猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究(可编辑)

猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究(可编辑) 猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 蓥 , : . : , : :,’, ,.. ,独刨性声明 本人声明,所呈交的学位论文,是受“国家自然科学基金一一鸡源胶原血管保护活性肽的 筛选、制备及保护机理研究”项目资助,在指导教师指导下,通过我的努力取得的成果,并且 是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外,论文中不包含 其他人发表或撰写过的研究成果,也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而 使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 如被查有严重侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名:强 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定,即学校有权送交论文的复印 件,允许论文被查阅和借阅:学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其 他复制手段保存论文。 ,在??年后解密可适用本。口 保密 回 不保密,本学位论文属于不保密。 请在方框内打“” 学位论文作者亲笔签名:五监日期: 指导教师亲笔签名:摘要 摘要 胎盘肽是人类功能性食品研究和开发的重要资源,猪胎盘是未被充分开发利用 的资源,它含有人体所必需的多种氨基酸,像缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸等,它还具 有调节内分泌、增强免疫、补血美容、增强记忆、抗应激等功效。充分探索其生物 活性功能,开发具有特殊生物活性,如抗氧化性、降血压性等的功能性食品或生物 制品,具有重要的理论和实践意义。本文以猪胎盘作为原料,采用胃蛋白酶水解制 备猪胎盘功能性短肽,研究其生物活性,旨在为猪胎盘功能性肽的充分利用提供科 学依据。主要研究结果如下: 采用正交试验,在单因素试验的基础上,得到最佳工艺酶为胃蛋白酶, .、温度。,在最佳工艺条件下制得的猪 最佳工艺条件为酶与底物比%、 水解度为.%。 胎盘酶解液粗提物的还原力为., 利用紫外可见分光光度计,测得猪胎盘酶解液的胎盘肽含量为. 。 /:紫外扫描猪胎盘酶解液,得到其最大吸收峰为 采用.验证不同分子量酶解液的正确性,对不同分子量的猪胎 盘酶解液的自由基清除活性这一主要指标的测定,得知 的猪胎盘酶解 液的活性最好,其自由基清除活性的值为. /。将其经过 .和 .的分离纯化,得到了活性较高的峰组分,其自由基 清除活性和抑制活性的值分别为. /。 /和. 以作为主要指标,对分离纯化后的猪胎盘酶解液经高温、低温、 酸和碱处理,得到处理后的酶解液的自由基清除活性的值分别为. 、. /、. /、. /,与未处理的猪胎盘酶解液的 值. /相比,经过高温、低温和酸碱处理后的猪胎盘酶解液的自由 基清除活性均有小幅度降低,但变化幅度不大,说明酶解得到的猪胎盘肽的 稳定性 较好。 关键词:猪胎盘;酶水解:分离纯化;自由基清除:抑制;功能性肽。些兰堡竺三 一. ?‘。’?。?‘????‘。。‘。。。。。。。。。。。。。。。’。。。’’’’‘‘? ‘’。。。。。。。?????’。。’???????????????一一一 . 他 , ,,,,,,, . , , . ,,,. ,.?: ... : .. , , /, . %., ; . . ./...../ ./ . ?. . . /,. /,. /,. / , ,, .. /. .一一? , , : , ,目录 目 录 摘要?。.?.......?.?.....?........?..??.. 引言...?.......?....?....,... 文献综述?...??..?.....?..??. .功能性肽和功能性食品??.. .。功能性肽.??.??,??,?.??. ...抗氧化肽?.?.. ...降血压肽?.??.??. ...免疫肽?.??. ...抗菌肽.. 功能性食品?. . ...功能因子?..?.....??........ ...功能性食品的简要概述.??.?.? ...我国功能性食品发展现状??....功能性食品的发展趋 势?....?.?...??..??.. .蛋白质酶解产物在食品方面的应用??. ,胎盘和胎盘肽??一.??.?.?.. 。.胎盘..。?.??.....??.? .。.胎盘的简要概述??.?.. ...胎盘的主要功能...?....?....胎盘肽.??.?.??.?... ...胎盘肽的简要概述?..?. ...活性肽的主要制备方法.??....生物活性肽的分离纯化.??.?... ...生物活性肽分类和主要功能. .动物胎盘的研究进展??。。. .猪胎盘的国内外研究现状?.. .本课研究的目的意义.?... .本论文的主要研究内容??.?..?.??... 猪胎盘酶解工艺技术的研究?.?. .材料与方法?.?.??... .。材料??... ...试验材料..??..??. ...主要试剂..?...?...... ...主要仪器?.?. ..