荧光检测器

荧光检测器 检测器故障和解决方法 1.检测器性质概述 检测器是液相色谱系统的“眼睛”，测量离开柱的样品的浓度或质量。光电检测器测量柱流出物的光吸收、荧光和折光率的变化。电化学和电导检测器溶液的变化。特殊的样品用特殊的检测器。不合适的检测器测得的结果也不可靠。 2.常出现的UV检测器故障 故障类型 故障率(%) 噪音 26 漂移 12 灵敏度 9 灯寿命 24 气泡 7 在检测生物样品时可能为主要故障 池污染 6 其他 8 无故障 11 3.具体故障与解决 a.灯故障主要是灯失灵或能量衰减以及灯引起基线噪音。 除EC外，检测器中灯是重要部件。灯失灵，明显地引起检测器信号总下降。多数检测器有观察孔或指示器，由此可看见灯工作的情形。但是不可以直接观察紫外灯，因为紫外线会损伤眼睛。 基线噪音这是灯失灵更普遍的故障。氘灯打开后有30分钟的最大噪音，所以每次使用前至少预热30分钟。 换灯时要注意不能在灯上留下指痕。因为未擦去的指痕在开灯后会引起灯表面永久性的损害。请用软布或专用擦镜纸握住灯，在开灯之前用棉签蘸取甲醇擦去。新装上后至少要点燃1小时以上，才能开始定量分析。 b.池故障与解决 气泡是最常见故障。瞬间而过的气泡会在色谱图上出现长噪音尖峰。若感觉到有气泡，当将等调整670nm左右，戴上防护眼镜便可以看到池内有一个圆环，并不是清晰地绿色图像。流动相脱气不足会产生气泡，池污染会使得故障加重。用充分脱气的流动相可以带走气泡，或用强溶剂通过系统。在正相和反向系统转换的时候一定要过渡。 检测器阻塞有下列现象:系统压力升高，松开检测器进口的接头压力降至正常水平。检测器部分易发生的地方为进口管道或热交换器、池本身和出口管道。用一般的净化的溶剂去掉阻塞可能不奏效但可以试试。若是厂家标明耐高压，可用泵打溶剂反冲，常可以去掉堵塞。压力不要超过6MPa.正常的池不可用此法，一般情况请咨询厂家的维护工程师较好。 c.池阻塞和污染，如确定是池堵塞，可用注射器回抽溶剂或用泵反冲(耐高压)，一般能疏通。通常此故障较少发生，而污染是经常发生的。池污染一般是色谱图的噪音增大，灵敏度降低甚至不出峰，也提高了气泡的故障率。清洗池前向拆去柱和排空管道，准备好防护用品，如眼睛、围裙、橡胶手套等。池进出口都接上细管径的聚乙烯管。进口管上接10ml的注射器，出口管没入异丙醇中。清洗程序如下:回抽10ml异丙醇通过池去掉流动相残留。 回抽10ml蒸馏水 回抽10ml6mol/L硝酸，通过池去掉沉积物，此步应小心，要备有防止酸溢出的应急措施 回抽20ml蒸馏水 至少用100mlHPLC级别的水正向通过池。 d.池渗漏可能发生在接头、池窗的密封垫上，也可能发生在样品池或参比池的一侧，或者是石英窗破裂。除了接头松动，池渗漏也可能是管道阻塞、流速较高、池后的阻力大，使池的 横截面承受过高的压力，严重地引起池破裂。也可能组装不当、垫圈不密封造成的渗漏等。没有多大把握最好请厂家来维护。 e.测量和参比池配合不当，正常情况下UV检测器用空气做参比，电路设计也无流动相本地。用有紫外吸收的流动相通过UV检测器，或是用示差折光检测器都要在参比池内注满流动相。如参比池中流动相不与测量池中的流动相一样，本底输出信号不为零，进样时有可能出伪峰或倒峰。从湿参比池换成空气参比池时，要清洗干净后用干燥的氮气吹干，不能留下溶剂残留，否则就出“气泡样”的故障。 