多不饱和脂肪酸发酵的代谢调控育种

食品与发酵工业 Food and Fer~nentation[ndtmtries Vo1．26 No．5 多不饱和脂肪酸发酵的代谢调控育种 2，一 林炜铁 华 T＆々2。 ／ (华南理工大学食品与生物工程学院t广州·51。64。’ 丁 7 z／、7 摘 要 多不饱和r 肪 酸(polyurdaturatedfatty ad也 PuF )对人体健康有 重要影响．目前 舟离纯化 主要来 自海洋鱼油，但存在许多不利 因素限制其 生产及应用。研究表 明微 生特具有 大规模工业化生产 善不饱和脂肪 酸的能力。车 文综述了多不饱和脂肪酸产 生亩 的代谢控弗{ 育种 思碧 。 关键词 多不饱和脂肪酸 多不饱和脂 肪酸 (polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含 2个或 2个 以上双键 且碳原子敦为 16～22的直链脂肪酸。包括 ．亚麻酸、花生四烯酸、：=十碳五烯酸(EPA) 和二 十二 碳六烯 酸(DHA)等 J。根据距脂 肪酸中性末端(m端 )的第一个双键位置的不 同，多不饱和脂肪酸可 以分 为 n．6和 n-3两 大系列。n-6系列是 由亚 油酸衍生而来，主 要有 亚麻酸、花生四烯酸等。n一3系列则 是 由 口-亚麻 酸衍 生而来，包 括 DHA、EPA 等I 。传统上 鱼油是 多不饱和脂肪 酸的主 要来源。 白30年代发现 了亚油酸(18：2 c．卜6)和 亚麻酸(18：3 c．卜3)之后，提 出了必需脂 肪酸 的概念，认为人的机体不能够合成亚油酸和 亚麻 酸，必 需从食 物 中获取口J。此后，越 来 越多的研究集 中于这 2种不饱和脂肪酸上， 认为机体 的许多重要生理机能与多不饱和脂 肪酸有关 。1978年 Dyerberg的流行病学 的 研究指出，爱斯基摩人不仅心肌梗塞的发病 率低，而且类风湿性关节炎、红斑狼疮等以自 身免疫异常为原因的慢性炎性疾患的发病率 明显低于当地的 白种人。大量食用海鱼和海 兽，从中摄取多量的多不饱和脂肪酸无疑是 一 个重要的原因Hl。8O年代韧 ，脂肪科学的 第一作者：博士研究生。 国家 九五”科技攻关项 目(96—003 0l 04) 收薪时阃 ：2000 01—10 亩年 研究有了突破性 的发展．发现 了属于 c．卜3系 列的 2种重要多烯脂肪酸 DHA、EPA。它们 存在于大脑、视 阿膜及精子中，对中枢神经功 能作用巨大 J。近 1O年来，对脂肪酸代谢产 物 PGs(前列腺素，pro~taglandins)和 L1 (白 三烯．1eukotrier )的研究结果使得 多不饱和 脂肪酸的代谢及其与生命现象的密切关 系被 基本阐明。多不饱和脂肪酸已广泛应用于医 药 、食品、化妆品、饲 料等领域。但 日前多不 饱和脂肪酸的商业来源主要是深海鱼油和某 些动植物，由于鱼油资源有限，受气候产地等 条件的影响且纯化成本极高_6J，产品不能满 足市场需求。而微生物发酵法生产多不饱和 脂肪酸却不受原料的限制．因此，世界各国开 展了多不饱和脂肪酸的微生物发酵 育种 、发 酵提取工艺以及发酵动力学等方面的研究。 l 多不饱和脂肪酸的生物合成途径 微生物利用葡萄糖合成多不饱和脂肪酸 的代谢途径如图 1所示[ 。 由图 1可以看出多不饱和脂肪酸的生物 合成机制比较复杂，从葡萄糖开始至某种多 不饱和脂肪酸的合成涉及 2O多步酶促反应。 关于其代谢调控机制，目前尚不十分清楚。 2 代谢调控发酵育种的基本思想[8l 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 26卷 第5期 杜 冰等：多不饱和脂肪酸发酵的代谢调控育种 53 所谓代谢控制发酵就是利用遗传学的方 法或其 它生物化学的 疗法，人为的在 DNA 的分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使 有用的目的产物大量生成、积累的发酵。