唾液酸的研究进展

368 刘志东 1, 2,王荫榆 2,郭本恒 2, * ,刘振民 2,苏米亚 2,李云飞 1,高红艳 2 ( 11上海交通大学生命科学技术学院,上海 200090; 21光明乳业技术中心,上海 200436) 摘 要:唾液酸是一系列的 9- 碳酸性单糖,是高等动物和某些微生物具有的重要分子。唾液酸在原核和真核生物的 生理反应和特征方面具有重要的作用。唾液酸与复杂的糖结合并占据了重要的位置,特别是在细胞膜上。它们保护 了生物大分子和细胞免受酶和免疫的攻击。由于其结构的高度多样性, 其生物合成机制也是复杂的。本文综述了近 年来唾液酸的制备、分离纯化、检测方法、生物活性和应用现状的研究进展, 并对其未来的发展方向进行了展望。 关键词:唾液酸, 制备,分离纯化,检测, 生物活性 Resea rch advance s in s ia lic ac ids L IU Zh i- don g1, 2, WANG Y in- yu2, GUO Ben- h eng2, * , L IU Zhen- m in2, SUM i- ya2, L i Yun- fei1, GAO Hon g- yan2 ( 11School ofL ife Sc iences and Biotechnology, Shangha i JiaotongUniversity, Shanghai 200090, China; 21Techn ical Center, Br ight Dairy Co1L td1, Shangha i 200436, Ch ina) Abs trac:t Sia lic ac id s a re a se r ies o f 9- ca rbon ac id ic m onosaccha rides w hich be long to the m os t mi p ortan t m o lecu les of highe r anmi a ls and a ls o occur in som e m ic roo rgan isms1S ia lic ac id s p lay an mi p o rtant ro le in the p hys io log ica l reac tions and cha rac te ris tic s o f p roka ryo tes and euka ryo tes1S ia lic ac id s a re b ound to comp lex ca rbohyd ra tes and occup y p rom inen t p os itions, espec ia lly in ce ll memb ranes1They sh ie ld mac rom o lecu les and ce lls from enzym a tic and mi muno log ica l a ttacks1Due to the ir h ig h s truc tu ra l d ive rs ity, the mechanism s for the ir b ios yn thes is a re comp lex1The p rod uc tion, iso la tion and pu rifica tion, de te rm ina tionm ethod s and b io log ica lac tiv itie s we re reviewed, the ap p lica tions o f s ia lic ac id s we re in troduced and the fu tu re d irec tions o f s ia lic ac id s were pu t forw ard1 Keyw ords: s ia lic ac id; p roduc tion; iso la tion and p u rifica tion; d e te rm ina tion; b io log ica l ac tivity 中图分类号: TS201 文献标识码: A 文 章 编 号: 1002- 0306( 2010) 04- 0368- 06 收稿日期: 2009- 04- 07 * 通讯联系人 作者简介:刘志东 ( 1976- ),男,博士,研究方向:食品工程与生物技术。 基金 项目: / 十 一五 0 国家 科技 支 撑计 划 ( 2006BAD04A14, 2006BAD04A06); / 8630国家项目 ( 2007AA10Z353 )。 1927年, Landste iner和 Leuene在制备特定动物 脂类时发现有一种类似糖的组分,与 B ia ls'试剂反应 呈紫色 [ 1]。 1935年, K lenk将这一组分命名为神经节 苷脂 (Ganglioside) [ 2]。该组分继续纯化结晶后为神 经氨酸 ( neuram in ic acid),现在已证明该组分是脱乙 酰唾液酸甲醇酯。 1957年, Blix从颌下腺粘蛋白中 分离出具有同样特性的物质, 将其命名为唾液酸 ( Sia lic ac id)并建立了唾液酸的命名规则 [ 3]。 1960 年,唾液酸的化学结构被解析。唾液酸是指一系列 含 9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的统称, 其 系统命名为 5- 氨基- 3, 5- 二脱氧- D- 甘油- D- 半乳 壬酮糖。根据 5位碳上连接基团的不同可分为四 类:即 N- 乙酰神经氨酸 (NeuAc、Neu5Ac或 NANA), N- 羟乙酰神经氨酸 (NeuGc, NANG或 Neu5Gc), 去 氨基神经氨酸 (KDN)和神经氨酸 (Neu ), 前两种为 主要形式。