试验方法??..?... . 猪胎盘粉末的制备 . ...猪胎盘蛋白质含量的测定?...?... ...猪胎盘粉酶解过程 ...猪胎盘最佳酶筛选.??.。 目录 ...酶解产物还原力测定旧”?.. ...酶解液中可溶性氮的测定? ...水解度的测定??.......??..?....一.......?.... ...猪胎盘酶解的单因素试验? ...正交试验设计?. .结果与分析,: 。....一.:........:.二?:...:?...?.. ..猪胎盘蛋白质含量测定??.?. ..最佳酶的筛选结果........??. ..酶解工艺条件的研究?. ...酶与底物比对猪胎盘酶解效果的影响.. ... 对猪胎盘酶解效果的影响 ...温度对猪胎盘酶解效果的影响??.. ...酶解时间对猪胎盘酶解效果的影响?. ...底物浓度对猪胎盘酶解效果的影响?. ..酶解工艺条件的优化?. ...正交试验结果?.......... ...验证试验??.. .结论?......?....??....??......? 猪胎盘肽的主要理化特性. .材料与方法??.. ..材料 ...试验材料??.?....主要试剂.??. ...主要仪器??.. ..试验方法?..?....猪胎盘酶解液的外观检测? ...猪胎盘酶解液的测定结果 ...紫外扫描法测定猪胎盘肽的最大吸收峰 ...紫外吸收法测定猪胎盘肽的含量.结果与分析??.. .结论...??.....??... 猪胎盘酶解液抗氧化肽的分离纯化.. .材料与方法??.. ..材料 ...试验材料??.. ...主要试剂.....?.?..? ...主要仪器??.. ..试验方法?....?.? ...超滤分离技术...?..?.....??...?... ...超滤离心管的预处理?.? ...猪胎盘酶解液不同分子量的分离及验证 ...测定不同分子量自由基清除活性嘲。??.. ...猪胎盘酶解液 的继续纯化??...?.??.. 目录 ... 抑制活性检测阳?.??.??.. 结果与分析?.?.......??....??..... . .结论?.?........?一.?...........??.??... 猪胎盘功能性肽的稳定性验证??.??.?.??.??.. .材料与方法??.. ??材料..二:。:、..:.:.。.,?。。,。。。?。。。。。...?.....?.。. ...试验材料??,?.??.??.. ...主要试剂??.. ...主要仪器?.??.?... ..试验方法.??.??.??.. ...高温对猪胎盘功能性肽的稳定性影响.. ...低温对猪胎盘功能性肽的稳定性影响.. ...酸碱处理对猪胎盘功能性肽的稳定性影响??. .结果与分析?.??.??.??.. ..高温对猪胎盘功能性肽的稳定性影响?.??.?... ..低温对猪胎盘功能性肽的稳定性影响?.??.??.??.. ..酸碱处理对猪胎盘功能性肽的稳定性影响??..结 论......?.....?....??..... 主要结论、创新点及展望?.?.。. .主要结论??.....?........?.?....:...??... .创新点...?.....?..?..??........??.?........?. .展望.........?.?.?....?........?......参考文献?.??.?..??.? 个人简介??.. 致谢.?.??. 引言 引言 人口数量的增加,我们所能利用的资源越来越少,如何实现 随着社会的发展, 有限资源的高效利用是当今社会亟待解决的问题。以农业加工副产物为原料,开发 具有高生物活性、高附加值的功能性食品配料,是实现农业可持续发展的关键。我 国生猪饲养量位居世界第一且逐年增加,猪胎盘的年产量较高,但猪胎盘极少被利 用,常被当作废弃物丢弃。猪胎盘中蛋白质含量较高,含有多种人体必需的氨基酸。 其中缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸的含量远高于乳制品中相应氨基酸含量。另外,随着 近年来对猪胎盘的研究不断增多,其许多生物活性被逐渐发现。诸如延缓衰老、增 强记忆、抗应激、调节内分泌、增强免疫力、防治老年痴呆、补血美容等功效。所 以猪胎盘是一种尚未得到较好利用的宝贵资源。 利用酶解工艺得到的生物活性肽具有活性广泛,安全性好,容易吸收,而且不 易产生过敏等特点,而被广泛用于活性肽的制备。虽然用机械粉碎法制备猪胎盘肽 已有一些报道,但酶法水解制备猪胎盘功能性肽的研究较少。本研究采用胃蛋白酶 水解猪胎盘,旨在制备容易被人消化吸收、生物活性好的猪胎盘短肽及氨基酸,为 猪胎盘的充分利用提供可能性。 本论文的主要目的是试图通过酶解法制备具有生物活性的猪胎盘短肽,突破固 有的提取、分离纯化动物资源的方法,探索新的工艺和分离纯化技术,提升动物资 源的充分高效利用。猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 文献综述 .功能性肽和功能性食品 ..功能性肽 动物活性肽亦称功能性肽在近多年来得到迅速发展,目前从动物体中 分离得到的生物活性肽己达数十种之多。现在对动物活性肽尚没有较为一致的分类 方法,按照来源来说,分为外源性和内源性活性肽。外源性活性肽是指非动物本身 产生的、被吸收后具有生物活性的肽类物质,如动物的乳汁中含有的乳源性表皮生 长因子、转化生长因子等。内源性活性肽是指由动物自身的组织或者器官产生的、 对动物本身具有生理调节作用的肽类物质,主要包括一些重要的内分泌腺分泌的激 素类物质,如促甲状腺激素、生长激素释放激素、胰岛素等【】。