[doc] 雷公藤总甙对T细胞增殖的抑制作用部分经由cAMP

[doc] 雷公藤总甙对T细胞增殖的抑制作用部分经由cAMP 雷公藤总甙对T细胞增殖的抑制作用部分 经由cAMP 78 ? 276?中国免疫学杂末1992年第8卷第5期 雷公藤总甙对T细胞增殖的抑制作用部分经由cAMP 笔.春丽R踢2,(中国医学科学院基础医学研究所,北京100005)…. (摘要]用0.15/mlPHA诱导T细胞活化作模型,发现TI(5/m1)和BtlcAMP(500m)均船抑 制T纽胞从Go相进入G”相和从G.相进入G.相.井抑村活化抗原TacIaT.和4F2的表达.TJ和 Bhc.AMP还抑制播化B细胞在外源性IL一2诱导下进人s相和G/M相.另外,TI和Bt~cAMP还抑恻T 细胞在1-5/~glralPHA诱导下产生IL一2.T?和BttcAMP的上述作用十分相似.有趣的是,TJ和T细胞一 起培养30小时?T细胞中cAMP量明显增多.cAMP增加程度与TI剂量正相关.上述结果提示,TI对T 纽匏增殖的抑割作用至少部分经由cAMP. [关键i习)置垒盛盛述(TJ)堂楚!塑碑增殖 我们在研究中观察到,雷公藤总甙(TI)对 PHA诱导的人T细胞增殖有抑制作用,其抑翩点 在细胞周期的Go一?GG一Gb,G一s,和 s—G2/M(朱立平等.巳投送中国免疫学杂志). 进,步的研究还观察到,TI对人T细胞的IL一2 自泌环路有抑制作用,亦即能抑制IL-2受体表达, 抑翩IL一2产生和活化T细胞对lL一2的反应(董 彦章等-已投送中国医学科学院).T细胞的IL 一 2自泌环路(autog~ne)和旁泌环路(paracdne)在 T细胞抗原受体(TcR)交联所致的T细胞增殖中 起重要作用”.T细胞的1L一2自泌环路受cAMp 调节cAMP在G相中点抑制3T3细胞增殖.,抑 诒jT细胞产生IL一2[1和抑铷活化T细胞在IL一 2(内源和外源)诱导下进入s期..这些作用和我们 观察到的T一的作用非常相似.本研究对Tl和 cAMP抑制T细胞增殖的作用作了进一步比较,发 现二者的作用极为相似,而且还观察到TI能诱导 T细胞中的CAMP量增加,提示T的抑制作用可 能至少部分通过cAMP增加. 材料与方法 一 人T淋巴细胞的分离与纯化 应用密度梯度离心从健康成年入外周血分出单 个榜细胞(PBMNC)后,再用AET革红细胞玫瑰花 结法和垃尼龙毛柱的方法得到纯他的T淋巴细胞. 方法详见参考文献 二PHA诱导T细胞活化和增殖的展住荆量的 选择 为诱导T细胞从G.相进入G相(活化剂量,, 不同剂量PHA(Sigraa,美国)于培葬开始时加入T 细胞悬液中,T细胞密度为lxl0,mI在37?,5 CO.孵箱中培养72小时后收获细胞+用吖啶橙 国北京协和医疏内科 (AO)(Polysc[ene,莞国)染色,在谎式细胞仪上测定 DNA和RNA-并分析细胞周期.为研究Tl的抑制 作用-不同剂量TI与播化荆量或增殖剂量的PHA 一 起加人T细胞悬液中. 三.TI最佳剂量的选捧 不同剂量Tl(泰州翩药厂)和0.15,u~/mlPHA 一 起加人T细胞堵养中,细习扭密度同上.培养7z小 时后,用PI(Sigma.美哥)染色,藏式细胞仪铡定死 细胞百分率(发射红荧光)圈l.不同荆量T一和20/ m1人rIL一2(Cetos,美国)--起加人用O.15/as/m|- PHA活化的T细胞,细胞密度同上.37c.5COt 孵箱培养48小时.收获细胞,用Pl染色,用巍式细 胞仪测定死细胞百分率.以造成死细胞低于1O的 ;fi量为T1的景佳剂量.参考文献[6],BtzcAMP的 剂量在50ot.~MU下. 四,活化的T细胞在人rIL一2诱导下的增殖 0.15gg/miPHA刺激T细胞72小时后,用冷 PBS洗三遍细胞,以除击PHA和细胞自身产生的 IL一2.然后把细胞重新悬于古1O胎牛血清的 RPMI16帅中-细胞密度为l×l0?/mi.同时加入, rlL一220~/ml及不同荆量的T1.在培养第30小 时加入秋水仙碱008ug/m!.细腿于第48小时收 获,PJ染色,用流式细胞仪分折细胞周期.? 五细胞DNA/RMA的吖啶橙(Ao)染色 培养的细胞PBS洗二遍.弃上清.