唾液酸通常位于细胞膜最外层的糖类部 分和分泌的糖复合物 (糖脂、糖蛋白和脂多糖 )的关 键位置, 是糖复合物结构和功能多样化的重要物质 基础 [ 4- 5]。唾液酸通常是以 A- 2, 6或 A- 2, 8糖苷键 与 N- 乙酰半乳糖胺或半乳糖相连,唾液酸之间也以 A- 2, 8酮苷键连接聚唾液酸末端相邻的两个单体能 形成内酯 (甲单体 C1- COOH与乙单体 C9 - OH脱水 形成 ) [ 6]。另外,唾液酸本身也可以通过分子内部的 氢键构成多个环状结构,提高分子的稳定性 [ 7]。唾液 酸的存在形式主要包括游离态的唾液酸、聚唾液酸、 唾液酸的衍生物和唾液酸的同系物 [8]。聚唾液酸 ( Polysialic ac id)是唾液酸单体以 A- 2, 8和 /或 A- 2, 9酮苷键连接的线性同聚物。唾液酸同系物主要是 通过甲基、乳酰基、硫酸和磷酸基团取代四种主要唾 液酸 C- 4, 7, 8, 9位上的羟基基团而实现 [ 9]。纯的唾 液酸是无色的,易溶于水,在水溶液中不发生变旋作 用, 4e 时贮藏数月不发生变化 [ 10]。纯的聚唾液酸是 白色不定型高聚合物, 水溶性较好, 粘度低, 生物相 容性好, 在酸的作用下容易降解成单体的唾液酸, 具 有生物可降解性 [11]。由于唾液酸结构的多样性和独 特的生物学活性, 受到了人们越来越多的关注,本文 综述了唾液酸的研究进展及其应用现状。 369 图 1 唾液酸的种类 1 唾液酸的制备 唾液酸的制备方法主要有化学合成法、酶合成 法、天然产物提取法和微生物发酵法等。 111 化学合成法 采用 N- 乙酰甘露糖胺和二叔丁基氧代丁二酸 的钾盐缩合,再在碱的催化下脱羧作用可生成 N- 乙 酰神经氨酸。在酸性醇溶液中, 在铟的催化下,对 N -乙酰甘露糖胺用 A-溴甲基丙烯酸进行丙烯基化,再 进行臭氧分解得到 N- 乙酰神经氨酸 [ 12]。 D1Meind 等 [ 13]则以 N- 乙酰神经氨酸甲酯出发合成了 2- 脱氧 - 2, 3- 脱氢- N- 乙酰神经氨酸。使用化学法合成唾 液酸反应条件苛刻, 需要铟等一些贵重金属作为催 化剂,唾液酸收率较低。另外, 化学法合成通常和酶 法合成结合起来。 112 酶法合成法 E than S1Simon等 [14]用 N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸 钠和 ATP在唾液酸醛缩酶的催化下合成 N- 乙酰神 经氮酸。 Isafum im aru等 [ 15]用 N- 乙酰葡萄糖胺 2-差 向异构酶实现了唾液酸的全酶合成并简化了唾液酸 的纯化工艺。酶法生产唾液酸具有转化率高、提取 简单、产品纯度高等优点, 但对合成所用原料要求 高,价格较为昂贵, 唾液酸醛缩酶不易获得, 限制了 生产规模的扩大。 113 天然产物提取法 唾液酸在自然界中分布很广, 在动物、植物和微 生物中都有其分布。唾液酸以糖复合物的形式广泛 存在于动物细胞面, 但其含量较少,表 1中列举了 部分唾液酸含量相对丰富的天然资源 [ 16]。 表 1 唾液酸的来源 来源 含量 ( g/kg) 来源 含量 ( g /kg) 燕窝 67 枇杷 0166 酪蛋白 217 北柴胡 0148 禽蛋 0134 茄子 0145 Lekh Raj等 [ 17]从禽蛋的蛋黄膜和系带中提取唾 液酸已获成功并己应用于生产, M1W1Whitehouse[ 18]和 Masskarn Sh imatan i[19]分别从牛乳乳清和酪蛋白中提 取唾液酸;日本的雪印公司也做了相应的研究。另 外,国内有冯万样、高剑峰等 [20- 21]从猪血中提取唾 液酸。 由于唾液酸在天然原料中含量比较低, 而且组 成成分远比发酵液中复杂, 分离提纯过程也比较复 杂,回收率较低, 需要一些特殊的设备,造成的污染 也大。但是天然原料的提取物品质好, 要扩大到工 业化生产又比较容易,并且容易给人以安全感,投入 到食品添加剂和医药的应用中去比较容易获得 批准。 114 微生物发酵法 聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细 胞的表面。用固体培养这些细菌时, 聚唾液酸是以 夹膜的形式附于细胞表面;用液体培养时, 聚唾液酸 以粘液的形式释放到发酵液中。聚唾液酸进行酸水 解或酶水解后,分离纯化可得到唾液酸, 这为制取唾 液酸类药物提供了工业化基础。 1988年, L1B Rodriguez- Aparicio等 [22]利用大肠 杆菌 K- 235发酵生产聚唾液酸产量为 1350mg/L。 郭良栋等 [ 23]用大肠杆菌 C- 8发酵生产聚唾液酸, 产 量为 1200mg/L。詹晓北等 [ 24]用大肠杆菌 K235发酵 生产聚唾液酸和唾液酸, 聚唾液酸的产量达到 3500mg /L。微生物发酵属于生物化学过程, 所用原 料相对低廉, 因而在唾液酸的生产中占据了重要的 位置。国外关于唾液酸的研究很多, 但是主要都是 关于唾液酸及其衍生物生物生理活性的研究。我国 对唾液酸生产的研究起步较晚, 研究主要是关于高 产唾液酸菌株的选育 [ 25] , 培养基优化以及从猪血 [ 20] 和蛋黄 [26]中提取。 2 唾液酸的分离纯化 从不同原料中分离提取唾液酸的方法各有不 同, 但主要包括唾液酸的释放, 采用离子交换层析和 凝胶过滤层析分离和利用 HPLC纯化等步骤。 由于水解过程的简便和有效使得许多实验室选 择了这种方式,尽管它们常常破坏某些碳水化合物。 在 80e 条件下用 2mol /L三氟乙酸 ( TFA)水解能够 使所有的唾液酸链断裂并使这些残基脱酰脱羧 化 [27]。