利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

L生ErITI，热I带BIOT术ECHN通OLOG讯Y⋯V01．2—1～No．1一J—an．，2⋯010一rITrERSIN ． · ．， doi：10．3969／j．issn．1009-0002．2010．01．001 利用细菌人工染色体 条件型敲除 同源重组对小鼠基因进行 研究报告 王立良1，王淼2，王浩3，张玉建4，刘勇1，邵一鸣1 1．中国疾病预防控制中心性病艾滋痈预防与控制中心，北京100176；2．UniversityofPennsylvania，Philadelphia， PA19104-6160，USA；3．BaylorCollegeofMedicine，Houston，"IX77030，USA；4．MDAndersonCancerCenter， UniversityofTexas，Houston，Texas77030，USA [摘要】 目的：探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法，提高条件基因 敞除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法：利用作者自己构建的噬茵体重组酶系统，通过BAC同源重组进行条件型基 因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒。线性化后。打靶片段经电穿孔法 转入大肠杆菌内，与相应的BAC同源重组，再经过三步同源重组和一步位点特异性重组，构建小鼠条件型基因敲除 载体。结果：高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论：通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载 体，为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路，并为FLox小鼠的建立，及相应基因在发育、生理、致病机制等方面 的功能研究奠定了基础。 [关键词】细菌人工染色体；同源重组；条件型基因敲除；打靶载体；Flox小鼠 [中图分类号】Q789 [文献标识码】A [文章编号】1009—0002(2010)01-0001—06 ConditionalKnockoutConstructforMouseGenebyBacterialArti- ficialChromosomeHomologousRecombination WANGLi-Lianga,WANGMi毋，WANGH毋，ZHANGYu-Jian4,LIUYoR窖，SHA0Yi-Minga 1．NationalCenterforAIDS／STDControlandPrevention，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Bei． ijng100176，China；2．UniversityofPennsylvania,Philadelphia,PA19104-6160，USA；3．BaylorCollegeof Medicine，Houston,TX77030，USA；4．MDAndersonCancerCenter,UniversityofTexas，Houston，TX77030， USA 【Abstract】Objective：TodevelopaneffectivewayofmakingconditionalknockoutconstructandFloxmicefor genefunctionstudy，anovelstrategywasexploredbyusingbacterialartificialchromosome(BAC)-basedhomologous recombination．Methods：TheconditionalknockoutvectorwasmadebyBACrecombinationusingourlambdaphage recombinasesystem．Aseriesofplasmidswithhomologousarnl$wereconstructed，andlinearizedtargetfragments wereelectroporatedintoE．