五子衍宗汤对Leber遗传性视神经病变患者线粒体基因突变比率的影响

，是一 种由线粒体DNA(mtDNA)突变引起的主要 累及视网 膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维 ，导致视神经变 性的母系遗传性疾病，是最常见的线粒体疾病，也是 遗传性视神经病变的常见类型。LH0N一般在青少 年期发病 ，视功能受损严重 ，预后差 ．至今没有有效 疗法。本课题组在前期研究_】 的基础上进行了五子 基金项 目 作者单位 通讯作者 国家中医药管理局中医药科学技术研究专项基金 (No．04-05LP50) 1中国中医科学院眼科医院．北京 100040 2北京中医药大学东方医院 张守康．E—maihyankelichengwu@163．con3 衍宗汤治疗LHON的临床试验。取得了一定疗效，试 图进一步探讨其作用机理。 1 资料与方法 1．1 观察对象 收集中国中医科学院眼科医院及北京中医药大 学东方医院经临床检查及基冈检测确诊的LHON病 例 ，按照纳入标准与排除标准最终纳入30例 ，于2007 年 l1月至2008年5月在 中国中医科学 院眼科医院 门 诊进行临床试验。 1．2 诊断标准 尚无权威标准，参考国内外文献口 归纳为：①双 眼同时或先后急性或亚急性视力下降；②早期视盘 困中医眼科杂志 2009年 8月第 l9卷第 4期 正常或轻度充血、水肿 、毛细血管扩张，晚期视盘 颞侧色淡或苍白；③视野有中心暗点、盲中心暗点 或旁中心暗点；④视觉诱发电位 (VEP)现P 。。波 潜伏期延长或振幅降低 ；⑤荧光素眼底血管造影 示视盘无渗漏 ；⑥外周血mtDNA原发突变位点 (G3460A或G11778A或T14484C)检测阳性 ；⑦母系 遗传的家族史。 1．3 纳入标准 (1)符合上述诊断标准的①、②、③、④、⑤、⑥； (2)矫正视力 ≤0．8；(3)年龄在 l0岁至4O岁 ；(4)签署 知情同意书。 1．4 分组方法 分组以受试者意愿为主 ，同时考虑两组间治疗 前视力 、病程 、年龄 、性别 、突变类型的一致性及例数 限制，对受试者入组加以引导。分为治疗组20例，对 照组l0例。经检验，两组间治疗前视力、病程、年龄、 性别、突变类型等差异均无统计学意义。 1-5 用药方法 中药水煎制成浓缩液，剂量参考《中华人民共和 国药典}2005年版(31中五子衍宗丸成分中各药比例 计算 ．每剂含枸杞子20g、菟丝子20g、覆盆子10g、车 前子5g、五味子2．5g，浓缩为100ml／瓶 ，由中国中医科 学院广安门医院制剂室统一配制 。西药辅酶Q 。片由 卫材 (中国)药业有限公司生产 ，批号H10930021。治 疗组服用五子衍宗汤 ，每次50ml，每 日2次 ；同时服用 辅酶Q，。片，每次10mg，每日3次。对照组口服辅酶Q 。 片，每次10mg，每 日3次。两组均不进行其它与该病 有关的治疗。用药时间为90天。 1．6 试剂和仪器 mtDNA11778位点 突变核酸测定 试剂盒 、mtD— NA14484位点突变核酸测定试剂盒(荧光PCR法 ，上 海之江生物科技有限公司)。荧光定量PCR仪(美国 ABI公 司)，高速离心机 (德 国Heraeus公司 )，恒温水 浴箱(上海森信实验仪器有限公司)。 1．7 检测方法 取受试者静脉血lml滴在滤纸片上，晾干，邮寄 至上海之江生物科技有限公司测定。实验步骤如下 (以GI1778A突变为例 )：(1)标本处理 ：从滤纸上剪 取 血样标本加入 100ml核酸提取 液 ，振荡 l0 秒 ， 99℃干浴或水浴 10分钟 。13000rpm离心 10分钟 ，保 留上清备用 。(2)试剂配制 ：取64x361xl mtDNAI1778 突变荧光检测混合液与64~0．4lxl Taq酶 (64为反应管 数+1)，振荡混匀数秒 ，3000rpm 离心数秒。(3)加 样 ：取上述混合液36．4lxl置于PCR管 中，然后将样 品处理上清液、纯化水和阳性参考品各41x1分别加 入PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。 (4)PCR扩增 ：反应管置 于定量荧光PCR仪上 ，按推 荐循环参数设置：37~Cx2分钟；94℃x2分钟；循环1 次 。再按93oC×10秒一62℃x40秒 ，循环40次 ：单点荧 光检测在62cI二，反应体系为401xl。分别用FAM、VIC 荧光素标记检测LH0N突变位点变异型和野生型的 荧光探针，根据荧光增量的比值确定变异型和野生 型核酸在样本的比率。以FAM／(FAM+VIC)计算突 变比率。 1．8 统计学方法 采用SPSS13．0统计学软件。治疗前后组内比较 采用配对 t检验，组间比较若方差齐采用成组t检 验，若方差不齐采用Welch近似 t检验。P<0．05为差 异有统计学意义。 2 结果 对照组中有1例用此方法检测试验前突变比率 接近0％，予以剔除。 2．1 组 内mtDNA突变比率 比较 表 1 治疗前后组 内mtDNA突变比率情况 (x+s) 注：①试验前后mtDNA突变比率组内比较，P<0．