因此,总的唾液酸含量可以通过测定该步产 生的氨基酸的量来确定。最佳水解时间为 2h, 而有 些破坏则取决于水解时间。这里, 必须要指出的是 处理唾液酸标准样品的所有水解程序应在同样条件 下进行。该步骤中从糖蛋白中分离的氨基糖的数目 是很少的 ( < 10% ) [1]。为避免己糖和氨基糖的干 扰, 干燥的水解物在 Dowex 50 @8(H + )和 Dowex1 @8 (HCOO- )柱上进行离子交换层析 [ 28]。这一步保证 了衍生化和 RP- HPLC的顺利进行。但我们最近发 现如果采用毛细管电泳定量, 则必须将唾液酸水解 后用截留分子量为 3kDa的膜进行超滤以去除大 分子 [ 29]。 大多数水解步骤的目的是为了回收两种类型的 唾液酸 ) ) ) N- 乙酰基神经氨酸和 N- 羟乙酰神经氨 酸。在弱酸性条件下 ( 25~ 100mmol/L的无机酸 )唾 液酸保留其羧基和 N- 酰基基团。在水解程序中关 注的焦点是碳水化合物受到最小的破坏和唾液酸的 最大释放并且许多研究都关注这些条件的优化。经 过认真研究各种水解条件后, 有人建议在 80e 条件 下用 25mmol/L盐酸或 TFA水解 2h[ 4]。尽管采用这 些酸水解糖蛋白 2h,都将导致 20%的钙流失,但这能 保证唾液酸链的完全水解 [30]。 370 总之,水解是一种提取唾液酸残基的有效方法, 但释放和破坏之间的平衡应达到最优化。采用唾液 酸苷酶来酶解可以避免损失。然而, 仅用唾液酸苷 酶处理不可能从生物样品中释放所有的唾液酸。因 此,酸处理可能在优化神经氨酸酶处理的方法方面 提供更好的解决方法和 /或可能的帮助 [31]。在 O-乙 酰基团已经被去除和酶具有广泛的连接特异性的条 件下,神经氨酸酶处理可能为样品唾液酸含量提供 一个准确的评价。合适方法的选择也应该考虑后面 的分析步骤,如断裂后样品的衍生化,必须谨慎考虑 溶液组分是否会干扰衍生化反应。 血清中唾液酸的分离主要包括:先用两体积 pH 为 10 的饱和硫酸铵沉淀, 随后用预先装好的 Sephdex G- 25凝胶柱层析, 收集组分。通过这一步, 大约有 9815%的总唾液酸被回收作为 de- O- 乙酰化 衍生物 [ 28]。同样, 未经预处理血清的直接水解已经 报道。组织样本中唾液酸的分离主要包括:组织样 本先在 0e 水中均质化, 然后对水溶性唾液酸大分子 离心,则唾液酸上清液中可定量回收 [ 28]。 1996年,高剑峰和冯万祥 [29]从猪血液中用阴离 子交换树脂采用梯度洗脱的方法对唾液酸进行了提取 及纯化。1999年,钱世钧等 [ 25]将水解后的产物, 用氨 水调 pH至 410, 随即上阴离子交换树脂 (Dowex1- x8) 柱,在用 3~ 5倍床体积蒸馏水洗脱后,用 0~ 2mol /L甲 酸进行梯度洗脱,收集含唾液酸的洗脱液。 3 唾液酸的检测 尽管有许多方法可以用于唾液酸的分析, 但将 它们用于生物样品中唾液酸的分析仍是一项艰巨的 工作。分光光度法和酶反应、抗体、凝集素以及病毒 已经用于确定总唾液酸含量或检测特定类型的唾液 酸 [ 32]。苔黑酚、间苯二酚、定期 /硫代巴比妥酸和定 期酸 /甲基- 3- 苯并噻吩腙比色法多年来已广泛用于 唾液酸的检测 [33]。这些方法的共同局限是它们无法 区分唾液酸的类型并且要求净化的样品以避免来自 其他脂类污染物的干扰。改进后的唾液酸丙酮酸裂 解酶系统也已经用于酶法检测唾液酸, 而各种特异 性不同的抗体同样也成为免疫荧光, 免疫组化甚至 薄层色谱的免疫染色研究中不可缺少的工具。来自 于动植物的凝集素也已被用作唾液酸残基及其天然 衍生物检测的探针。 然而,分析技术的稳定和完善,如高效液相色谱 (HPLC)、气相色谱 ( GC)和质谱 (MS)的联用、红外 光谱、紫外光谱 (UV)、核磁共振光谱 (NMR)和毛细 管电泳技术 ( CE )的使用使得我们对不同酰基化模 式唾液酸的结构有了更加明确的阐释。 311 分光光度法 31111 硫代巴比妥酸法 游离唾液酸被过碘酸氧化 生成 B- 甲酰丙酮酸, 后者与 2-硫代巴比妥酸反应生 成有色物质,在 549nm处有最大吸收峰 [34]。 31112 R- 试剂法 可以测定 10~ 30Lg结合或游离 的唾液酸,甚至降低半量也可用此法测定 31113 间苯二酚- 过碘酸 /盐酸法 由于过碘酸氧化 以酮苷形式结合的唾液酸生成结合的醛, 后者可与 间苯二酚生成很强的颜色,其最大吸收峰在 630nm。 NeuNAc及 NeuNG的克分子消光系数各为 27900及 27000,比单独用间苯二酚的灵敏度要高三倍, 而且 由酮苷结合的唾液酸生成的醛 37e 经过碘酸进一步 氧化时是稳定的, 由游离唾液酸生成的醛则被破坏, 而后者在 0e 是稳定的, 根据上述特性可以测定结 合、游离及总唾液酸量。本法的不足之处是一些神 经节苷脂由于有 NeuNAc( 2- 8)NeuNA连接能耐受 过碘酸的氧化。此外, 唾液酸的 C8 上如有三碳的侧 链取代基时则过碘酸不能和该化合物发生反应 [ 35]。 312 HPLC法 唾液酸的色谱分析主要包括采用 RP- HPLC检 测无标记的唾液酸和荧光 HPLC检测唾液酸的衍生 物。 2006年,黄华军等 [36]利用酸水解释放奶粉中与 蛋白质结合状态的唾液酸, 通过聚丙烯酰胺凝胶将 游离状态和低聚糖结合状态的唾液酸与糖类分离开 来。将得到的唾液酸在 Cu2+和 Cr3+协同催化下与间 苯二酚发生反应,生成的有色物质用乙酸丁酯- 正丁 醇萃取, 并在 615 /610nm处测定吸光度。2005年,陈 蕴等 [ 37]利用 ZORBAX SB C18 250 @416mm色谱柱;采 用流动相: pH 310的硫酸水溶液; 流动相流速: 110mL /m in;检测器: UV 210nm;进样量: 510LL。