coliandrecombinedwithcorrespondingBAC．Threehomologousrecombinationstepsand onesite-specificrecombinationstepwereusedforconditionalknockoutvectorconstruction．Results：Aconditional knockoutvectorwithtargetedmousegeneflankedbytwoloxPsiteswassuccessfullyconstructedwithhJigheffi— cieney．Conclusion：AnovelstrategybasedonBAChomologousrecombinationisdevelopedtoeffectivelygenerate conditionalknockoutconstruct．Themethoddescribedhereallowsproducingconditionalknockoutmice(Floxed mice)easilyaccomplishedandfacilitatesgenefunctionstudyindevelopmentordisease． [Keywords】bacterialartificialchromosome；homologousrecombination；conditionalknock-out；targetingvector；, FIOXmouse 细菌人工染色体(bacterialartificialchromo- some，BAC)是1992年以来发展起来的一种新型克 隆载体，被广泛用于构建人、动物、植物基因组DNA 大片段插入文库，在基因组的实施中所起的作 用是空前的。BAC在文库构建中具有转化效率高、 插入片段大(通常100—300kb)且容易回收、在宿主 细胞中插入片段稳定性好从而嵌合体少等优点。本 [收稿日期]2009—07—20 [作者简介]王立良(1972一)，男，博士，副教授， (E-mail)wangliliang@yahoo．coin 万方数据 2 生惑sI带术通讯⋯．21～．1J．，2010LE BIOTECHNOLOGYVol21NoJan 10mRSIN · -l·， 世纪初发展起来的细菌人工染色体同源重组技术 (homologousrecombination．recombineering)J1-61，对于 基因的功能研究起了非常重要的推动作用17-问。 小鼠基因敲除是20世纪80年代后期创立的 一项技术，在对基因功能、发育生物学和疾病的研 究中发挥了重要作用，是目前基因功能研究的金标 准。很多基因经传统敲除方法敲除后常常导致小鼠 胚胎早期死亡，或出生后不久死亡，从而很难对目 的基因的功能进行充分研究。对于没有致死效应的 基因的研究，传统型基因敲除仍然有很不利的方 面，如由于一个基因通常在很多组织中表达，因此 很难判断目的基因敲除后产生的表型效应究竟是 原位病变还是继发性病变，有可能产生假象甚至是 错误结论。因此，引入的以Cre／loxP或Flp—Frt位点 特异性重组系统为基础的条件型基因敲除(condi— tionalknockout，cKO)策略受到研究者的广泛欢迎。 传统的条件型基因敲除载体的构建非常繁琐，由于 需要筛选基因组文库(这是很繁重的工作)，以及多 步亚克隆步骤，涉及很多不利的限制性内切酶选择 和操作问题，整个构建过程费时费力，对于技术熟 练的研究者而言通常也需要6个月甚至1年以上 的时间。由于特殊的原因，在构建过程中一些片段 甚至无法连接成功，会导致历时1—2年的构建工作 失败；或者构建的载体不能在胚胎干细胞(ES细胞) 中成功进行同源重组而被迫放弃，使得无法得到某 些基因敲除小鼠或条件型基因敲除小鼠(Flox小 鼠)。 BAC同源重组用于cKO的构建改变了传统条 件型基因敲除载体构建的观念，仅仅需要几步亚克 隆，而且是在大肠杆菌内同源重组，因此很少涉及 内切酶，同时具有高度忠实性，整个过程相对高效 和快速。 Csrp2bp是一个新基因。传统的基因敲除将导 致Csrp2bp斗胚胎在E12前致死，无法对其功能进行 深入研究，因此须采用引入Cre／loxP等位点特异性 重组系统的条件型基因敲除方法。