动物活性肽按照其 功能来说,又可分为抗氧化肽、抗高血压肽、免疫调节肽和抗菌肽等。 ...抗氧化肽 抗氧化肽的常用制备方法 酶解法酶解:酶解法就是酶解蛋白质以得到肽类物质的方法。该法成本低廉、 反应条件温和、时间较短、效率高、反应过程较易控制、产品纯度高且在一定条件 下可以定位酶解,可以较好地满足肽的生产需要,是生物活性肽的常用方法。化学 水解法:化学水解法是将蛋白质与一定浓度的酸和碱混合,加热至一定温度并保持 一定时间,使蛋白质的肽链裂解。该方法简单、成本低,但氨基酸受损严重、活性 难以保持,水解程度难于控制,食品工业中通常不采用这种方法。提取法:提取法 是从动物中提取出一些天然存在的抗氧化肽,因生物体内天然抗氧化肽的含量极 少,原料来源有限,其提取分离纯化成本较高、提取难度较大,故这种方法难以大 规模推广。. 蛋白质水解得到的抗氧化肽 目前抗氧化肽主要是蛋白质通过酶法水解和化学水解法而来的。酶解法是指拿 人体所需要的食品级蛋白酶碱性或酸性,水解人类可食用的蛋白质,从而使肽 键断开,制备小分子的生物活性多肽。酶解法条件较温和,可以进行选择性的水解 肽键,且对蛋白质的营养破坏小,得到的水解蛋白非常高效。化学水解法有些缺陷, 那就是碱或酸的作用位点不是特别明确,加上反应环境比较极端,很容易破坏多肽 的生物活性,同一处理方式采用不同的处理时间,得到的多肽可能也会大不相同。 从以上对比可以看出,酶法比化学法更容易生产出高效稳定的短肽,因此人们一般 采用酶法水解蛋白质制备多肽,酶法水解也逐渐被广大的研究者所认可。研究者主 要从废弃蛋白、海洋蛋白和大宗优质蛋白质中制备具有抗氧化的生物活性肽【】。陈文献综述 丽花等研究发现了大豆蛋白水解物具有抗脂质过氧化,清除超氧阴离子自由基等抗 氧化作用【】;张强等以玉米蛋白粉为原料得到了抗氧化肽【】;聂慎德报道了菜籽清 蛋白的水解物可以提高大鼠的抗氧化能力;孙红等用玉米作为原料分离得到玉米 多肽,经过一段时间的喂养小鼠,证实了玉米多肽有抑制肝细胞脂质过氧化反应的 作用,从而保护了肝细胞的功制。 抗氧化肽的作用机理 目前抗氧化肽的作用机理还不清楚,一般来说,构成多肽的氨基酸种类、数量 和排列顺序决定着多肽的抗氧化活性:此外,抗氧化肽的抗氧化活性还与多肽中含 有的某些可与自由基反应的特殊集团供氢集团有关,只有这些多肽在适当分子 量时,其特殊集团才可能得到最大的暴露而与自由基充分反应,表现出较强的抗氧 化活性【。引。 ...降血压酞 血管紧张素转换酶概述 血管紧张素转换酶是一种主要存在于血管的内皮细胞中,含的二 肽羧基肽酶,其中肺毛细血管中的含量最多【. 。它是由一个肽链组成的、含大聚 糖的膜结合酶,分子量约为...,等点电是.,沉降系数., 是维持该酶活性所必需的离子?】,’是最有效的酶激活剂。’血管紧张索转化酶.、 、舒缓激肽、溴化镉等是血管紧张素转换酶最有效的抑制剂,除此之外,金 属螫合剂、重金属盐类和某些肽类也能对该酶活性起到抑制作用。已有试验证实血 管紧张素转换酶有较宽的底物专一性,不仅可以作用于血管紧张素,而且可与氨 基酸残基的肽底物发生反应。 抑制肽概述 抑制肽是一种能够抑制血管紧张素转换酶活性,同时亦可以发挥 一些其他的生理活性的一类多肽类物质。天然抑制剂大部分是多肽,三萜类 物质除外【】,含有.个氨基酸残基,分子量小于道尔顿。抑制肽通 过与结合当端氨基酸是一些芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 和含亚氨基的氨基酸脯氨酸时,结合效果最佳:当端氨基酸是含两个羧基的 氨基 酸时,结合效果最差,阻止血管紧张素转化为血管紧张素,同时增加脑啡肽 和舒缓肽的水平【 ,从而达到降压的作用。 ...免疫肽 某些生物活性肽具有免疫调节作用,它们基本来源于动植物体内,随着科学技 术的发展,人类对具有免疫调节作用的活性肽的不断了解,它的功能被不断发现, 研究也越来越多。猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 ...抗菌肽 抗菌肽是一种具有先天免疫功能的、普遍存在于自然界的防御因子。它能够抵 抗外界病原微生物入侵,与人工合成的抗生素相比,它具有热稳定性好、水溶性好、 分子量低、抗菌谱广【 】等特点。关于抗菌肽的作用机制研究较多,从现行的抗菌肽 的作用模型可知,抗菌肽可通过在细胞膜上形成离子通道,从而造成内容物大量外 泄,最终导致细胞死亡。此外,还有一种现象表明,抗菌肽可以通过抑制细胞呼吸、 外膜蛋白合成、抑制细胞壁形成等作用以便杀死细菌。 ..功能性食品 ...功能因子 所谓功能因子,指在功能性食品中起特定生理保健功能作用的成分。目前功能 性食品中含有的功能因子主要包括活性肽、活性多糖、活性蛋白质、多不饱和脂肪 酸、类脂、皂甙类、胆碱类、酮类、维生素、矿物质、乳酸菌、双歧杆菌等婚。 部分参与生理功能,部分具有防病治病的功能【引。 在这些功能因子中, 不同种功能因子的含量不同,则会产生不同的功效;不同功能因子的结构不同, 则稳定性不一,作用机理也就大不相刚】。功能因子可以分为以下几类‘抗 疲劳的功能因子;抗疲劳的功能性食品的功能因子主要有营养素类蛋白质、氨基 酸、矿物质等和非营养素类多糖等:增强免疫功能的功能因子;增强免 疫功能的功能因子主要有蛋白质、肽类、多糖、益生菌双歧杆菌和乳酸菌、茶 多酚、皂甙等;增强抗氧化的功能因子;抗氧化的功能性食品的功能因子主要 是植物多酚。