结果 表明,该法可以使唾液酸的单体和二聚体得到很好 的分离, 唾液酸单体的纯度达到 98%以上。 2008年, 冯君等 [38]采用 RP- HPLC法, 以邻苯二胺盐酸盐 (OPD)为衍生化试剂测定了牛奶中与蛋白质结合的 唾液酸含量并初步揭示了其动态变化规律, 回收率 为 90%~ 107% , RSD为 112%。 313 薄层层析法 展开剂:正丙醇 B饱和氨水B水 = 6B1B215;显色剂: 间苯二酚- 盐酸试剂 (与唾液酸分析试剂相同 )。将 点好样品的层析板置于盛有展开剂的层析缸, 密闭 式展开, 溶剂前沿距层析板上端 1cm时取出, 在室温 下挥发干,用喷雾器喷洒显色剂,再在 110e 烘箱显 色, 待层析板呈现蓝紫色斑点取出。 4 唾液酸的代谢 411 唾液酸的生物合成 唾液酸的主要代谢途径已经十分清楚 [ 39]。唾液 酸在胞浆内的生物合成是在核内唾液酸的激活下始 于葡萄糖,它们被一个特殊的载体转运进入高尔基 体并在转-高尔基网内被转移到糖复合物上, 接着唾 液酸化的糖复合物通过液泡转移到浆膜。这一过程 的关键酶是差向异构酶转换 UDP- N- 乙酰葡萄糖胺 N-乙酰甘露糖胺- 6- 磷酸 [40]。去磷酸化后, 游离的 单糖被核内的 CMP糖苷活化。CMP- Neu5Ac在胞浆 内按 En途径被 CMP- Neu5Ac羟化酶修饰为 CMP- Neu5Gc, 而其他的修饰如不同的 O- 乙酰化和 O- 甲 基化则发生在高尔基体部分。唾液酸的循环通过液 泡的糖复合物吸收而进入细胞, 唾液酸的释放主要 是取决于溶酶体内唾液酸酶的活性。当它们转运进 胞浆就与细胞核内的 CTP反应,而后者则与降解相 关的唾液酸化丙酮酸裂解酶 (产生丙酮酸和 ManNAc)竞争。 371 412 唾液酸的降解 唾液酸的降解通常由细胞间和细胞内唾液酸酶 水解唾液酸开始。由于大量的唾液酸酶系的存在, 包 括来自于病毒,细菌,原核生物和动物。这些酶的一般 特征是含有大约 12个参与催化的氨基酸, 2个主结构 ( / ASP盒0和一个 FR IP区 )和一个 6叶螺旋桨结构。 由于某些改性的唾液酸或多或少地抑制了酶的水解, 这些抑制成分必须在唾液酸酶作用前采用特定的酶去 除,如许多组织中的 O-乙酰化基团必须采用相应的脂 酶去除 [ 41]。细胞膜上糖蛋白半衰期的研究表明,末端 的唾液酸伴随有半乳糖、N- 乙酰半乳糖胺和岩藻糖残 基,比基本核心糖苷和肽骨架表现出了更快的转换速 率。这表明至少部分糖复合物经细胞表面通过高尔基 体回到细胞表面而被再次唾液酸化 [42]。 5 唾液酸的生物学意义 511 唾液酸的生物学活性 唾液酸的生物学活性基本上可以分为 3类:唾 液酸本身作为被识别的受体作用、细胞之间的信息 传递和通过阻止或减弱细胞或分子对其特异性识别 部位的接触所起的掩蔽作用。在分子和细胞之间、 细胞和细胞之间、细胞和外界之间, 糖链末端的唾液 酸既可以作为识别位点,也可以掩蔽识别位点。研 究还发现细胞在生长、分化、衰老、恶变等过程中,常 伴有表面复合糖的变化。实验发现, 新生细胞中唾 液酸的含量要明显高于衰老的细胞。用唾液酸酶处 理过的细胞注入机体后会在几小时内死亡, 而正常 细胞的寿命却为 120d, 这说明唾液酸参与了细胞生 命周期的调控。唾液酸作为复合糖的组成部分, 其 所带的负电荷赋予细胞和许多复合糖带负电的性 质,这是细胞兴奋性的基础,也是防止红细胞聚集的 一个重要因素。作为一个亲水、酸性的较大分子,唾 液酸影响其所连接糖链及其周围分子的理化性质。 唾液酸基稳定糖链和糖缀合物中蛋白部分的构象使 糖蛋白有较高的热稳定性和不易发生蛋白水解, 从 这方面来讲,唾液酸化糖链模拟了分子伴侣的作用。 粘液糖蛋白因高度唾液酸化而呈负电性, 溶液粘度 较高,从而起到润滑、湿润和保护作用 [43]。此外, 研 究还发现细胞表面唾液酸含量与细胞恶性程度有 关,即细胞膜表面唾液酸含量高的肿瘤细胞, 肿瘤的 转移性也高。 研究发现流感病毒的发生和传播与宿主细胞表 面的唾液酸有关。因为流感病毒 A和 B能够识别宿 主细胞表面的糖分子 ) ) ) 唾液酸, 这样才能诱导宿 主细胞吞食病毒, 而流感病毒 C则能够专一性地识 别 Neu5, 9Ac2,使病毒基因进入细胞内进行繁殖。受 侵染的细胞内成熟病毒颗粒的释放则需要唾液酸酶 去除表面的唾液酸, 这样病毒粒子就可以自由转移 到其他细胞中,引起感冒的发生。因此, 通过干扰唾 液酸就可以干扰和阻止感冒病毒的复制, 达到预防 和治疗流感的目的。 唾液酸衍生物 Sialyl Lew isX 作为重要的抗粘附 药物, 能够识别白细胞表面的 Sia lyl Lew isX,并与之结 合进而有效地阻止白细胞的过量聚集, 治疗类风湿 性关节炎、脓毒性休克等疾病 [ 8]。 Sialyl Lew isX 及其 衍生物还与癌细胞的粘附和转移有关。同时, 唾液 酸对于治疗中心和外周神经性疾病以及脱髓鞘病也 有疗效 [44]。此外, 单唾液酸神经节苷酯对于治疗脑 缺血、帕金森症、A lzheimer症和神经创伤也有一定功 效。由于唾液酸在细胞表面的位置保护了大分子和 细胞免受酶和免疫的攻击并促进了内在免疫, 使得 细胞作为 /自我 0而防止免疫系统的激活。糖缀合物 末端的唾液酸能有效地阻止细胞表面上一些重要的 抗原位点和识别标记, 从而保护这些糖缀合物不被 周围的免疫系统识别和降解。微生物 /恶性细胞已 经通过其细胞表面的唾液酸化利用了这一现象, 从 而受到人和细胞免疫系统的保护。唾液酸的衍生物 Siastatin B具有抗人自身免疫缺陷病毒作用,可以用 于治疗艾滋病 [ 45]。 512 唾液酸对进化的影响 真核细胞表面存在的大量以单糖为末端的糖复 合物是高等动物生长和生命的关键。