以玲picks 悬浮细胞.密度为1×10,m1.取细胞悬液2ml,加入 AO船渡A液0.4ral(含Oo8NHcl,O15NNacl,0. 】Trlton--100),轻轻播要lO秒钟后加入A0染菠 B渡14ral(含0.15NNaCI,10MEDTA,20ggimt AO,0.126MNaH2P04,n037M拧棒酸.PH=6). 放置2分钟即上机检铡. l992年幕8卷幂5 六,捆粗DNA的PI杂色 培养的l田矗用PBs洗商追.取细糖Ixl0?十.离 心彝上请,加入PI工作1点lmI(古50VgPI,l0 RNA辞A.o.sTrh,~一100.I?-g鞫橼酸蚋,0_ 58NaCI).充分振荡混匀.暗处4?放置30分钟. 用浇式细胞仪分析. 七,{田胞表面抗原同接免疫荧光染色 检测的表面抗原包括Ta~Ia,T-和4F2,其中 小鼠单克隆抗体抗丁曩c购自卫生部武汉生韧制晶研 究所.单抗抗h和T.骑自黄国Coulter公司.单抗 抗41:?2为美国N1H的D.ASFsuci所赠.FITC标 记兔抗小鼠lgG购自卫生部北京生物制品研究所. 闻接荧光染色详见参考文献?. 八,IL一2测定 用IL一2依赖细胞株CTLL2细胞测定,方法 详见参考文献(9]. 九,cAMP测定 ?277? 用蛋白澈酶竞争结台珐检制.方珐详见参考文 靛(10). 十,流式细胞仪分析 用Couhe:公司生产的EPICSV型流式细胞仪 分析,激发光擅长488nm,接收讯号有FA工S.L90 LS,PGFL,PRFL和L1GFL.讯号以List?-ode方式 贮存-每十样品分析15000个细胞.用仪器内装的 MDADSI计算机对结果作分析. 结果 一 ,最适PHA剂量的选择 袁l表明,PHA荆量增高.对T细胞的促丝裂 作用增强.0.15~g/mlPHA分别诱导29.54士2. 43和24.89士2.71的T细胞进入G”和G?相. 但进入S相和G2/M相的只有5.97.PHA剂量 增高.进入S相和G2/IvI相的细胞增多.因此取0. 15~g/ml为诱导T细胞帮化的最佳剂量. 衰1不同卉量PHA诱导下人T细胞的增殖 Tab.1.CellCydeyleprogression.fPHA--stimulatdTee!ls Tk帅时;?Iued-i”o啊妇pFIAforzhou?量? „寰2TI对人.r{I?e蜘匏t细胞毒怍用 T_b.2.Cytotoxklt~.rtl1011hamant]ymphocytes Tlhm~imulattedwith0.15ug/mlPHAfor7211on一4 278 表3.Tl对活化T细胞的细胞毒作用 Tab.2一Cytotox~ltofTlonactivatedhumanT]ymphecytu 中国免疫学杂志1992年第8卷第5期 T.汕were~tlmuIated*w~th0.1S/mIPI-IAfor72bour~.ThentheP}WaSwashedsw ay.TheoeIkwerereoukuredwith 2(mh?一2snd叫.do鲫,dT_ior呐t?r48l-o口?n?? ? „t PRj亿 圈1.不同jfj量PHA刺激72小时后T细胞的DNA/RNA直方围 Fig1.DNAtRNAhistogramofTceilsstimalatedwithvariousdose=ofPHAfo r72h 二,最适T1jfj量的选择 T1对T细胞有细胞毒作用.这种作用随TI 剂量增高而增强,亦随细胞状态而异.在用0.15/ mlPHA诱导杀件下.Tl剂量5~g/ml以下.培养 72小时后死亡细胞数<10(表2).这个剂量TI 的细胞毒作用基本上可以不予考虑对0.15,~8/ml PHA诱导下已活化的T细胞t在20~/mlr1L一2存 在下,TI剂量超过20g/才表现出孵显的细胞 毒作用(袁3).因此在实验中,TI剂量鞠采用5”g/ m1以下. 三,Tl与Bt:cAMP对T细胞的抑制作用相似 所谓活化是指细胞从Go相进入Gt相.T细胞 用0.15~g/miPHA刺激72小时,50左右细胞技 活化而进入G-相.5/mITI或500.