植物多酚类物质具有抗氧化、抗衰老等多种功效;减肥功能因子; 减肥功能性食品的功能因子主要有桑叶提取物、肉碱、脱乙酰壳多糖、辣椒素、共 轭亚油酸等;抗过敏功能因子;抗过敏食品的功能因子主要有多不饱和脂肪酸 和多酚类物质。 ..功能性食品的简要概述 功能性食品这一专属名词出现于年,由日本最早提出。由于东西方文化 背景的不同,目前世界各国对功能性食品仍无统一的定义。在我国将其称之为功能 性食品保健食品,功能性食品是指具有特定保健功能机体防御、机体调节、 疾病防治、健康保持等或者以补充维生素、矿物质为目的的、对机体有调节功能 的功能性食品【?。年月日颁发的《保健食品管理办法》中第条规定“功 能食品保健食品系指表明具有特定保健功能的食品,即适宜于特定人群食用, 具有调节机体功能,不以治疗为目的食品”。 功能性食品经历了个发展阶段。第阶段的功能性食品是根据功能因子的成文献综述 分推断食品的功能,未经过验证,缺乏科学性:第阶段的功能性食品是指通过了 动物和人体试验,证实其确实具有调节生理的功能:第阶段的功能性食品在第 阶段的功能性食品的基础之上,又进一步研究了其功能因子的结构、含量和作用机 理等】。 功能性食品强调,它含有的某些成分必须充分显示出防御功能、调节生理、预 防疾病和保护机体健康等功能【】。因此功能性食品必须具备以下几个条件【】:?无 毒无害;?必须明确其功能成分,且经过科学验证的,与此同时,不可代替正常的 膳食摄入和各种必需氨基酸的需要;?是针对特定人群生产的:?不以治疗为目的。 ...我国功能性食品发展现状 从几千年前中国的医药文献记载中医食同源、食疗、食补可以看出,我国 功能性食品的发展历史悠久。在进入世纪年代以后,一方面,人民的生活水 平逐渐提高,对食品的要求不仅仅是可以供给机体新陈代谢和生长所必需的营养物 ,而是更关注食品在调节身体各项机能,促进身体健康等方面的作厍;另一质 方 面,过多摄入食品导致的疾病亦呈现上升趋势,人们对功能性食品的渴望大大促进 了我国功能食品行业的迅猛发展。 在有关生理机能的应用基础研究比如增强机体的免疫调节功能、增强自身组织 细胞的新陈代谢能力,提高血清中超氧化物歧化酶的活性等方面,基本上已 经开展了一些研究工作,形成了具有一定科研能力和一支初具规模的科研队伍。功 能性食品发展迅速,主要呈现在如下几个方面。 种类较丰富,产品更具针对性,新产品开发卓有成效; 植物类、动物类、生物活性物质、真菌类、益生菌类等几种是我国功能性食品 的功能因子。我国功能性食品行业迅速发展,使得在食品配料的功效和功能性食品 的产品开发方面,也越来越具有针对性,从企业自身来说,他们开始根据年龄、性 别、饮食情况、基因差异、健康状况、生理水平的不同,提供给专属个人的营养健 康,针对不同阶段的人群开发不同种的功能性产品。从近几年来看,功能 性食 品的新产品数量呈逐渐增长趋势,根据国家食品药品监督管理局的网站数据得知, 仅在年一年中,批准的新功能性食品保健品的数量就达到多种,其 中绝大部分是以低聚异麦芽糖、赤藓糖醇、低聚果糖、、低聚半乳糖等功能糖醇 加大对功能性食品为功能因子开发的新产品。国家政府设立专项研究课题, 的支持 力度,也加强了对功能性食品的监督、检查和管理,使得功能性食品的质量有了明 显的提高;企业则致力于借鉴、引进国外的先进技术,加大了技术研发的投入,攻 克了一批技术难题;从某种层面上看,无论从国家还是企业都已经认识到了产品质 量的重要性。 国家逐渐增大支持力度:猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 在国家“十二五”目标规划中,针对慢性疾病,已经引起有关部门高度重视,纳 入成为我国预防医学的首要目标。为了迎接新的挑战,人们健康意识大幅上升,国 民身体素质需要提高,在功能性食品的发展方面,政府也持续加大公共财政支出和 人力资源投入。 亟待解决的几大问题; 我国的功能性食品产业正处在迅猛发展的阶段,正是由于这一阶段的出现, 将 使得功能性食品产业发展中仍然存在一系列不可避免的问题。?功能性食品的消费 地区分布较不均匀,我国功能性食品的消费主要区域集中在北京、天津、上海、江 苏、广东、深圳等经济发达城市,其它地区分布则很少;?功能性食品的产品类别 较为集中,一些功能主要体现在免疫功能调节、排毒养颜、健脑益智、减肥、滋肺 补肾等方面团,涉及到目前一些发生率较高的亚健康类疾病,还处于基础研究阶段; 相关的功能性食品很少;?功能性食品的企业规模普遍较小,就功能性食品的研发 方面投入相对缺乏,上市公司所占比例较少,功能性食品企业在资金运转、实力、 创新能力和营销模式等方面仍然有待进一步改进;?虽说功能性食品产业在总体上 来说进步较快,但功能性食品的产品质量仍然参差不齐,有一些企业产品品质有待 提高;?更加科学、严紧的功能性食品的体系有待完善,提高警惕,面对强势 进入中国市场的国外品牌的挑战:?应重视我国的特有资源,促进属于在国际上领 先的、并且初步具有规模的天然提取物功能性食品的发展引。根据市场需求,深入 调查研究,结合国家西部开发战略,实现现有丰富自然资源的产业化,提高功能性 食品的质量和竞争力。 ...功能性食品的发展趋势 ,第代功能性食品已经成为研究的重点 第一 随着科学技术的发展,功能性食品加工技术也有了很大进步,未来功能性食品 的会向着多元化方向发展,配方更科学、食用更方便,加工更精细、功能更明确、 效果更显著、形式更多样。中药学、动植物生理学、食品加工、食品营养学、生物 化学等多学科的基本知识与功能性食品的研究密切相关。功能性食品的功效主要依 赖功能因子,它所具有的生理活性成分对人体生命活动的规律调节具有重要意义。 