亿fL ll忠nr怕m胞摧剌刮L)II,II培捧j莽20牛 约s,^代l,忸幢对也的I胞冉^tl【i常 iii:?接刊I"I,车捧25K^[约 ^,f】rlf观察刊转舒他rl{jlEI忸l{lIIl韶 146转廿f1.(胞'透削Ih韫《咏往 I4转抒化『?眦nq常规II'包地疰fHI眦化# 也娃,,i1ll~i"札I:16n机,且l】一4~4k./4,蜇 _抗f十..批斯JIOil#扎吼牛翱南化抗.1】^Hj__1色 2结果 2I仆外培养状态下丸llE细胞的彤态观察(囤 i2) 味代埔莽的龟L细胞,托景浓懈龇黑色索 圩离肝球】悬浮常:接种24-481]内岵 肇生K.世ftWrHfJ~莲倚行忡艇变尢.为小挑州 蚋痛分I培养7,Io细胞逐渐融合 K胞轮廓模糊他f"r刊伸m仙越K梭 形州也此时'?胞叭壁时缔州为1—2h.细咆1. 划l台的时lfJ也缩艇为5,7夫f纠斤IPE_胞 呐色索州牡j茎渐溅,一般绛过5-6代包素锕粒 l0_.减少 2.2体卟培乖IPE知盹的逢导}电镜靶样(固3) IPEflIl~fJ胞浆内细胞F富.1lJJ,If见较多电 惭恒敢的包采1粗.地凡部分呵肜.少数可 }Ij6叫彤不规则形迁i-J刮}富的错1粒, {体柑面内厩网溶惝体等圳胞表面可澈城 E』,F_If撇艏结构.郫分州恤底可发观 #忻粒样}10构 3ifF如胞允疽细袍化学染色【闺4) IrI~III)I甜埔lL色均匀免疫复台物 啪岫浆.棕黄色懵喊细小牲状. 胞核ieJ漩淝 圈2II,E细胞的HE染色I(1~4t) 蓖_盍大学学报2IHm年第3I卷蕈:M【JournalofChongqingMedicalUnivemltv2l? "Vol31No2 图IIE细胞的透射电镜像×I…? ? ???? ?- 图4IlI细胞的免疫细胞化学染色I4n . x40 图5转分化培养过程中的细胞cI】 图6转分化培养过程中的细胞{2l40 24特分化过程巾细胞彤态观察(闺5.6) 倒?垃镜F蚍察.IlEfitf眦转移刮川--,IH靖 掉斌开.1胞浆内色求特J艟减少.直三I后定 消失,细连渐蹙得缃托.时IIrJ约为15火左右(传 代^一8ftj 2.5特分后细胞的形态观察(旧7.) 倒做镜F观察,培养帆中的细胞渐变为 镗形,长条形等.细胞生旺盛,1wfII】lJnr铺满晰i 底.弛浆IJ,J色素惭粒完全失.细胞问可蝇扎州 现象 2.6转旁_乜后细饱的进射电链观察I旧g} 睦电镜下可见咆浆l,色采牲消失 细胞表仃少胞匝蹙起.呈劂彤幢自质内 细胞器r富.岛尔蛙惟篮.常化f-fill咆中啦:; 面内脏网十钳.多傅J边:湍廊怍数髓多少 一 {_{《柑f隹中锋量.线粒悼lE辕少见;穷一1-特就 是怆匝做丝J一富,自帕密集成靠位J胞帻附近 』盹剧边, 27转夸化后如胞的免症知咆化学染色囤10) 转分化的细胞抗"一晶状件蚩门色日…: 胜似镜下脱察胞柴内可见棕色},牲状?C积 图7转分化后的细胞×4? 囤R转分化后细胞的fie染色II)x4( 掣 234重科学报211~6莆31卷第 2{JoumalofChongqlngMedicalUniversity211U6VOI31NO2) 图9转分化后细胞的透射电镜像~80(XJ 圈Il_转分化后细胞的免疫细胞化学染色lOx40 翱.】地}靠壮举小也 3IlT'E细胞的兮离培齐 1PE身[『胞属J'神经嵴求晾的包豢l_应.近求 仃越来越多的J能诎几发规.闩上纪 f?眦求凡们一商尝试剥IPE进行分离坫井,fFl均 未能状谢化的IIE细胞:能世}传代和心 的功雌研究随到I992IhiI'推'r一升 离{i业化培养iPE川胞帅,.