鉴于BAC同源重 组工程的种种优点，我们将之进行修改，使得通过 BAC同源重组构建条件型基因敲除载体更加容易 操作。由于机制的原因，RecA重组系统不适于条件 基因敲除的构建，在本研究中，我们采用Lambda噬 菌体Red重组酶系统进行同源重组操作，用以构建 Csrp2bp条件型基因敲除载体，以便研究Csrp2bp基 因的功能。 1材料和方法 1．1材料 质粒pLW—ret、pLW44A(Kan／Neo穿梭表达载 体，可在原核、哺乳动物细胞内表达)、pLW44B(含有 FRTNeoFRT—loxP)、pRed皆为作者自行构建；pCre 由WangJ．博士提供；Csrp2bpBAC克隆为Sanger 赠送㈣。各类限制性内切酶及修饰酶购自NEB公 司；raqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAmarker 分别购自Invitrogen和NEB公司；DNA提取试剂盒 及回收试剂盒购自Omega公司；氯霉素(Cm)、卡那 霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、庆大霉素(Gm)和 L一阿拉伯糖为Sigma公司产品；溶液I、Ⅱ、Ⅲ为 Omega公司产品。 生物信息学辅助设计软件Annhyb用于引物设 计，DNAuser用于序列对比与分析。 实验方法参见文献[4—5]，技术路线见图1。 1．2 BACDNA的提取 取过夜培养的BAC宿主菌2mL，8000r／min 离心1min收集菌体，用100IxL溶液I悬起；加入 200斗L溶液Ⅱ缓缓混匀，室温放置2—4min；加入 150ixL溶液Ⅲ缓缓混匀，冰浴5min；12000r／ min离心10min，取上清，加入450斗L异丙醇，混 匀；12000r／min离心10min，弃上清，用70％酒精 图l Csrp2bp基因条件型打靶载体的构建策略图 第一次同源重组引入第1个loxP，Cre／loxP佗点特异性重组删除筛 选标记，第一：次同源重组引入第2个loxP和Neo基因筛选标记．第 三次同源重组捕获修饰后的打靶区，最终获得了Csrp2bp基因的条 件型基因打靶载体 万方数据 王立良等：利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除 3 洗涤，干燥，用50“LTE溶解。 1．3 PCR扩增同源臂、回收、连接 扩增同源臂的PCR反应体系为：BACDNA0．5 p．L，10×LAPCR缓冲液5斗L，dNTP(2mmoL／L)5 斗L，引物(10斗moL／L)2¨L，LAraqDNA聚合酶 O．5斗L，H2035斗L，共计50¨L。PCR产物在l％的 琼脂糖胶上电泳分离，切割目的条带胶并称重，按 胶回收试剂盒的说明书纯化DNA。 第一次同源重组引入第1个loxP所用左臂上 游引物为GTAAGTCGACTYGAGTGTAlTIrrCGGTGG CACT(跗I)，下游引物为ATAAClflrCGTATAATG TA7rGCTATACGAA(疆TATCGCCCCCTGCTCACAC G；右臂上游引物为GGATAGTAGCATCCACCTGAG TG，下游引物为唧CCGCGGGAATCCCCACTCTG GTCGTG(SaclI)。分别用SalI、SacII酶切PCR产 物同源左右臂，分别连接到pLW44A(XhoI-EcoR V)、pLW44A(SmaI—SacII)上，Kan为筛选标记。 第二次同源重组引入第2个loxP所用左臂上 游引物为GTAAGTCGACGATGAAGGAGATGTGTCC TGG(So／I)，下游引物为GGGGTn～A仉～AG，mⅥ’ CAGAGACTGGAAAGAAGCCATCAC(PacI)；右臂 引物上游为AAAATAGACTGGAGTAGAAATATCAT CArrI'A，下游引物为GTAACCGCGGAAACAACTCC CAGAACCTGAA(SacII)。分别用So／I、SaclI酶切 PCR产物同源左右臂，分别连接到pLW44B(XhoI —EcoRV)、pLW44A(SmaI—SacII)上，Karl为筛选 标记。 第三次同源重组捕获打靶区获得最终载体(重 叠PCR)所用左臂上游引物P1F为唧G肌TCG AGGAAAAGGAAAAGATGGTG(XbI)，下游弓l物 PlR为GTCCAGCAAGC，I’I’ACCCTCTrCTGGAGTGT CTG(Hindm)；右臂上游引物P2F为AAGAGGGTA AGCTTGCTGGACCTCATGCTGTAAG(Hindm)，下游 引物P2R为G1TrGll盯CTGCAGCTAGGCGATCGGT CA肌G(BfI)。