05。 2．2 组间mtDNA突变比率比较 治疗前后mtDNA突变 比率差=治疗后mtDNA突 变比率一治疗前mtDNA突变 比率 表 2 试验前后组间mtDNA突变比率差情况 ( 十j) 注：①试验前后2组突变比率差比较，P<0．05。 3 讨 论 李毓敏㈨等将荧光MGB探针实 时荧光PCR技术 应用于对LHON患者mtDNA G11778A位点突变的检 测 ，发现该方法能简便 、快速、准确地检测LHON患 者mtDNA G11778A基因突变．判断个体异质性中野 生和突变比率。有研究者认 为LHON患者外周血中 · ZU · mtDNA突变比率高提示在其它组织中mtDNA突变 比 率也相应高，故外周血中突变mtDNA的定量检测可 对异质性LHON的诊断提供有用的信息。 五子衍宗丸具有补肾益精的功能 ，实验表明其 可提高男性老年肾虚者外周血白细胞线粒体呼吸链 酶复合体 I活力，减少线粒体DNA缺失，增加细胞所 需的能量，达到维持细胞的正常生理的作用(5 3。动物 实验研究也发现五子衍宗丸可减少老年大鼠脑组织 线粒体DNA缺失 ，提高脑线粒体呼吸链复合酶 I、Ⅳ 活力和ATP的合成，6]。本组结果经统计学分析发现， 治疗组与对照组治疗后外周血白细胞mtDNA突变比 率均减小，两组间比较治疗组mtDNA突变 比率变化 较大。 本研究表明采用口服五子衍宗汤和辅酶Q．。片 能减少LHON患者 的外周血 白细胞mtDNA突变比率 从而改善线粒体结构。因此，作为一种临床防治方 法，用口服五子衍宗汤和辅酶Q 。片来预防LHON患 者遭受氧化应激导致 的细胞坏死或凋亡 ．减少mtD． NA突变可能行之有效 。考虑到临床试验的伦理学要 求及样本量的不足，本研究未设立单服五子衍宗汤 ·I临床经验 国中医眼科杂志 2oo9年 8月第 l9卷第 4期 组与空白对照组，至于是五子衍宗汤单独发挥作用 还是与辅酶Q。。片合用的交互作用，尚需析因分析的 临床试验进一步证明。由于本研究样本量及治疗时 间有限，有待进一步扩 大样本量 、延长治疗时 问、进 行长期随访。 参考文献 l 童 绎，王 影，张守康．中药五子衍宗丸治疗Leber遗传性视神 经萎缩临床观察IJI．巾国中医眼科杂志 ，2008，18(3)：154—156． 2 (英)Jack J．Kanski原著，徐囝兴主译．临床眼科学【M1．福州：福建科 学技术出版社，2006．596—597． 3 国家药典委员会．中华人民共和国药典(2005)fS1．北京：化学T业 出版社 ．2005．364—365． 4 李毓敏，王剑勇，陈 瑜，等．荧光MGB探针在Leber遗传性视神经 病变mtDNA G11778A基因突变检测中的应用Ⅲ．中华眼科杂志， 2006，8(42)：728-732． 5 王学美 ，富 宏 ，刘庚信．五子衍宗丸对男性老年肾虚者外周血自 细胞线粒体DNA缺失及线粒体呼吸链酶复合体活力的影响『J1．中 国中西医结合杂志．2002．22(2)：101—103． 6 王学美，富 宏，刘庚信．五子衍宗丸及其拆方对老年大鼠心脑线 粒体DNA缺失、线粒体呼吸链酶复合体及ATP合成的影响}J】．中国 中西医结合杂志，2001，21(6)：437—439． (收稿 日期：2008—12—02) 白内障术中后囊破裂的临床分析及处理 冯 霞 郑慧芬 z 【摘要】目的 分析白内障术中后囊破裂的原因及处理办法。方法 回顾分析白内障术中后囊破裂的发 生率与原因，采用统计学方法对结果进行检验。结果 手术技术不熟练及操作不"-3是后 囊破裂发生的首要原 因。结论 眼科 医师应不断提 高操作技巧以减少后囊破裂的发生率。 【关键词】白内障；并发症；后囊破裂 中图分类号 ：R779．66 文献标识码 ：B 文章编号：1002—4379(2009)04—0208—04 晶状体后囊破裂，包括伴有玻璃体脱出是白内 障手术最常见且严重的术中并发症 1]。往往导致患 者术后视力恢复不理想 ，甚至增加视网膜脱离 、黄斑 囊样水肿等术后并发症的发生率 。因此预防和减 少后囊破裂是白内障手术中不可忽视的问题 本文 就我科 2004年 5月～2008年 12月开展白内障手术 320例(350眼)，术中发生后囊破裂22例(22眼)的 原因，以及术中采取的处理方法．分析如下。 作者单位：1南京爱尔眼科医院，南京210006 2临安市人民医院眼科 临安 311300 通讯作者：冯霞 E—mail：fengqirong123@sina．eom 1 资料和方法 1．1 一般资料 收集 2004年 5月至 2008年 12月在我科行 白 内障手术的患者 320例(350眼)，其 中男性 184例 (204眼)，女性 136例(146眼)。年龄 16～90岁。老 年性白内障300例 (330眼)，外伤性自内障 l1例 (11眼)，先天性白内障2例(2眼)，并发性白内障7 例(7眼)。根据LOCS II[3 3分型，无核者 18例，I级 核 36例 ，Ⅱ～Ⅲ级核 76例 ．Ⅳ级核 142例 ，V级核 48例。术前视力光感～0．2。其中后囊破裂 22例(22 眼)，发生率 6-3％(22／350)。