在老鼠生长的 早期抑制唾液酸的生物合成是致命的, 通过钝化 (借 助于基因靶向 )UDP- N- 乙酰葡萄糖胺- 2- 差向异构 酶 /N-乙酰甘露糖胺激酶 ) ) ) 唾液酸合成的关键酶, 在长的链式反应中催化 2步 [40]。尽管我们了解了一 些关于唾液酸的生物学作用, 然而其在机体中确切 的功能还没有阐明。上面提到的唾液酸通常只在早 期的棘皮动物后口谱系被发现。Neu5Gc在棘皮动 物、鱼和大多数哺乳动物中被广泛合成, 但在许多鸟 类、爬行动物和两栖动物,特别是人类中却没有。似 乎是由于不同的唾液酸在结构和生理活性方面优于 细胞表面上的其他酸性糖类如硫酸化的单糖和磷酸 化的单糖。因此, 唾液酸可能更适合不同的细胞接 触以调节组织分化进而促进了高等动物的进化。它 们可能更好地促进免疫系统, 不仅是固有的防御机 制, 也使免疫系统具有更高的适应性。这可能增强 了动物在与持续变化的环境抗原之间竞争中生存的 机会,有助于其更好地适应更加独立的生活或者成 为新的顶端生物的征服者。 人唾液酸结核性免疫球蛋白样凝集素 ( siglec)- 9 在粒细胞和单核细胞中都有表达。 Angata 和 Varki[ 42]发现这种凝集素基因位于染色体上, 伴随着 5个其他的唾液酸结核性免疫球蛋白样凝集素。这 种胶束的存在表明这些基因出现是因为在脊椎动物 进化过程中的某个时间出现了基因复制的重复。这 些重复的事件可能成为不同细胞类型新的特殊功 能。尽管从线虫到人的某些 Ig超家族基因是高度保 守的,但 siglec仅在后口动物谱系中被发现, 这表明 在进化过程中, 它们的出现取决于唾液酸在后口动 物中的连续表达。 哺乳动物进化过程中, siglecs与相关唾液酸结合 的专一性是非常灵活的。来自于鼠的 CD22更易于 与 Neu5Gc结合,来自于黑猩猩和人的 CD22能够被 Neu5Gc和 Neu5Ac识别 (Brinkman- Van derL inden et al1, 2000) [43]。在原始人进化过程中与 Neu5Gc的缺 失平行的是 CMP- Neu5Ac羟化酶蛋白氮端的缺失, 372 这可能与 Neu5Gc在人体内的生物合成有关。现代 的猩猩与人在基因序列的同源性上超过 98% (Muchmore, 2001 ) [44], 这些大猩猩仍然表达活性 酶- Neu5Gc,这被认为是唯一已知的人和黑猩猩的主 要化学不同。 大约 250万年前, 由于流感病毒插入人类羟化 酶的基因而导致了人类羟化酶活性的消失。 Hayakawa等 ( 2001) [ 45]认为病毒引起羟化酶基因的 钝化导致了 Neu5Gc表达的缺失, 这可能是由于受到 病原体调节选择的影响。具有挑战性的任务是这一 事件是否影响了人类的快速进化,特别是人脑, 很可 能有两条途径:第一, 同其他部位相比,哺乳动物脑 通常会产生相对少的 Neu5Gc。单糖的完全消失可 能有利于神经在某些还没有被理解的方面的生长和 复杂化。第二, Neu5Gc的缺失可能为人类提供了从 迁徙到定居并开始饲养动物为家畜的能力 [ 46]。 通常,唾液酸在人类和猩猩的组织中是以 A- 2, 3和 A- 2, 6键存在的, 唾液酸在猩猩的组织中主要 是借助于 A- 2, 3键来连接的, 而在人的组织中则主 要是借助于 A- 2, 6键来连接 [ 47]。唾液酸连接键的这 种变化大约发生在 1200万年前的古猿进化过程中, 很可能此后猩猩 /人共同的祖先发生了分化。 随着人们对唾液酸及其衍生物作用和功能了解 和认识得越来越多, 其在食品、保健品和医药上的应 用有着日益广阔的发展前景。美国 Neose医药公司 目前正在研究用唾液酸抗粘附药物来对付幽门螺旋 杆菌以治疗胃溃疡和十二指肠溃疡 [ 13]。研究发现唾 液酸在脑中的含量很高, 它能够促进神经细胞的分 化、发育和再生, 参与突触的传递, 参与记忆和学习 功能。婴幼儿自身合成的唾液酸并不能满足其机体 的需要,研究发现可以通过饮食补充外源性唾液酸 以增加脑部唾液酸含量。美赞臣公司也在其配方奶 粉中提高了唾液酸含量, 使其更接近母乳的黄金标 准 [ 48]。日本太阳化学公司的蛋黄唾液酸低聚糖是用 蛋黄制取的一种功能性碳水化合物, 可作为婴儿的 食品配料和营养增补剂。 4- 胍基- Neu5Ac2ene对流 感病毒唾液酸酶有强烈的抑制作用 ( Kd 约为 10- 10mol/L),从而有效地抑制流感病毒在体内的扩 散 [ 49]。目前,以唾液酸为母体化合物进行流感病毒 抑制剂的研究已成为抗流感药物研究的热点, 已有 两种治疗效果较好的药物扎那米韦 ( zanam ivir,商品 名 Relenza)和奥司米韦 ( oseltam ivir,商品名 Tam iflu) 上市 [45]。英国的 L ipoXen公司临床实验了聚唾液酸 化干扰素,发现其效果比 PEG化的干扰素的半衰期 更长 [50]。最近, L ipoXen公司与印度血清研究所 ( Serum Inst itute of Ind ia LTD1)合作生产聚唾液酸, 并 且获得 550万美元的风险资金用于开发治疗糖尿病、 肺炎球菌感染和丙肝药物的聚唾液酸控释的药物。 6 结束语 尽管关于唾液酸的研究才刚刚起步, 但由于它 们生物学功能的多样性, 使得它们成为近年来的研 究热点。随着关于唾液酸基础和应用研究的进一步 深入,由唾液酸及其衍生出来的药物或者其他产品 将会不断出现并造福人类。 