因此,这些功能因子的功效必须经过动物和人体实验,它的结构、作用机理必须明 确,生理活性应该较为稳定、不会随着外界因素的变化而变化,这类产品的开发研 究将会成为今后功能性食品产业发展的重中之重。推动功能性食品的升级换代,使 第三代功能食品具有明确量效和构效,走向国际市场,参与国际竞争。 第二,发挥天然资源优势 目前我国的功能性食品绝大多数是采用多种药食兼用的中药来配制、建立在食 疗基础之上的。这就要求在现代功能性食品的研究基础上,充分利用天然植物、动文献综述 物的提取物资源,既要研究其中的功能因子和功效成分,还要研究包括如何去除这 些天然原料中有毒物质等方面的分离纯化这些活性物质的稳定的工艺技术。我国某 些药物如银杏红景天、人参、红曲、灵芝等药食同源的优势已经得到了人们的广泛 认可,进一步研究它的安全性、功效性,使这些具有多种生理活性的天然资源成为 功能性食品开发的主要原料来源。 第三,在功能性食品产业生产中加强高新科学技术的应用 从分子学、细胞学、器官学等生物学水平上研究功能性食品的功能因子的结构、 功能性成分的功效和功能因子的稳定性,将食品加工技术相关的学科知识、先进的 科学仪器和高效的试验手段相结合,开发出一批功能因子明确的、功效成分安全的、 具有知识产权的功能性食品。采用现代高新科学技术,例如生物技术、现代分析检 测技术、膜分离技术、微胶囊技术、超微粉碎技术、超临界流体萃取技术、干燥技 术冷冻干燥、喷雾干燥和升华干燥、无菌包装技术等,实现从天然原料中提取其 活性成分,然后以各种有效成分作为原料,根据不同的科学配方比例,确定科 学合 理的加工工艺,进行配制、调味、重组等加工处理,最终生产出一系列名符其实的 兼具科学、营养、健康的功能性食品。 ,实施名牌战略,建立品牌效应在未来几年甚至几十年里,应大力着手扶 第四 持并组建一些功能性食品企业,提高品牌信任度、知名度、功能性食品的科技含量, 同时也使之成为功能性食品行业的龙头企业,借以带动整个功能性食品行业的快速 健康发展。运用更多的保健知识、传播健康理念,让消费者运用自己获得的保健知 识.自愿去选择合适的功能性食品。与此同时,致力于功能性食品行业的科技工作 者们,更应该加强应用基础研究,加快产品开发与研发。加快提高功能性食品的科 学技术含量,使我国的功能性食品走上一条具有中国特色的健康快速发展之路,为 我国功能性食品的研究与开发做出应有的贡献。 第五,管理规范化 我国应致力于政府的监管部门和功能性食品企业自身的规范化管理。《食品安 全法》、《保健食品注册管理办法》等一系列重要的法律法规文件的相继出台,预示 着我国政府对功能性食品行业的监管力度正在逐渐加大。随着生活节奏的加快,生 活水平的逐步提高,一些患有肥胖症、冠心病、糖尿病的人群不断增加,亚健康问 题凸显出来,在这个大背景下,功能性食品必将愈来愈受到消费者的普遍欢迎。 我国政府管理部门的逐渐规范化,也将为消费者大力购买功能性食品提供经济保 在今后一段发展时期,功能性食品行业必将发展成熟,功能性食品障。因此, 必将 在促进全国人民的身体健康、疾病预防方面彰显其独有魅力,发挥重要作用。 总之,应加强功能性食品的基础性研究,加快产品开发速度,提高产品的技术 含量,并在此基础上规范相关法律法规,使功能食品发展走上一条独具特色的长远 健康发展道路,为功能性食品的进一步研究与开发奠定基础。猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 .蛋白质酶解产物在食品方面的应用 蛋白质这一多肽类物质在酶的催化作用下,会发生脱酰胺反应。供人类食用的 大分子蛋白质被酶水解,大分子被切割成为小分子的短肽,甚至游离的氨基酸,此 时的小分子肽和氨基酸就发生了功能性质等的变化。故蛋白质酶解后的产物可以按 照结构不同和性质差异分为两大类;从结构上说有多肽、短肽、氨基酸等,从性质 差异上有不同物理、化学及感官性质差异的氨基酸。这样从酶解产物上看来,我们 可以利用的主要集中在以下几类:?将酶解产物作为必需氨基酸,单个利用氨基 酸,可以当做某些功能因子加入到运动饮料等各类食品中;?利用酶解后的短肽 和多肽的生理活性;例如经过酶解的酪蛋白酪可以生成蛋白磷酸肽,这种蛋白磷酸 使不溶性的钙盐变成可肽作为肽片段可以与小肠下部食物中的磷酸钙结合, 溶解状 态,促进钙吸收;?利用短肽和多肽的物理化学特性;肽是由氨基酸组成的,故 氨基酸具有的性质多肽也有,肽作为一种两性电解质,当其具有特定的肽链长度和 电荷密度时则表现出特定的表面活性,如面筋蛋白质酶解产物可以用作乳化剂、发 泡剂、增稠剂等;?利用肽和氨基酸的一些感官特性:作用食品风味的增强剂, 如鲜味剂、甜味剂、苦昧剂等。营养学研究表明,人体的健康状况与膳食有关,我 国已公布了属于功能性食品的多种保健功能,包括辅助降血压、抗氧化、增强免疫 力、辅助降血脂、辅助降血糖、缓解体力疲劳、调节肠道菌群、促进消化、通便、 增加骨骼等,并允许这些保健功能以外的新功能出现】。猪的胎盘来源广、数量 多、开发成本低,所以有极大的开发价值。因此从某种程度上说,探求制备猪 胎盘 功能性肽的最佳工艺参数,对其成分进行深入研究,可为我国的功能性食品开发提 供有用材料与方法,旨在促进猪胎盘的深度利用,对增强我国人民保健意识,具有 深远的影响。 胎盘和胎盘肽 . ..胎盘 ...胎盘的简要概述 胎盘,又名“紫河车”实质是指胎儿胎盘,在胎儿出生时排出体外。胎儿可 以通过胎盘与母体进行物质能量交换,胎盘还可使尿膜.绒毛膜和子宫黏膜发生联系, 所以,胎盘是一种暂时性的、特殊的功能组织器官。哺乳动物与人类的胚胎发育类似, 均依赖于胎盘,其中胎儿生长发育所需的养分就由胎盘供给。