~MBt:cAMP 于培养开始加入,T纽胞均被阻止于Ga相.Tl或 Bt,cAMP于培养36小时加人(此时一部分细胞已 进人G相),尉细胞从GI-辐进入G.湘受阻.Tl和 Bt,cAMP的作肘丹概圜1上半部和.下半部各 为Tl(5~8/m1)和&P(s0qm)存在的条件下. 0.15PHA刺激72小时,T细胞DNA和 RNA的直方图. 辩巴细胞括化的另一十标志是一些括化抗原的. 袁达.Tac山,T,和4F2抗原在静止期T细胞不表 达.0.15~8/rnlPHA刺激72小时.1c,Ia,T,和4F2 抗原阳性细胞百分率分别选42.5士4.9,39.8士4. 3,34.5士3.9和55.6士5.2%.TI和Bt}cAMP均仲 制它们的袁达.两者的剂量与抑制程度关系曲线十 分相似(围2) 墨 口 中营免痉学杂志1992年第8卷第5期?279 圉2.不同剂量T.对0.15~g/mlPHA刺激72小时的T细胞的细胞毒作 用 F2.EffectofvariousdosesofT_ontheviabilityofT嘲l墨 undertheatlmulationofPHA(0-15~g/mDfor72 hrs 中国免疫学杂志1992年第8卷第5期 .12.0—l5—10 d0,l,ff2cAMP~m 图3Tl(上半部)与HlcAMP(T半部)均在CA)--G..和G..一Gb生b抑 制T细胞活化 Fig3.BothT?andBt2cAMPinhibiteTceilact~ationatthepoha~ofGotoG1.a ndGI.toG TcellweresUmulnkdwRhO.15~g/mlPHA72krs, Tl(O.5ug/m!j(upnei)PnnelOFBt2cAMP(500OM)(1owerI~Uae1)added mthe.thor36thhour 四,TI和Bt2cAMP均能抑制T细胞产生IL衰4T1和BtIcAMP抑制 T细胞产生[L--2 — 2l,5~g/mlPHA能诱导T细胞增殖,并产生lL?r卫b4.1ahlh|tionofIL 一2prod~ctiomofPHA一 一 2(1?5?1.6u/m1)T?和Bt:cAMP均能抑制ILs?.岫1.】nt曲T~~11mT1andBI2cAMP 一 2产生.其抑制程度与Tl和BcAMP剂量均相 关(表4). 五,T1和BtcAMP均能抑制活化T细胞对外 谭IL一2的反应 0.iSog/mlPHA活化的T细胞(进入G.)相在 外源lL一2诱导下,能进 和G/M相秋水仙碱 能阻断细胞再循环.从而使这个指标的分析更精确. 在~/mlT?或500pMBtcAMP存在下,仍滞留于 GO/G?的细胞分剐s4.7土2.9增加到75.9土 29和7】7?2目过表明二者均抑制T细胞从 IL一2product~n(p/m]) T钟灿m刊ithpg,m?PHAtorith咖E thep~seneofvariousdosesTIoFBtJcAMPfor72hours Then一2a~/v/ty1nthesup~natantwasas~yed(n=3) 中国鬼瘴学杂志1992年第8卷第5 G?相进入S相.有趣的是,在TI或BtcAMP存在 下,进入S相的细孵均只有少量减少,分别从18.3 士2.1减少到14.2=k1.8和15.5士1.7.而进 入Gt/M相细胞的减少则很明显.分剐从27.0士2. 281? 6*A减少到9.9=k1.4和12.8=k1.O.这表明TI 和BttcAMP都能抑制T细胞从S相进入G:/M相 (表5) 表5TI或BtcAMP对外潭性IL--2诱导下活化T细胞增殖反应的抑制 Tab5?SuppressiveeffectotT10rBt~~AMPo卫theprol~eraflverespolLseofactivatedTcellstoexogeaous ?一2 T雠ughadbeen…edwith015~/mtPHA{or72hu性TntPHAandl乙一2Toduin出…awa TbcdlreItuwich2()巾IrIL一2r{.do嘲0fTTorBt?cAMPfor4n0tl1er4Bhour吼0B/cdce_de addedon1he30thhourinthse?ndcult(n=8) 六,TI船诱导T细胞产生cAMP 在T【存在下培菲T细腿36小时打碎细胞, 检测T细胞中cAMP量.