其 关键在于能否打破微生物正常的代谢调节， 人为的控制微生物 的代谢，而微生物细胞中 这种调节控制作用主要靠 2个因素，即参与 调节的有关酶的活性和酶量，也就是反馈抑 制和反馈阻遏。 葡萄糖 EMPIl lIMP 磷畦蚌肆式丙酮酸 J 丙酮葭 l乙酰cnA萋化辟 丙二醵草酰一ACP l 硬尉葭【18：O) l 曲葭(A2—18：1) △12脞 辟 重曲醢(△9，12—18：2] 多 ／ 、、弋 置氢辟 一 亚麻葭 一亚霹毫 (A9 12．15—18：3) (△6．9，12—18：3) l l EPA 二高，一亚麻葭 (△5，8，1l，14，17一邵：5) 【△8，1l，14—20：3) I l ＼ DHA 花生四烯葭 莆列葺毒 (△4，7，10，13．16，19—22：0 f△5，8，11，14—20：4] 图 1 赦生物利用葡萄糖合成多不饱和 脂肪酸的代谢途径 根据代谢控制机制的研究证明，酶的生 物合成受基因和代谢物的双重 控制。一方 面，从 DNA 的分子水平上来看酶合成的控 制机制．酶的合成象普通蛋白质的合成一样， 受基 因的控制，由基 因决定形成酶分子的化 学结构。另一方面，从酶 学的角度探讨 。仅仅 有某种基因并不能保证大量产生某种酶。酶 的合成还受代谢物(酶反应的底物、产物及其 类似物)的调节和控制。当有诱导物存在时， 酶的生成量可以几倍乃至几百倍的增加。相 反地．某些酶反应的产物，特别是终产物，又 能产生阻遏 作 用，使酶的合 成量大大 减少。 在酶反应过程 中，酶 的活性受终产物 的抑制 或激 活，尤其是代谢途径 中的关键酶，它对于 整个生化反应起限速作用。 要使微生物大量 积累 目的产物，就要控 制微生物的代谢作用，即减除或削弱微生物 细胞自我调节控制机制，具体说来，应从增强 目的产物的主代谢流，切断支路代谢，解除菌 体 自身的反馈调节，增加前体物的合成及去 除终产物等几个方面人手。最有效的方法就 是造就从遗传角度解除了微生物正常代谢控 制的突变株，突破微生物的 自我调节控制机 制。这可 通过选 育具有结构类似物抗性、 营养缺陷(或渗 漏突变)、分解能力缺陷等遗 传标记的突变株，或将某些关键酶基因进行 克隆而加以扩增，构 建 目的工程菌株等来达 到 。 3 多不饱和脂肪酸产生菌的育种思路 3．1 "1-亚麻酸 花生四烯酸发酵的代谢控制 育种 (1)出发菌株的选择 亚麻酸或花生四烯酸发酵多采用被孢 霉(Martlerella)、毛霉(Macor)和根霉(Rhi— zopus)等产油脂较多的真菌做出发菌株_9】。 (2)切断或减弱支路代谢 通过 切断或减弱非 7．亚麻酸生物合成 的支路代谢，使更多的磷酸烯 醇式丙酮酸、乙 酰 CoA或亚油酸生成 亚麻酸或花生 四烯 酸，从而提高产量。据报道，采用 a．亚麻酸缺 陷、EPA缺 陷突变 株，均 有助于提 高 亚麻 酸或花生四烯酸的产量，花生四烯酸缺陷突 变株有助于 亚麻酸产量的提高．另外可考 虑选育 EPA、DHA或前列腺素 的渗漏 突变 株。 维普资讯 http://www.cqvip.com 食 品与发酵工 让 Food and Fermentation／ndustries Vo1．26 No．5 (3)解除反馈调节 为了解除菌种 自身的反馈调节，可以通 过选育脂肪酸结构类似物抗性突变株的方法 来达到 目的。倒如 LTB 、耐高浓度 亚麻酸 突变株等。据报道，选育 4一氟代亚油酸抗性 突变株，可以使被孢霉 苗的花生 四烯酸 产量 提高 0．65倍。 (4)增加前体物的合成 菌体生物合成多不饱和脂肪酸与 HMP、 EMP途 径 直 接 有 关。增 强 HMP途 径， NADPH的数量增多，有利于不饱和脂肪酸 产量的提高。过量的磷酸盐或通气不足会使 EMP途径增强，而产 生 NADPH 的 HMP途 径受阻．导致不饱和脂肪酸的合成降低。