参考文献 [ 1]Landste iner G, Leuene A J1Biol Chem [ J], 1927, 39: 691 [ 2] K lenk E, Fa lillard H Z1Physiol Chem[ J], 1935, 298: 2301 [ 3] G1Blix A Gotscha rlk, E K lenk1Proposed nomenclature in the fie ld of neuram in ic and sia lic acid[ J]1Nature, 1957, 179: 10881 [ 4] Gwo- Jenn Shen, Arun K Datta, Masayuk i Izum ,i et a l1 Expression of A - 2, 9 /A - 2, 8 - polysialyltransferase from E scherichia coli K92 [ J ] 1 J B iol Chem, 1999, 274 ( 49 ): 35, 139- 461 [ 5]R Schauer1V ic torG insburg. s in fluence onmy resea rch of the role of sialic acids in b iolog ica l recogn ition [ J]1ABB, 2004, 426: 132- 1411 [ 6] Adr iana E Manz,i H erman H H iga1 Intramolecu lar self- c leavage of polysialic acid [ J] 1 J B iol Chem, 1994, 269 ( 38 ): 23617- 236241 [ 7] M ichae l F Czarn ieck i1 Carbon - 13 Nuc lear Magnetic Resonance Spin- Latice1R e laxa tionin the N- Acyleneuram inic Ac ids1Probes for Inte rna l Dynam incs and Con firmationa l Ana lysis [ J ] 1 Journa l of the Amer ican Chem ica l Soc iety, 1977, 99 ( 12): 251 [ 8]于军华 1聚唾液酸生产菌种的选育及其发酵工艺的研究 [D]1江南大学, 2002: 11 [ 9] Barry G T, Goebe l W F1Colom in ic acid, a substance of bac teria l organ ic re lated to sia lic ac id [ J] 1Na ture, 1959, 179: 2061 [ 10] Meind M, Wu W, Kok GB, et al1Ra tioa l design of poten t sia lidase- based inhib itors o f influenza virus replication [ J] 1 Nature, 1993, 363( 3): 418- 4231 [ 11] Ethan S S imon, Mark D Bednarsk,i George M Wh itesides1 Synthes is ofCMP- NeuAc from N- A cetylgulcosam ine: Generation of CTP from CMP Us ing Adenylate K inase [ J]1J Am Chem Sac, 1988, 110( 21): 7159- 71631 [ 12] Isafum ima ru, Jun Ohnish,i Y asuh iro ohta, et a l1Why Is Sia lic Ac id Attracting Interest Now Comp le te Enzymatic Synthesis of Sia licA cid w ith N- Acylglucosam ine 2- Ep imerase[ J]1Journa l of B iosc ience and B ioscience, 2002, 93( 3): 258- 2651 [ 13]Konosh in Onode ra1S ia lic ac id and re lated substances[ J] 1 Agr B iol Chem, 1966, 30( 11) : 1170- 11721 [ 14] Lekh Ra j June ja, Mamoru Koketsu, e t al1Large- sca le prepara tion of sialic ac id from cha laza and egg- yolk membrane [ J]1Carbohydra te Research, 1991, 214: 179- 1861 [ 15]M W Wh itehouse, R Z illiken1Isolation and De term ination of Neuram in ic ( sialic) ac ids[ J]1Methods of B iochem ical Analysis, 1960, 8: 199- 2181 [ 16]Masska rn Shima tan l1Process formanufacturing sia lic acids- con taining composition [ P ] 1Un ited States Patent: 5, 270, 462, Dec114, 19931 [ 17]冯万祥, 洪麟, 冯启浩 1猪血中唾液酸的分离纯化工艺 [ J]1医药工业, 1987, 18(8) : 342- 3431 [ 18]高剑峰, 冯万祥 1血液中唾液酸的提取和结晶纯化 [ J]1 