f.波长方面的问题主要是次级发射效应、选择波长不正确、波长的装置差、波长校正问题、低波长测量问题和单色器等问题。 次级发射效应在可见光范围内，使用氘灯做光源可提高灵敏度，但是带来了次级发射效应。单色器能发射比设定值高一级的发射光，正好是设定值的一半。如设定值在405nm，次级发射光正好是202.5nm，三级发射光低于干扰波长之下，由于大气中的氧所吸收。次级发射光正好在紫外光范围内，即是检测器在两种波长下检测，违反了比尔定律，结果是非线性的。我们可以用钨灯在紫外范围内无次级发射，但是灵敏度下降。用氘灯在高于360nm测定，应考虑有次级发射的可能。在荧光检测器中，也有这个问题存在。 选择波长不正确可影响实验结果的精确性，如有可能应选择在干扰组分的吸收光谱平稳的范围或组分的最高吸收处。在所选波长太靠近流动相的吸收范围，梯度洗脱时会增加基线漂移。 波长的装置差，可变波长UV检测器所采用的机械转动光栅选择波长。旋转和光栅间的传动装置由齿轮和杆组成，用久了会机械磨损，所选的波长并不真正是您选择的波长。 波长校正问题我们可以用铬酸钾在275nm校正吸收波长等方法来处理。 低波长测量问题是我们在采用低波长时，样品和流动相的变化比在高波长下更灵敏。我们要选择应选择低波长吸收较小的溶剂，通常是乙腈好于甲醇。 单色器问题主要是光栅和镜子蒙上一层污染物，一般这种情况请厂家维护较好。 g.时间常数是相应时间的设定，起着过滤噪音的作用。有些有固定的时间常数，有些需要自己设定。如果太小可能增加短噪音，时间常数太大可能出宽峰、峰拖尾和短峰。可用自己的经验估算时间常数，即选最窄的有关峰宽的10%作为时间常数。 h.泵噪音主要引起检测器折射率的变化与流动相的组成、压力以及温度由引起的噪音。一般情况要加阻尼器，特别是RI检测器对波动十分敏感。。 I.温度的影响，主要是环境温度变化常引起基线漂移，一般情况请使用柱温箱等设施或环境温度波动的控制。 j.混合问题，主要是流动相不完全混合可出现周期性的基线变化，在示差折光检测器非常严重，如果改用手动混合相对较好。特别是比例悬殊太大时最明显。 k.线性问题，主要因为检测器或方法上的问题，非线性响应是可能的。如仔细稀释样品、选择波长，良好的方法可以延长线性范围。检查线性要在一定的浓度范围内，用不同浓度的品证实线性的相关性;用几乎澄清的溶剂做流动相可扩展线性范围，用强紫外吸收的流动相检测器线性范围几乎不到零，建议用无吸收的流动相或在流动相无吸收的波长下检测。 l.信号线故障主要是器和数据系统连接检测器的信号线引起的。要注意正负是否接对或线路松动、接触不良。另外就是有良好的接地装置。 m.内部自检没有通过，我们可以通过其提示信息参阅手册来解决，最好咨询厂家维护工程师。 检测器操作注意事项 1.尾吹气的使用 吹气是从色谱柱出口处直接进入检测器的一路气体，又叫补充气或辅助气。填充柱不用尾吹气，而毛细管柱则大都采用尾吹气。这是因为毛细管柱的柱内载气流量太低(常规柱为1-3ml/min)，不能满足检测器的最佳操作条件(一般检测器要求20ml/min的载气流量)。在色谱柱后增加一路载气直接进入检测器，就可保证检测器在高灵敏度状态下工作。尾吹气的另一个重要作用是消除检测器死体积的柱外效应。经分离的化合物流出色谱柱后，可能由于管道体积增大而出现体积膨胀，导致流速减缓，从而引起谱带展宽。加入尾吹气后就消除了这一问题。 