确定丁廊辅m均艟 微解剖法是5'离蚺奔IPE~'11I胞口0昂法怛工}莪疗 浊难"扳僻九鲢的II,E咆:能满『床自?_ l移植的要求J'址一些1=l?精…的分离培养体录 f刚『I'奉j=骑参照}"内千兆电等ii采用的f晦辅 助机撇分离,_r…I1…it…I?{lr…州?)成 功分离纯化旧[PE细胞.ti进fr了传代培养4:11梢 关研究 32体外培养中儿?E细胞的转分化过程分析 3.21培养基的选择车窑螗参K,~akaM的h 浊II完成整个转分化过程共用-二种培养簟.每种 揶址F~;J-种的琏f=}Ij上添巾些辅助冈于.H刑 于培养H程n勺:阶段足DF培养蛙.片{J 代IPE钏胞砭其传fLJ;"i掉1lJI'川忸传代生K旺盛 按ll}I,H培养啦州J.II'E眦晌脱色素阶 胜.II,E}胞舱过【衰阶段培养.由儿兑乜索的"去补 f也乜索r戍咆(delPE)处I去分化状惑 的1PE胞?叶进人最后阶段岫培柞.1]rPIn培 车堆恒ir]完战转舒化越社.最彤战I状伴卜. 魁lLEI)f肋述埔荐系统哉们的宴骑 ifi成J圳成了从IPE胞I;i』LE(:胞的转舒化 过I察到两利叫,l_】j丧的胞彤盘学n区制 龟《聿?l化学}刊小同机的反应 22prI1HI日『^I一等计转Y4"fl~j.t租的话 lM1,J州I凡为IPE钏眦转分fE过ll】细胞一 j乜之IH厦细胞一』I鼍物之间晌接触状盘受列胞 微州,崦的胴.jf凡是侏特细胞分化状怠的必瞄麓 州蚺挥旗内lj?凡??{l?l咆辰I"I特m至影 III;,j.胞尬汛减少.圳胞分化状忘随之改变.从… 利1噬转分化吐程f_{J艟_"外.PTI是种 瓴瞧刚li'J利,它IIT完抑制IPEhi[胞巾色素 的l成.陋啦托甩为去分化的状Ul?速 圳地n々粘丹化iat慢 …舡0埘卜迷转舒化过程堆没竹摧稠节 件fII皿ii"f"艘几"1,1'【if逊转舒化过的杖也 f'i~J}Jl是:HT】分衅圳胞质内的坐n多 精.而J抒i是维持绷胞表而IE常一划导性的璺 案,舭即可导数flFI]]~蠢i特I细胞J同做 环境Il1堑,恒I.II发挥竹i 抗坏陵的竹?主鉴文趣在转分化过船的蛙 阶段发现在不岔卜21,的埘养内.小骨时 IPEfillJ]NI'T~])IF莽时蜒K多九.均小能看到柯品状 体样小体mJ巾于机坏血艘在符种培养细胞中 均川盐腔原的合成I.『此徊J能E电址面j刺 触一I川胞的合成求促进转仆化程的 13转舒化过侄中的计段?IIPE证上进转 舒f七t』程ll_IIE宣II胞培养于幽牧硫脲计f透…_ 匝腋酶(1ilTa*e)的培养蟮内叫细胞会悦去色素. 失去接触抑制"的生长特Pl&上f!_1=不同于 - 世始阶段的T【1E胞世不同r分化站柬的I …崛敞称勾",分化的IPE细胞"分比址程 一l处J…-l一问阶殷",只垂列培养基件IJfJ政变艇 J拄制其分化逢径:或者继续完成转舒化过程.向 lE(细胞?分化:或者发/分化逆转甫新堂叫 重庆医科大学学报21)06年第31卷第2期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2006.Vo1.31No.2)一235一 IPE细胞(reIPE)[41. 3.2.4细胞因子FGF对转分化过程的调节作用FGF 家族的各种蛋白质在晶体发育过程中起着十分重 要的作用,在来源于IPE细胞的晶状体再生过程 中,作为FGF活化后信号转导通路的下游阶段,其 受体FGFRs的作用也是必须的【81.本实验在FGF的 协同作用下观察到了IPE向LEC细胞的转分化过 程,可认为FGF对上述过程具有一定的调节和促进 作用.但是,该细胞因子对转分化过程的具体作用 尚未阐明,作用机制也知之甚少,有待进一步研究. 