将PCR产物同源左右臂稀释至 1／1000，用P1F+P2R为引物进行融合PCR，产物用 石．jl口I、RfI酶切，连接到pLWret(XhoI-PstI)上， Amp为筛选标记。 挑取单菌落，接种到含100wg／mLAmp或50 斗g／mLKan的LB中，37℃过夜培养。用质粒提取试 剂盒(Omega)进行抽提，37"t2酶切0．5-2h，1％琼脂 糖凝胶电泳分析鉴定，阳性克隆经测序确保正确。 1．4同源重组 所有用于细菌同源重组的打靶载体均经XhoI 和SaclI双酶切，回收片段，用l％琼脂糖胶电泳分 离，按胶回收试剂盒说明书进行胶回收。 将pRed转化BAC宿主菌，涂布含Cm(12．5 斗g／mL)、Gm(30txg／mL)的LB平板，30℃培养过 夜。随机挑取1个菌落于含Cm(12．5斗g／mL)、Gm (30“g／mL)的LB中于30℃摇床过夜培养，以1：10 稀释后继续培养至D‰值为0．4-0．6，用0．35％的 L一阿拉伯糖诱导lh，随后制备电转化感受态细胞。 每个反应用50斗L感受态细胞、50ng线性化 DNA，在1．75kV、25wF、200Q条件下电转化，加 入lmLSOC后于30℃振荡1h进行同源重组，然 后涂布于含Kan(25斗g／mL)、Cm(12．5p,g／mL)、 Gm(30斗g／mL)的平板，30℃倒置培养20～24h。 1．5 同源重组后质粒的鉴定 挑取单菌落，接种到含Kan(25叫mL)、Cm (12．5斗g／mL)、Gm(30“g／mL)的LB中，30cc摇床 过夜培养。提取BACDNA，通过PCR方法筛选鉴定 重组BAC克隆。第一次同源重组鉴定所需引物分别 为CCTAl]盯CTGCCrI，rI’ACCTGATAG和GGATGCT ACTATCCATAACl，I'CG，第二次同源重组鉴定所需 引物分别为CCTCCCCCTGAACCTGAAAC和GTrA AAGATGAATrAAATTGTl’CAAATAGC。必要时用 EcoRI酶切BACDNA进行鉴定。 1．6 CreAoxP介导的位点特异性重组 将pCre经CaCl2转化同源重组后的BAC宿主 菌，涂布于含Cm(12．5斗g／mL)、Gm(30斗g／mL)的 LB平板，30℃培养过夜。挑取菌落，每个菌落分别点 到平行的含Cm(12．5灿g／mL)、Gm(30I山g／mL)的 LB平板、含Kan(25I山g／mL)、Gm(30斗g／mL)的LB 平板，30℃培养过夜。挑取只在Cm平板生长、而在 Kan平板不生长的克隆，于含Cm(12．5斗g／mL)的 LB中于30℃摇床过夜培养。提取BACDNA，PCR 筛选鉴定，所用引物为GAAGGCGATAGAAGGCGA 7rG和AAGGGACTGGCTGCTA7兀℃G，必要时用 EcoRI酶切BACDNA进行鉴定。 1．7 第三次同源重组(缺口修复)：从BAC上直接 克隆捕获目的片段 这一步靶向载体的构建与引入loxP时的靶向 载体不同。如图l所示，2个同源臂完全连接在一 起，被中间的酶线性化(Hindm—HpaI)，然后电转 化宿主菌(重组酶已被诱导表达)，获得重组克隆。 用Ⅳi砌Ⅲ酶切鉴定阳性克隆，重新转化空载DHl0B 宿主菌，扩大培养，纯化，用于以后的ES细胞同源 打靶。 万方数据 4 生r兀，盘 技志H通 讯v-．⋯一．一J．，2010LE RSINBIO NOLOGYol21No1 Jan2010rrE TECH V· ． ·， 2 结果 2．1 第一次同源重组(第1个loxP的插入) Csrp2bp基因的条件型基因打靶载体构建策略 和整个过程见图1。虽然有报道，没有抗生素标记也 可以进行同源重组，即理论上可以直接将第1个 loxP重组到BAC上的相应位置，但是操作繁琐，高 通量筛选工作量太大。为避免这种弊端，第一次同 源重组引入第1个loxP时，我们采用两步法，首先 将loxP—Kan／Neo—loxP重组到BAC上，用Karl筛 选，然后通过Cre位点特异性重组将Kan／Neo基因 去除，最终完成第1个loxP的引入。 