通 过选育对单氟 乙酸敏感 、碘乙酸敏感、萘啶酮 酸敏感突变株，均有利于 加强 HMP途径，从 而增加花生四烯酸及 一亚麻 酸生物合 成的 前体物，有利于目的产物的高产。 (5)强化能量代谢 细胞内的 ATP水平高时，在细胞质中台 成的乙酰 CoA被 用于脂肪 酸 的生物合成。 若细胞内 ATP水平降低、则脂肪酸的生物合 成终止。因此提高苗体 细胞 内 ATP的水平 有利于脂肪酸的合成。选育呼吸抑制剂(丙 二酸 、氰化钾、亚砷酸 等)抗性 突变株，ADP 磷酸化抑 制剂 (羟胺、2．4一二硝基酚等)抗性 突变株．抑制能量代谢 的抗生素 (缬氨 霉素 等)抗性突变株均 有助于不饱和脂肪酸产量 的提高。 (6)选育低温生长突变株 细胞膜是重要的微生物细胞表面结构， 由脂质和蛋 白质组成，脂质分子中不饱和脂 肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的 流动性也就越大，即微生物生长的温度也就 越低。据报道，选育在相对低温 (15℃)条件 下生长良好的突变株。结果其 ～亚麻酸的 产量提高了 1．4倍。 (7)选育A6一脱氢酶活力强的突变株 A6．脱氢酶是微生物合成 一亚麻酸的关 键酶之一，其活性的高低直接与 ．亚麻酸或 花 生四烯 酸含量 的高 低密切相关 ，可 采用 TTC酶活测定法来反映A6一脱氢酶的活性。 TTC为一种无色 的氧化还原剂，能被 A6一脱 氢酶还原成红色的物质。红色越深．表 明菌 体内的A6一脱氢酶 活力越 高． 一亚麻 酸的积 累也越多。 3．2 EPA、I)ItA发酵的代谢调控育种 (1)出发菌株的选择 迄今为止据报道的 EPA、DHA生产苗有 希望的来源主要集中于破囊壶 苗、裂殖壶菌 等海生真菌和海生异养微藻。最近也有一些 关于利用海生细菌生产 DHA和 EPA的报 道 [。 。 (2)切断或减弱支路代谢 通过 切断或减弱 亚麻酸生物合成的 支路代谢，使更多的亚油酸生成 亚麻酸。从 而提高 EPA、DHA 的产 量。采用 ．亚 麻酸 缺陷或△6一脱氢酶活力低 的突变株，均 有助 于 EPA、DHA产量的提高。 (3)增强主代谢流 与选 育 一亚 麻 酸高 产 菌株 类似 ，加 强 HMP途径或提高细胞内 ATP水平，均有助 于 EPA和 DHA产量的提高。 因此．可采用 上述的增加前体物的合成与强化能量代谢的 育种方法。另外，可考虑选育 △一15脱氢酶 活力高的突变株来强化主流代谢。 (4)选育低温生长突变株 与上面相似，选育在相对低温条件下生 长 良好的突变株，有利于提高菌体细胞内多 不饱和脂肪酸的含量。 (5)解除反馈调节 选育 EPA、DHA的结构类似物 突变株， 如 DHA、EPA的氧肟酸盐抗性 突变株等，可 解除菌体 自身的反馈调节，提高 EPA、DHA 的产量。 (6)选育耐高糖的突变株 在代谢调控发酵中，常采用耐高渗透压 突变株。DHA发酵与培养基中糖浓度有密 切关 系。在一定范围 内，DHA的产量随糖 的浓度的增加而增加，但糖 浓度过高就会抑 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 26卷 第 5期 杜 球等：多不饱和脂肪酸发酵的代谢调控育种 55 制菌体生长，降低产物的积累。因此，通过选 育耐高糖的突变株，可使菌体高效 率地利用 葡萄糖，从而提高 DHA的产量。 (7)挑选脂肪粒大，密度高的突变株 对菌株镜检，可观察到菌丝体 内存在折 光性很强的液滴——脂肪粒。用苏丹 Ⅲ对菌 丝体染色，液滴呈红色，用苏丹黑对菌丝体染 色，液滴呈深蓝色。挑选脂肪粒大，密度高的 突变株，有助于多不饱和脂肪酸产量的提高。 4 结 论 近年来，我国采用微生物生产多不饱和 脂肪酸的研 究已取得了一定的进展．但 由于 菌体生长速率、菌体脂质含量较低等原因，目 前 尚未能实现工业化生产。