那么，尾吹气流量多少合适呢,这要看所用检测器和色谱柱的而定。比如，用0.53mm大口径柱时，柱内流量可达15ml/min，这对微型TCD和单丝TCD来说已经够大了，就没必要再加尾吹气了。而对于FID、NPD、FPD则需要至少10ml/min的尾吹气流量，对于ECD就需要20ml/min的尾吹气(ECD一般需要载气总流量大于25ml/min)。使用常规或微径柱时，尾吹气流量应相应增大。经验参考值为:FID、NPD、FPD需要柱内载气和尾吹气的流量之和为30ml/min左右。ECD则需要40-60ml/min。当需要在最高灵敏度状态下工作时，应针对具体样品优化尾吹气流量以及其他气体流量。一般情况下，尾吹气所用气体类型应与载气相同。 尾吹气流量是在安装好色谱柱后，在检测器出口处用皂膜流量计测定的。注意，测定尾吹气流量时要关闭其他气体(如使用FID时要关闭空气和氢气)，用0.32mm以下内径的色谱柱时，可不关闭柱内载气，这时测得的流量为柱内载气和尾吹气流量之和。 2.FID使用注意事项 (1)FID虽然是准通用型检测器，但有些物质在此检测器上的响应值很小或无响应。这些物质包括永久气体、卤代硅烷、H2O、NH3、CO、CO2、CS2、CCl4、等等。所以，检测这些物质时不应使用FID。 (2)FID是用氢气和空气中燃烧所产生的火焰使被测物质离子化的，故应注意安全问题。在未接上色谱柱时，不要打开氢气阀门，以免氢气进入柱箱。测定流量时，一定不能让氢气和空气混合，即测氢气时，要关闭空气，反之亦然。无论什么原因导致火焰熄灭时，应尽快关闭氢气阀门，直到排除了故障，重新点火时，再打开氢气阀门。高档仪器有自动检测和保护功能，火焰熄灭时可自动关闭氢气。 (3)FID的灵敏度与氢气、空气和氮气的比例有直接关系，因此要注意优化。一般三者的比例应接近或等于1:10:1，如氢气30-40ml/min,空气300-400ml/min，氮气30-40ml/min。另外，有些仪器设计有不同的喷嘴分别用于填充柱和毛细管柱，使用时应查看说明书。 (4)为防止检测器被污染，检测器温度设置不应低于色谱柱实际工作的最高温度。一旦检测器被污染，轻则灵敏度明显下降或噪声增大，重则点不着火。消除污染的办法是清洗，主要是清洗喷嘴表面和气路管道。具体方法是拆下喷嘴，依次用不同极性的溶剂(如丙酮、氯仿和乙醇)浸泡，并在超声波水浴中超声10min以上。还可用细不锈钢丝穿过喷嘴中间的孔，或用酒精灯烧掉喷嘴内的油状物，以达到彻底清洗的目的。有时使用时间长了，喷嘴表面会积碳(一层黑色沉积物)，这也会影响灵敏度。可用细砂纸轻轻打磨表面而除去。清洗之后将喷嘴烘干，再装在检测器上进行测定。 3.TCD使用注意事项 (1)确保热丝不被烧断，在检测器通电之前，一定要确保载气已经通过了检测器，否则，热丝就可能被烧断，致使检测器报废，同时，关机时一定要先关检测器电源，然后关载气。任何时候进行有可能切断通过TCD的载气流量的操作，都要关闭检测器电源。这是TCD操 作所必须遵循的规则。 (2)载气中含有氧气时，会使热丝寿命缩短，所以，用TCD时载气必须彻底除氧。而且不要使用聚四氟乙烯作载气输送管，因为它会渗透氧气。 (3)载气种类对TCD的灵敏度影响较大。原则上讲，载气与被测物的传热系数之差越大越好，故氢气或氦气作载气时比氮气作载气时的灵敏度要高。