《本草纲目》中记载有: 胎盘“性温,味甘咸,入肺、入肝、肾三经,具有安神养血、补气、益精、解毒、 补血的功效,对疲劳、消瘦、衰弱者有奇特效果,久服则耳聪目明、须发黑、延年益 寿、有夺造化之功效”。胎盘性温、味甘咸,归心肺肾经,益气养血,温肾补精,故文献综述 称胎盘为贵重的滋补中药,煮食法是人们最早发明的方法,将新鲜胎盘去除脐带,反 复冲洗胎盘直到血液等去除干净,将其蒸熟,更有人将其置于沸水中略煮熟, 常见的 大多是又经过一步干燥后制成的。现代生物学和医学的研究证明【:胎盘含有生物活 性多肽、免疫球蛋白、氨基酸、矿物质、细胞因子、生长因子、磷脂、多糖 因此 等, 从某种角度上说它的成分比较复杂,无论是从传统中医学角度,还是从现代医学角度 来看,胎盘及其提取物都具有极大的开发和应用价值。 .胎盘的主要功能 胎盘具有以下几种主要功能: 首先,胎盘具有抗衰老的作用;体内胞膜性结构中的不饱和脂肪酸在受到氧等 自由基的作用后会产生一种被称作过氧化脂的脂类过氧化反应产物。这种 脂质过氧化反应,会使细胞膜结构和功能受损从而引发多种疾病,如蛋白质分子内 和分子间交联形成代谢产物,蛋白质变性,的结构断裂,更有严重的情况甚 至引起细胞的衰老死亡。氧化一还原酶体系存在于正常机体内,它可以不断地清除 过多的过氧化脂等生命体不需要的副产物,从而维持体内的平衡。胎盘的提取物也 具有这种功能,它可以清除超氧阴离子自由基,从而可以使机体免受损伤。超氧物 简称是一种酶制剂,它具有两方面的作用, 歧化酶 一方面减轻体内组织细胞过氧化损伤,降低过氧化脂的形成:另一方面分解 过多的 过氧化物,从而减少机体衰老的进行,对机体起到保护作用。刘少娟掣】报道,羊 胎盘提取物可以提高果蝇体内超氧化物歧化酶的活性,减少脂质过氧化, 给健康小鼠灌服羊胎素,测定小鼠中红延长果蝇的寿命。陈新霞等【”报道, 细胞和 组织中超氧化物歧化酶、丙二醛活力,结果发现鼠红细胞中超氧化物歧化酶 含量明显升高,血清和肝组织中丙二醛、低脑组织中单安氧化酶活性均有明显降低。 刘士山等闻报道羊胎素可以使小鼠心肌褐质、血清中丙二醛含量均降低,血清中超 氧化物歧化酶活性升高。以上研究工作者的试验结果均表明,胎盘及其提 取物具有显著延缓机体衰老的作用。 其次,胎盘具有护肤的作用;王亮等通过试验发现,胎盘的组织提取液可 以促进新生小鼠的表皮细胞增殖,加强小鼠新陈代谢的功能,由此可作为功能成分 添加到化妆品实际生产中去,可以使皮肤更富弹性、更具光泽,防皴防裂,还具有 促进伤口愈合和皮肤收敛的功效。 再次,胎盘具有免疫调节.】的作用;苏是煌等【】研究发现,胎盘可以提高 正常小鼠的淋巴细胞比率,而对淋巴细胞总数无明显影响;强的松降低淋巴细 胞的比率、淋巴细胞的数量及胸腺指数,使胸腺髓质区域扩大,导致胸腺退化,胎 盘则能对抗由强的松引起的免疫抑制作用。胎盘在肝功能方面还有重要作用, 它可 恢复肝功能,使其正常,并恢复酶的固有活性,可以显著治疗肝炎;可以使正常小猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 鼠和放、化疗小鼠的脾脏和胸腺明显地增重,并且可以增强淋巴细胞和淋巴细 胞的功能,间接杀死肿瘤细胞;胎盘还具有抗凝作用【。 此外,在提高机体的缺氧代偿能力和缺氧耐受力方面,胎盘及其提取物还具有 明显的预防和治疗作用。 ..胎盘肽 ...胎盘肽的简要概述 胎盘肽的研究和发展可以追溯到上个世纪八十年代,从那个时候开始,我国的 多位科研工作者就着手开始研究胎盘。最早是从健康产妇的胎盘研究开始,从中提 取了一种小分子的活性物质,称之为胎盘肽。胎盘的研究首起于我国,它作为一种 新型的免疫调节剂,近年来引起了科研工作者的广泛关注和研究。目前己得知胎盘 肽是一种由核苷酸、氨基酸和肽类等小分子物质组成的混合物】,其中小分子多肽 是它的主要活性成分。胎盘肽可以进行透析、可以超滤、性质比较稳定,其生物活 性在.。下可保持一年不变,在?下加热 ,其生物活性也不会有明显的 .范围内,它仍然具有良好的生物活性。从开始发现胎盘肽,它 丧失,在 就引起了医药界和保健品界的高度重视,众多科研工作者致力于胎盘制品的开发和 研究,已经取得了很大的进展。近年来通过试验研究和临床应用观察证实胎盘肽具 有多种生物活性,并且它对病毒性疾病、免疫缺陷性疾病及恶性肿瘤性疾病等均有 较好的临床效果,已初步将它应用于临床治疗。胎盘肽作为一种新的免疫增强剂和 。 调节剂近年来也引起了广泛的关注【 胎盘肽,也被人称作免疫调节因子或胎盘因子,是一种透明液体,且外观呈现 微黄色,它又称生物活性肽,是指由多种天然氨基酸以不同的排列和组合方式构成 的、对生命体的生理活动过程有益的多功能肽类物质【?。从它的来源考虑,主要 有三种:各类天然活性肽,主要存在于各种生物体中;自然消化过程中产生的或者 蛋白质水解产生的各种活性肽;通过化学方法、酶法、重组技术等合成的生 物活性肽。在这些具备生物活性的功能性肽中,有些如类吗啡因子和酪蛋白磷酸肽 等已经作为功能因子添加到了功能性食品和药物的工业化生产中,并已经取得了巨 大的经济和社会效益,这就充分展示了生物活性肽的良好的开发和应用前景。 ...活性肽的主要制备方法 第一,活性肽的溶解; 生物活性肽主要来源于各类蛋白质,在提取时首先应对其进行溶解。在溶解过 程中的第一步是细胞破碎和固液分离,这一步也是分离纯化阶段的重要环节。其中 影响着生物活性多肽的回收率和纯度的直接因素就是溶解程度的高低。细胞破碎的 常选方法是组织匀浆法,它的原理是通过固体剪切力来将细胞破碎,使细胞中的多文献综述 肽或者蛋白质进入到溶液中,然后进行下一步的提取纯化。