因此当前最迫切 的任务是筛选优质菌种，加强发酵条件与代 谢调控的研究。 参 考 文 献 1 Zubay G Biochem istry．Massschusetm：Ad dison—W ey Publishing Company，lnc．．1984，403～ 416 2 BlochK，VanceD E．Ann Rev Biochem ．． 1977，46：263 3 Sugano M et al Agric．Bid Chem ．1986， 50：2 483 4 Dyerberg J．Nutritional Evaluation of Long- ehain Fatty Acids．New York：Academic Press，1981： 245～ 261 5 Gill l，Valivety R．Trends in Bioteehnology, 1997，15：401～409 6 Simopou~ A P，Kifer R R． Martin R 亡 Health Effects of Polyuns~turated Fatty Acids in Seafoods New York：Academic Press．1986 7 沈同，王镜岩 等编．生物化学 ．北 京 ：高 等 教育 出版社．1990 8 张克旭，陈宁等编 ．代谢控制发酵 ．北京 ：中 国轻工业出版社。1998 9 曹万新等 中国油脂，1998．23(1)：37--39 10 Yaao Y，NakayamaA，SaitoH et a1．Lipids． 1994，29(6)：527～528 The M etabolic Control Breeding of Polyunsaturated Fatty Acids Ferm entation Du Bing Pan Li Lin W eitie Yao Ruhua (College 0f Food and Bioengineering．South China University of Technology,Gu~ngzhou．510640) A]~ rRACT Polyunsaturated fatty acids have important effects on human health．At present they ale isolated and purified from marine fish oil，but many disadvantages remain to be solved ． Research shows that m icroorganisms have po tential po wer for industrial production of po lyunsatu— rated fatty acids on a hrge scale．This article r~iews the way of the metabolic control breeding microorganisms that can produce po lyunsaturated fatty acids． Key wools po lyunsaturated fatry aeids．microorgan ism ，ferm entafion．megabe lic control 中国苹果汁俏销欧洲 过 去在 歇洲市场上 占有船顿 一直不大 的中国苹 果汁，夸年俏销 了起 来，销 鹊量 已过 3万 t左右。预 计 2000年歇洲对 中国苹果 汁的需求量将过 6万 t。 歇洲对 中国苹果 需求增 加的主要原 因是 歇洲饮 料厂商过去生产戗科主要使用高酸度苹果汁．现在 开 始使用低酸度苹果汁 中国苹果汁 酸度 较低，价 格相对便 宜，因此 受到 欧洲厂商的喜爱。 ‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com