中国医药工业杂志, 1996, 27( 6): 246- 2471 373 [ 19] E V imr, S Steenbergen1Biosynthesis of the polys ia lic ac id capsule in EcoliK1 [ J]1Journa l of industr ialM icrob iology, 1995, ( 15) : 352- 3601 [ 20]郭良栋,钱世钧, 叶军, 等 1产多聚唾液酸的菌种筛选及 产酸条件 [ J]1微生物学报, 1998, 38( 2): 103- 1071 [ 21] Zhan XB, Zhu L, W u JR, et al1Production of polys ia lic ac id from fed2batch fermentation with pH control[ J]1Biochem Eng J, 2002, 11: 201- 2041 [ 22]钱世钧,李剑, 高建梅, 等 1从大肠杆菌 C- 8制备和纯化 唾液酸 [ J]1微生物学报, 1999, 39( 2): 178- 1801 [ 23]仇英海 1鸡蛋黄粉中唾液酸的提取 [ D]1江南大学硕士学 位论文, 2002: 31- 371 [ 24] E Makatsor,i N K Karamanos, E D Anastassiou, et a l1 Re lated Technol[ J], 1998, 21(19): 30- 311 [ 25] T T segen id is, N K Karamanos1Re la ted Technol[ J], 1998, 21 ( 6): 7931 [ 26] K Stroussopoulou, M Militsopou lou, K Stagiann is, et a l1 Biomed[ J]1Chromatogr, 2002, 16( 2): 1461 [ 27] N K Karamanos, B W ilkstrm, C A Antonopou los, et a l1 Ch roma togr[ J] , 1990, 503: 4211 [ 28] A K luge, G Reuter, H Lee, et a l1Eur J Ce ll B iol[ J], 1992, 59 ( 1): 121 [ 29] P A S iskos, M H E Spyridaki1 J Chromatogr [ J], 1999, B724: 2051 [ 30] D S inha, M Cha tter jee, C Mandal1Trends G lycosc i [ J] 1 G lycotechno,l 2000, 12( 63): 171 [ 31] Reute r G, Schauer R1Methods in enzymology[M ]1Lennarz W J San Diego: Academ ic P ress, 1994, 230: 168- 1991 [ 32] Svenner L1Bioch im B iophys ACTA [ J], 1957, 24: 604- 6111 [ 33]黄华军,奚星林, 吴宏中, 等 1奶粉中唾液酸的测定方法 [ J]1分析测试学报, 2006, 25( 4): 129- 1311 [ 34]陈蕴,赵慧, 詹晓北,等 1唾液酸单体的 H PLC测定及其在 唾液酸纯化中的应用 [ J]1分析测试学报, 2005, 24( 2): 80- 821 [ 35]冯君,李宏基, 韩立强, 等 1牛奶中唾液酸含量的动态变 化规律研究 [ J]1食品科技, 2008( 4): 85- 871 [ 36] Traving C, Schauer R1Structure, func tion andmetabolism of sia lic ac ids [ J]1Ce llMol Life Sc,i 1998, 54: 1330- 13491 [ 37] Schauer R, Reuter G, Stoll S1S ia late- O- acetylesterases- key enzymes in sia lic ac id ca tabolism [ J]1Bioch im ie, 1988, 70: 1511- 15191 [ 38] Reutte r W, Tauber R1 Turnover of plasma membrane glycoproteins from live r and hepatoma1GANNMonogr[ J]1Cancer Res, 1983, 29: 59- 651 [ 39] K re ise lW, H ildebrand H, MossnerW, et a l1O ligosacchar ide reprocessing and recycling of a cell surface glycoprotein in cultured rat hepatocytes [ J] 1Biol Chem H oppe- Seyler, 1993, 374: 255- 2631 [ 40] V ark i A, Cummings R, Esko J, et a l1 Essen tia ls of glycobiology [M ] 1New York: Cold Spr ing H arbor Laboratory P ress, 19991 [ 41]W Graeme Lever, Norbert Dischofberger, RobertW ebste r1 Cracking the F luvirus [ J] 