匀浆器有四种类型,内 切式组织匀浆器、玻璃匀浆器、刀片式组织破碎匀浆器和压匀浆器,其中后者主要 用于大规模生产。 第二,酶解法; 将细胞壁或者细胞膜利用生物酶制剂溶解消化,从而使细胞内内容物释放出来 的方法就是酶解法。利用此法时应注意,要根据所需酶解样品的细胞结构和化学组 成等因素来选择合适的酶,酶解过程中还要控制好温度、和酶的用量等要素。 酶解法的操作条件比较温和。专一性较强,回收率也相应较高,故酶解法己经广泛 应用于蛋白质或多肽的制备。李妍等用酶解法制备了蛋清蛋白多肽,若将它作为 食品配料应用到功能性食品工业中,张玲华等【】用菠萝和木瓜蛋白酶双酶解法制备 大豆蛋白多肽,皮钮珍等【】用木瓜和胰蛋白酶这两种酶水解制备鹿胎盘生物活性多 肽均取得了成功。 第三,超声波破碎法; 运用强烈的超声波,造成所需破碎物溶液中气泡增大,进而爆裂,最终通过机 械剪切力使细胞破裂的方法称之为超声波破碎法。这种处理方法效果较好,所需样 品少,频率为,在实验室中广泛应用。 除了以上提到的方法之外,活性肽的制各方法还有冻融法、渗透压冲击法等。 目前,超滤法延伸的可控酶解法是制备胎盘多肽的主要方法。 .。。生物活性肽的分离纯化 生物体内的天然活性物质是提取功能性短肽的重要来源,已经发现了几百种具 有不同功能的生物活性肽。它们都具有属于自己独特的结构和生理功能,为了更好 地加以利用,就要研究其中结构与功能的关系,这就需要将天然活性物质从复杂的 生物体中分离纯化出来。因此,天然活性肽分离纯化的可行方法的研究是科研工作 者们一直以来比较关注的重点引。在分离纯化工作中,由于肽类具有较好水溶性, 组织和结构较不稳定,使褥肽类的分离和纯化难度加大,必须采用合适的分离纯化 技术,必要时将这些技术进行合理的组合,才是分离纯化活性肽的关键【。随着现 代科学技术的迅猛发展,一些新方法与新思路不断出现,使得分离纯化手段也不断 常见的方法有透析法、创新并逐步得到改进。分离纯化活性肽的方法很多, 超滤法、 。 电泳法、高效液相色谱法、柱层析法等 透析法是利用在溶液中小分子物质可以通过半透膜,而大分子物质不能通过半 透膜的这种性质达到分离目的的方法。例如分离和纯化蛋白质、多肽等物质时,可 用透析法来除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之透析法也可以将大分子留在半透 膜内,而使小分子的物质通过半透膜进入膜外的溶液中。透析膜的规格是透析法成 功的关键,透析膜的膜孔有大小之分,要看被分离成分,根据具体情况选择。透析猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜硫酸纸膜、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。使 用方法一般为将常用市售的玻璃纸膜或动物性半透膜扎成口袋状,外面套上尼龙网 袋,也可不用,小心加入想要透析的样品溶液,扎好袋口,悬挂于清水容器中。经 常更换清水可使透析膜内外溶液的浓度差加大,必要时可以辅助加热、搅拌、 通电, 加快透析速度。透析膜内溶液是鉴定透析完全与否的,应对其进行定性反复检 查。透析法比较适合小体积样品的浓缩小于。葛瑞宏纠采用组织破碎、 反复冻溶、透析法分离出了具有免疫调节和抗衰老功能的羊胎盘肽。 超滤法又称超过滤,它允许水和低分子量溶质透过半透膜,截留水中胶体大小 的颗粒。超滤是膜表面机械筛分、膜孔阻滞、膜表面和膜孔吸附的综合作用的结果, 其中以筛滤为主。它是一种加压膜分离技术,即在一定的压力条件下,被分离物质 通过合适孔径的特制半透膜. ,其中大分子物质不能通过半透膜而被截留, 小分子和水通过半透膜从而达到分离纯化目的,此法特别适合于小分子肽的分离纯 化。超滤膜一般由聚酞胺、聚矾、聚氯乙烯等材料制成,在.和许多有机溶 剂存在时可以使用,耐热稳定性可以达到?。影响超滤的因素有样品的浓度、流 速、压力.、超滤膜以及超滤系统,在超滤前,通常对样品进行微滤以便除去杂质, 这样可以减少杂质对超滤膜的污染,进而提高超滤效率。周国华等【了】采用超滤法从 牛和羊的胎盘中分离到了胎盘肽,张晓楠等【】就超滤在蛋白质纯化中的应用做了比 较详细的说明。 电泳法是溶液中带有的不同电量电荷的阳离子或阴离子的带电性质、大小、形 状等性质的差异,在外加电场的作用下,产生不等的迁移速度向电极移动,借以达 到分离、鉴定或提纯的目的的方法。蛋白质电泳可分为聚丙烯酰胺凝胶电泳、 双向电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳等技术。 是一种从复杂混合物中分色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术, 离 不同组分的有效分离纯化方法。不同物质在固定相和流动相构成的体系中具有不同 的分配系数,它就是利用这个原理,当两相做相对运动时,被分离物质随着流动相 运动,并且在固定相和流动相间进行反复多次的分配,从而使被分离物质的各个组 分达到分离。色谱有很多种,按固定相的类型和分离的原理可以分为吸附色谱、大 孔吸附树脂、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、凝胶色谱、聚焦色谱等。最常 用的色谱分离技术是吸附色谱分离技术,常用的极性吸附剂有硅胶和氧化铝。硅胶 显示弱酸性,适于分离酸性和中性化合物,当分离生物碱时需在流动相中加入适量 的有机碱;氧化铝呈碱性,常用来分离生物碱等碱性成分。