随机挑取含Kan、Gm和Cm平板上的克隆，于 含Cm、Gm和Kan的LB中30℃摇床过夜培养，提 取BACDNA，用PCR筛选，对照BACDNA没有任 何产物，三抗平板上的克隆均有预期的约770bp 的片段(图2)，阳性率达100％，表明第一步同源重 组获得成功。将修饰后的BAC克隆命名为LW— BACl，用于下一步CreAoxP位点特异性重组。 2．2 Cre／loxP介导的位点特异性重组 制备LW—BACl克隆菌株的CaCl：感受态细 胞，转化pCre，涂布于Gm和Cm抗性平板，于30℃ 过夜培养，按照1．6所述方法进行位点特异性重组。 最后提取BACDNA，经PCR筛选鉴定，如果Kan／ Neo基因没有被Cre重组删除，则有约510bp的片 段被扩增；如果Kan／Neo基因被Cre重组删除，则 没有任何产物被扩增。结果见图3，l号和2号BAC 克隆成功删除了Kan基因，其中1号BAC克隆被 选出来，命名为LW—BAC2，用于下一步引入第2个 loxP。 2．3 第二次同源重组(第2个loxP的插入) 制备LW—BAC2克隆菌株的电转化感受态细 胞，电转化打靶片段进行第二次同源重组，涂布于 圈2通过同源重组引入第1个loxP的PCR鉴定 M：2-logDNAladder；l：阴性对照；2，3：重组的BAC克隆 Cm、Gm和Kan抗性平板，30℃过夜培养。随机挑取 Cm、Gm和Kan抗性平板上的克隆，于含Cm、Gm和 Kan的LB中30℃摇床过夜培养，提取BACDNA， 经PCR筛选鉴定，对照BACDNA没有任何产物， 三抗克隆均有预期的约1000bp的片段(图4)，阳 性率达100％，表明第二步同源重组获得成功。 通过第二次同源重组，将Neo基因和第2个 loxP引入BAC，这样在最后的修饰BAC中含有2个 loxP和1个筛选标记Neo(用于将来在ES细胞中同 源打靶筛选标记；两侧各一个Frt序列)。此步之后 不再需要位点特异性重组，Neo基因被保留作为以 后ES细胞同源打靶的筛选标记，获得阳性ES细胞 克隆后可用Flp重组酶将抗性基因去除。修饰后的 BAC克隆命名为LW-BAC3，用于下一步同源重组 捕获BAC打靶区。 2．4 第三次同源重组(缺口修复)：从BAC上直接 克隆捕获目的片段 图3 Cre重组后的阳性克隆鉴定结果 M：ikbplusDNAladder；l，2：Cre重组的BAC克隆； 3-6：没有发生重组的BAC克隆 田4通过同源重组引入第2个loxP的PCR鉴定 M：lkbplusDNAladder；l：阴性对照；2，3：重组的BAC克隆 万方数据 王立良等：利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除 5 制备LW-BAC3克隆菌株的电转化感受态细 胞，电转化打靶片段进行第三次同源重组，同时原 始BAC也电转化打靶片段作为一个捕获对照，涂布 于Amp平板，30℃过夜培养。随机挑取Amp平板上 的菌落，于含Amp的LB中30℃摇床过夜培养，提 取质粒DNA，HindIII酶切鉴定。如图5所示，与对照 相比，最终打靶载体多了一条4．5kb的片段；同时 对照中一条约12kb的片段消失，另一条略微大一 点的片段生成，这些与预期大小相吻合，其他条带 则完全相同，说明没有任何非特异性重排发生。提 示第三步同源重组获得成功，最终的条件敲除载体 构建完成，命名为LW—Tf。 圈5通过同源重组捕获打靶区获得最终的条件敲除型载体的 EcoRI酶切鉴定 M：lkbplusDNAladder；l：阴性对照(成功捕获对照BAC克隆后 的载体)；2。3：捕获修饰BAC克隆后的最终载体重组的BAC克隆 3讨论 如前言所述，传统的条件基因敲除载体的构建 涉及多步亚克隆，需要筛选基因组文库，因而周期 长。Zhang等曾经报道过一种相对简单的构建条件 型基因敲除的方法1201，建立了一个经过改造后的基 因组文库，与传统方法相比有所改进，但仍然需要 进行文库筛选，操作繁琐，成功率不高。 随着基因组测序工程的实施与完成，如何对包 含完整基因信息的特定BAC进行有目的的修饰，己 成为功能基因组学研究的一个重要环节。有2种独 立的同源重组系统得以建立，一种基于RecA重组 酶系统，另一种基于入噬菌体的Red重组酶系统。 后者在本世纪初已经得到广泛应用，而RecA系统 重组效率低，操作繁琐，且重组机制不同，不适合于 条件型基因敲除的构建工作。 CottadeAlmeida和Uu等分别建立了BAC同 源重组构建小鼠条件型基因敲除载体的方法0s-lsl， 与传统方法相比有了很大的进步，但也存在明显的 缺点，如操作仍然繁琐，对初学者而言难度大。