1Sc ience America, 1999, 248 ( 4 ): 28- 341 [ 42] Angata T, Va rki A1 Clon ing, characteriza tion, and phylogenetic ana lysis of Siglec- 9, a new member of the CD33- re la ted group of siglecs [ J] 1 J B iol Chem, 2000, 275: 22127 - 221351 [ 43] Br inkman- Van der L inden E CM, S jobe rg E R, et a l1Loss ofNglycolylneuram in ic ac id in human evolution [ J]1J B iolChem, 2000, 275: 8633- 86401 [ 44] Muchmore E A1Chimpanzee mode ls for human disease and immunob iology [ J]1Immunol Rev, 2001, 183: 86- 931 [ 45] H ayakawa T, Sa tta Y, Gagneux P, et al1A lu- med iated inactiva tion of the human CMP - Nacetylneuram inic ac id hydroxylase gene [ J] 1Proc Natl Acad Sc,i 2001, SA 98: 11399 - 114041 [ 46] Vark i A1Loss of N- glycolylneuram in ic acid in humans: mechan isms, consequences, and imp lications for hom inid evolution [ J]1Yearbook Phys Anthropo,l 2001, 44: 54- 3691 [ 47] R Schaue r1S ia lic ac ids: fascinating sugars in h igher an ima ls andman [ J]1Zoology, 2004, 107: 49- 641 [ 48]Muhsin Ka rim, B ingW ang1Is sia lic ac id in m ilk food for the bra in [ J ] 1Perspectives in Agr iculture, Veter inary Sc ience, Nutr ition and Resources, 2006, 18( 1): 1- 111 [ 49] PeggM S, Itzste in M1Slow- b ind ing inh ib ition of sia lidase from influenza virus [ J]1Interna tiona l B iochem istry andMolecular B iology, 1994, 32: 851- 8581 [ 50]H art G J, Bethe ll R C12, 3- D idehydro- 2, 4- d ideoxy- 4- guanidino- N- ace ty-l Dneuram inic acid (4- guanidino- Neu5Ac- 2en) is a slow- bind ing inhib itor of sialidase from influenzaA and influenza B virus [ J] 1 Biochem istry and Molecular B iology Internationa,l 1995, 36: 695- 7031 (上接第 367页 ) [ 12] W elscher Y M, Nape l H H, M ir iam M B, et al1Natamyc in b locks fumga l growth by b ind ing specifically to ergosterol w ithout permeab ilizing themembrane[ J]1Journal ofB iologica l Chem istry, 2008: 1- 231 [ 13] 姚自奇,庄艳玲, 温凯, 等 1纳他霉素在酸奶制品中的应 用 [ J]1中国食品添加剂, 2007( 1): 168- 1711 [ 14] 李红卫,冯双庆, 赵玉梅 1冬枣保鲜技术初探 [ J]1山西农 业科学, 1999, 27(2) : 65- 671 [ 15] 李丽梅,及华, 冯云宵, 等 1冬枣采后生理变化研究进展 [ J]1保鲜与加工, 2006, 33( 2): 12- 141 [ 16] 王建国, 姜兴印,张鹏 1纳他霉素对冬枣浆胞病菌的毒力 及保鲜生理效应研究 [ J]1农药学学报, 2006, 8(4): 313- 3181 [ 17] 杨德山, 骆健美,徐广宇, 等 1纳他霉素防治苹果贮运期 病害的初步研究 [ J]1中国植保导刊, 2006( 10): 11- 131 [ 18] 姜爱丽, 胡文中,田密霞, 等 1纳他霉素在草莓保鲜中应 用的研究 [ J]1食品科学, 2007(12): 515- 5201 [ 19] 孙微, 刘松涛 1纳他霉素在派类食品中防霉保鲜的应用 [ J]1食品工业, 2005( 6): 33- 341 [ 20] 娄捷嘉, 袁秋萍,钟增伟, 等 1乳酸链球菌素和纳他霉素 在月饼保鲜中的应用 [ J]1粮油食品科技, 2006( 6) : 62- 651