亲和色谱亦称为亲和层 析,常在凝胶过滤色谱柱上连接分子,这些分子与待分离的物质有相应可逆 结合能 力,在改变流动相的条件时这二者可以相互分离,故亲和色谱是一种利用固定相的 结合特性来分离物质的色谱方法。它可以用来从某一混合物中纯化或浓缩指定分 子,也可以用来去除或者减少某一混合物中某些分子的含量。对生物活性肽类物质文献综述 的分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和,亲和色谱可以将一对能可逆 结合并解离的生物分子的其中一方作为配基也称为配体,与具有大孔径、亲水 性的固相载体相偶联、制成专一性较强的亲和吸附剂,并将其填充色谱柱,当被分 离的混合物随着流动相流经色谱柱时,亲和吸附剂上的配基选择性地吸附能与其结 合的物质,而其他的蛋白质和杂质流出色谱柱,最后使用合适的缓冲液使得与配基 结合的物质与配基实现解吸附,即可达到分离纯化的目的。离子交换色谱可以分为 阳离子交换色谱和阴离子交换色谱两大类,它是按照被分离物质所带电荷的差异而 进行分离的一种方法。它的固定相是一些通过静电的相互作用与带相反电荷的离子 结合的带电荷的基团,假如流动相中存在其它带相反电荷的离子,按照质量作用定 律,这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电时,其可 交换离子为阴离子,即为阴离子交换剂;固定相基团带负电时,其可交换离子为阳 ,即为阳离子交换剂。阴阳离子交换剂的功能团分别是、一和一 离子 、,其中小离子交换剂及.离子交换剂属于强离子交换剂, 它们在很广泛的范围内都有离子交换能力;及.离子交换剂属于弱 离子交换剂,只有在特定的值范围内,才能有离子交换能力。洗脱剂的值 和离子强度是对分离效果影响最大的两个因素,应根据所需要分离的多肽类物质的 性质来选择适宜的离子交换剂,控制洗脱条件。离子交换色谱主要用于能够电离的 化合物的分离,如多肽和蛋白质的分离,核苷酸和各种碱基的分离等。 高效液相色谱法是世纪年代末发展起来的一种新型分离技术,它的出现 为多肽类物质的分离纯化分析提供了便利手段。高效液相色谱法 又称“高分离度液相色谱”、“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“近代柱色谱”等。它属于色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采 用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂、不同比例组成的混合溶剂、缓冲液 等流动相泵入装好有固定相的色谱柱内,各个成分在柱内被依次分离,然后进入检 测器进行检测,从而实现对样品的分析。高效液相色谱法具有样品量大、分离速度 快好、回收率高等特点。近年来已经被成功用来分离纯化和制备生物活性肽,成为 高效的分离纯化多肽类物质的一个最有力手段。反相高效液相色谱与由极性固定相 和弱极性流动相所组成的液相色谱体系正好相反,它是由极性流动相和非极性固定 相所组成的液相色谱体系。根据极性流动相中被分离物质疏水性不一进而发生强弱 不同的作用,使其在固定相和流动相中分配不同,从而进行分离纯化的色谱方法。 反相高效液相色谱.典型的固定相和流动相是十八烷基键合硅胶,甲醇 和乙腈。反相高效液相色谱法适用于分离极性、非极性和离子型化合物,它几乎可 用于能溶于极性或弱极性溶剂中的所有有机物的分离,是当今液相色谱法中的最主 要分离模式。 目前,仍有很多生物活性肽的研究尚处于基础试验阶段,在分离纯化上还没有猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究 形成一套完整有效的方法。但是随着研究方法和手段的不断提高,基因工程技术的 迅速发展,利用细胞培养技术和重组技术分离纯化、生产生物活性肽,探索 更多生物活性肽的特殊功能,大大地提高其产量和纯度,市场开发前景必将更为宽 广。 ..生物活性肽分类和主要功能 生物活性多肽物质自 年首次发现以来,其研究也日益受到各国科研工作 者的广泛关注。生物活性肽在信息传递方面起着举足轻重的作用,它是沟通 细胞与 细胞间、器官与器官间的重要化学信使,并通过内分泌、旁分泌和神经分泌等方式 来传递各种特异信息,进而调节生长发育、繁殖代谢和自身行为等生命过程【。因 此,对生物活性肽的主要功能的研究具有重要的理论和现实意义。 生物活性肽具有多种多样的生理功能,如抗氧化作用、免疫调节、抗高血压、 降低胆固醇、抑制细菌、病毒和抗癌、改善矿质元素吸收、促进骨骼生长、调节食 品口味等。因此,生物活性肽是功能性食品配料、新型药物来源的天然资源宝库。 首先,生物活性肽具有抗氧化功能: 目前在功能性食品生产中使用最多的是化学合成的抗氧化剂,虽说化学合成的 抗氧化剂的效果较好,但对人体自身的某些器官如肝、脾、肺等均有不同程度的伤 害,因此可以从某种程度上说,合成抗氧化剂并不安全。由此高效、安全、低毒的 天然食品抗氧化剂如抗坏血酸、生育酚、儿茶素等,成为科研工作者的一大研究热 点。生物体内天然抗氧化肽主要是含量较低的肌肽和谷胱甘肽,前者具有很强的抗 氧化活性,可以抑制超氧阴离子自由基和脂类氧化,能延缓细胞功能的衰老,具有 广泛的细胞保护作用。近年来,国外一些学者已经从多种食物蛋白酶酶解液 中分 离出了具有抗氧化活性的多肽片段,研究的原材料主要有大豆蛋白、肉类蛋白、海 洋蛋白、废弃的蛋白资源等优质蛋白资源,国内科研工作者对抗氧化肽的研 究表明, 自然界中许多动植物蛋白在适宜的条件下水解都可以产生抗氧化肽。 其次,生物活性肽具有免疫调节功能; 在胸腺环境中,胸腺肽在初期可以促进胸腺内的骨髓干细胞转化为淋巴细胞,