本实验观察到了高等哺乳动物兔的IPE细胞 向LEC细胞的转分化现象,和以往利用低等生物 IPE细胞所进行的体外培养相比,还远未达到类似 的研究程度,在体外培养中也没有发现转分化后的 LEC细胞形成晶状体泡及其他晶状体样结构,这可 能主要与物种差别有关,所需要的条件和时间也可 能大相径庭.我们的实验只是提出了这样一种可能 性,做了最初的探索,至于是否能通过改变有关条 件来实现体外培养条件下的晶状体再生,以及再生 过程如何调控,尚需大量的实验来论证. 参考文献 【1】HuDN,RitchR,McCormickSA,eta1.Isolationandcuhi— vationofhumanirispigmentepithelium[J】.InvestOphthalmolVis Sci,1992;33(8):2443-2453. 【2】王兆艳,惠延年.兔眼虹膜色素上皮细胞的组织培养与 超微结构观察[J】.中华眼底病杂志,2002;18(1):61—63. 【3】KosakaM,KodamaR,EguchiG.Invitroculturesystemfor iris—pigmentedepithelialcellsformolecularanalysisoftransdif- ferentiation[J】.ExpCellRes,1998;245(2):245—251. 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(通讯作者:赵敏联系方式:重庆医科大学附属第一医院 眼科,邮编400016E-mail:minzhao2002@yahoo.eom.en) 参考文献 …1RichardLS,RonaldSG.InfectiousDiseaseofrrheFemale GenitalTract,4thed【M】.LippincottWilliams&WilkinsInc.and ShandongScience&TechnologyPress.2004;1—12. 【2】CommitteeMicrobiologicalSafetyofBloodandTissuefor Transplantation.Guidanceonthemicrobiologicalsafetyofhuman tissueandorgansusedinthetransplantation.London:Department 0fHealtI1. 【3】GabricN,MravicicI,DekarisI,eta1.Humanamniotic membraneinthereconstructionoftheocularsurface[J】.Doc Ophthalmol,1999;98(3):273—279. [41LeeSH,TsengSCG.Amnioticmembranetransplantationfor - +-+-+ persistentepithelial[J】.AmJOphthalmol,1997;123(3):303—312. 【5】陈家祺,周世有,黄挺,等.新鲜羊膜移植治疗严重的 急性炎症期及瘢痕期眼表疾病的临床研究[J】.中华眼科杂志, 2000;36(1):13—16. [6】6邹留河,徐军.羊膜联合自体穹隆结膜移植治疗睑球 粘连的实验研究[J】.眼科研究,2002;20(6):491—494. 【7】李学东,孙秉基,徐锦堂,等.羊膜移植术治疗兔重度角 结膜碱烧伤后遗血管性角膜白斑[J】.眼科研究,1998;16(2): 115-117. 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