当然，要测定氢气时就必须用氮气作载气。 4.NPD使用注意事项 (1)NPD是在FID基础上发展起来的，它与FID的不同在于增加了一个热离子源(由铷盐珠构成)，其用微氢焰。在热离子源通电加热的条件下，含氮和含磷化合物的离子化效率大为提高，故可选择性地检测这两类化合物。由于用氢气，所以NPD的安全问题与FID相同。 (2)热离子源的温度变化对检测灵敏度的影响极大。温度高，灵敏度就高，但铷盐珠的寿命就会缩短。增加热离子源的电压、加大氢气流量，均可提高检测灵敏度。而增加空气流量和载气或尾吹气流量会减低灵敏度。然而，必须注意，空气流量太低又会导致检测器的平衡时间太长;氢气流量太高，又会形成FID那样的火焰，大大降低铷盐珠的使用寿命，而且破坏了对氮和磷的选择性响应。气体流量一般设定为:氢气3-4ml/min，空气100-120ml/min，用填充柱和大口径柱，载气流量在20ml/min左右时，不用尾吹气，用常规毛细管柱时，尾吹气设定为30ml/min左右。 (3)在调节和设置热离子源的电压时，切记关闭检测器电源，以免不小心烧毁铷盐珠。 (4)热离子源的活性元素(铷盐)容易被污染而缩短使用寿命。要延长其使用寿命应注意: 第一，避免SiO2进入检测器，色谱柱要很好地老化，尤其是硅氧烷类固定液，其液膜要薄。还要避免衍生化后样品中有SiO2残留而进入色谱柱。 第二，关闭载气(如换钢瓶或换色谱柱)前，应将热离子源的电压调为0，否则，没有载气通过，铷盐珠会在几分钟内烧毁。 第三，在满足灵敏度要求的条件下，尽可能用低的热离子源电压。 第四，仪器存放要避免潮湿，当仪器不用时，最好保持检测器温度在100?以上(热离子源电源当然要闭)。 第五，如果一段时间不进样分析(如过夜)，就应该降低热离子源电压，但不要关闭。因为减低电压后铷盐珠仍是热的，再进样时升高电压很快就能稳定。如果关闭后再通电压，则检测器需要几小时的平衡时间。 5.ECD使用注意事项 (1)防止放射性污染。ECD都有放射源(一般为63Ni)，故检测器出口一定要用管道接到室外，最好接到通风出口。不经过特殊培训，不要自己拆开ECD。要遵循实验室有关放射性管理的条例。比如，至少每6个月应测试一次有无放射性泄漏。 (2)ECD的操作温度一般要高一些，常用温度范围为250-300?。无论色谱柱温度多么低，ECD的温度均不应低于250?。这是因为温度低时，检测器很难平衡。 (3)用ECD时载气一般有两种选择，一是用氮气，二是用含5%甲烷的氩气。前者灵敏度高一些，但噪声也高;用后者时检测限与前者基本相同，只是线性范围更宽一些。氢气也可用作载气，但要用氮气作尾吹气。载气与尾吹气的流速之和一般为60ml/min。流量太小会使峰拖尾严重，而流量太大又会降低灵敏度。 (4)ECD要避免与氧气或湿气接触，否则噪声会明显增大。因此，载气和尾吹气都要求很好地净化。此外，检测器污染测试和泄漏测试都要严格按照仪器进行。 6.FPD使用注意事项 (1)FPD也用氢火焰，故安全问题与FID相同(见上面有关FID的讨论)。 (2)FPD的氢气、空气和尾吹气流量与FID不同，一般氢气为60-80ml/min，空气为 100-120ml/min，而尾吹气和柱流量之和为20-25ml/min。 有关检测器的问题就简单讨论到这里，限于篇幅就不再对AED和MSD展开讨论。其 实这两种检测器的作用非常大，其使用会越来越普遍。