“u 的方法中每次同源重组、位点特异性重组后都必须 重新转化空载宿主菌，以分开原始质粒和重组修饰 后的质粒，从而使工作量加大，时间也延长了至少 一倍。CottadeAlmeida方法的缺点是，构建后的最 终质粒含有3个loxP，在打靶成功的ES细胞内或 后面的Flox小鼠体内无法把筛选标记Neo基因去 除，有报道即使插在内含子里的Neo基因也有可能 本身就导致nOX小鼠产生表型效应，这对后续研究 工作是致命的缺陷。国内也有类似的报道【161。 本文报道的方法策略顺序恰当，克服了IJiu方 法的不足，每次重组后不须重新转化；同时又避免 了CottadeAlmeid方法中不能去除筛选标记Neo 基因的致命缺陷，而且更节省时间、节约工作量和 成本。另一个优点是可以引入kcz报告基因，在 Cre表达的细胞内LacZ被开启表达，这对下游组织 特异性基因敲除工作非常有帮助，可以检测哪些细 胞内目的基因被成功敲除。通常对新基因的编码蛋 白没有可用的检测抗体，在没有报告基因的情况 下，检测哪些细胞内目的基因敲除情况存在很大困 难，体外的Western印迹因为不能区分细胞类型而 不适合检测工作，而基因的功能是和具体类型的细 胞联系在一起的，离开了特定的细胞，基因的功能 将失去本来意义。 在Red重组酶被成功诱导表达后，靶向载体与 BAC进行同源重组，经过三步同源重组和一次位点 特异性重组，将2个loxP分别引入BAC，最终完成 了小鼠Csrp2bp基因的条件型打靶载体的构建，这 个过程高效快速。Csrp2bp在ES细胞里也表达，因 此本研究同时为在细胞水平上快速研究Csrp2bp基 因的功能提供了可能。本研究初步探索了利用BAC 同源重组技术进行基因敲除的策略，与传统的条件 基因敲除载体构建方法(多步亚克隆)相比，避免了 难以寻找合适的酶切位点，需要进行长片段PCR、 筛选基因组文库和多步骤复杂的连接、纯化等缺 点，具备重组效率高、适用范围广及操作策略灵活 等特点。同时，同源重组发生在细胞内，大肠杆菌的 复制、修复系统保证了克隆分子完全忠实于亲代分 子，使突变的发生率几乎为零。 同源臂为6～12kb时，同源重组率将大大提 高，而传统的构建方法很难克隆如此长的片段，目 前报道的基于BAC同源重组的方法也难做到。我们 的策略是以缺口修复重组为最后一步，可以自由选 万方数据 6 生LE勰RSIN技BIOT术ECHN通OlDG讯Y⋯V01．2⋯1N—o．1-一Jan．’220⋯101TI'E D ． ． ．， 取两侧同源臂的长度，进而进行缺口重组修复，获 得最终的条件基因敲除载体。这样，在某些极端情 况下ES细胞同源重组不能顺利进行时，可以另择 同源臂快速进行缺口修复重组，迅速实现新的条件 型基因敲除载体的构建。已报道的BAC重组工程构 建条件基因敲除载体的方法，由于缺口修复重组发 生在第一步，因而第一步后同源臂就确定了，以后 如果出现问题就没有补救机会，只有一切从头再 来。比如，由于克隆载体的容量限制，同源臂不能太 长，否则后面的重组都不能进行。本研究构建的 Csrp2bp基因的最终条件型基因敲除载体中的同源 左臂为4kb，右臂为8．7l【b，相对较长，因此预计同 源重组的效率会比较高。 我们采用亚克隆构建BAC同源重组载体，其中 一个原因是因为加入了报告基因，打靶片段比较 长，PCR扩增长片段同源臂容易引入突变，将给以 后的工作带来不利影响，而亚克隆几百bp的同源 臂，有快速简洁的测序保证不会引入突变。另一个 原因是我们不推荐用合成长引物直接作为同源臂 的方法(尽管有报道嘲)，因为长引物错误率极高，会 严重影响同源重组的效率，虽然开始的亚克隆节省 了时间，但后面更难的工作反而会浪费更多的时 间，在这点上我们和Liu的观点一致。 总之，我们克服了目前报道的已有条件型基因 敲除载体／小鼠构建方法的很多缺点，建立了小鼠 Csrp2bp基因的条件型敲除载体，为下一步的ES细 胞同源重组打靶、FLox小鼠及Csrp2bp基因敲除小 鼠的制备，以及在细胞及动物整体水平上对 Csrp2bp基因功能进行细致深入的研究，奠定了坚 实的基础。 参考文献 【1】ZhangY，BuchholzF，MuyrersJPP。eta1．An州logicfor 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