从表5可见TI使cAMP 量嘎显增加.cAMP增加量随实验中所用Tl剂量 增加而增多.TI5~g/ml条件下cAMP达66.9士4. 2pmo1(无TI条件下为13.2士2.1prow1)(表6). 表6TI诱导T细胞中MP增加 1nb6.Lncr~ofcAT?,IPINTcell~indueedbyTI TI(gg/mt)cAMPcontent?肿l0I】/10?Tck 0 m625 1.25 5 :13.2?2.1 23.6士2.8 34.9士3.2 42.8士3.6 66.9士4.2 Terecultured日lthe印恤novarlo~d.fTjIo 36ho~rscAMPc0nt~t1hecdI邺ass&,e(I(n:3】 讨论 文献报道cAMP增高可加制包括淋巴细胞在 内的多种细胞生长…”.cAMP在G?相中点(G,- G阻断3T3细胞增殖..T细胞的抗碾受体(TcR) 交联后细胞发生的如肌醇磷酯转换等早期变化,对 AMP增高敏感.从而使一2产生受捕..”~cAMP 升高抑利T细胞表达转铁蛋白受体(T1)”.cAMP 韵类似物Bt.cA?椰制G相T细胞对源性lL 一 2的反应,从而阻断T细胞从Gt相进人S相和 G./M相?.上述的研近.这些抗原均于T细匏 活化后(亦郎进人G相)开始表达.尽管开始表达时 间略有差异”“这些细胞在外源性IL--2存在下, 进入S相-部分细胞还进入G2/M相这个实验模 型与TCR交联的模型有不少类似之处.用这个模型 作研究,我们发现TI和Bt.cAMP对PHA诱导下 T细胞增殖的抑制作用十分相似,两者均在细胞周 期的Go—G,.,G.Gn,GIs,和s—G/M处抑村 T细胞增殖-均抑制TacTaIa和AF等活化抗原 的表达和G.相T细胞在外源IL一2诱导下进人S 相和G/M相.另外,由于0.15~g/mlPHA诱导下 T细胞产生IL一2较少,我们改用1.0gIl1lPHA 刺激TI和Bt~cAMP对T细胞产生1L一2的抑制 也十分相似.有趣的是.在TI存在下36小时.T细 胞内cMP增加,其增加程度与所用TI蒯量正相 关.这个结果与张掉等报道相似.张淳等还报道 Tt船抻制环磷酸腺苷磷酸二酯酶活性cm.这些结 果均提示T,对T细胞螬蓝的抻制作用可能至少是 部分经由cAMP的,而细胞内?cAMP的增加可船部 分是由于T.对环磷酸腺苷磷酸二酯酶的抑制. 参考文献 [1)房芳等.中华徵生物学和免疫学杂志.1989,9t95. ~3SmllhKA.scienc~.1988.24041169. ?Z82? C33LeofEB,eI8lJceilBioeEem.l982,19{93. “删&s,ltJnm蚺0f,1985,185?11T卫 C53LernerA.Ha1Jlmmuno1.1988.140l936 (6】JohnsonKW,etBLPfocNatlAcadSeiUSA,1988,85 6072. (7)米立平.1辱.中国免痉学杂志,l086,zt299. C83柬立平,等.中国医学科学院,19Bg.11t57. Cg)G~lmS,ttal,JImmunol,1978,120#2027 C103提锦轩,等.中国医学科学腕,1988.10,113. 1992年第8卷第5 (1l】Fm明现HarShE印PII一n瑚1.1984-58?151. C~2JWedntrHli?ht~ihEXP删晰嘲d-1984,媳I7fiS ClStemJSmithK cie啪-1986,233I203. (11]Kn-W,eIh呻明Q1ay,1B89.1ai283. ClS)张津和前量生.生理科学,ig88,8il00. C1991年12月收稿) (编辑尹子) ThesuppressiveeffectofthemuItigIycOsideOf TriperygiumWilfordiiHookf,(T1)onTcell proliferationmightbepartiallymediatdebyeAMP ZhuLi一 声”gInstitute.ofBasicMedicalScience.ChineseAcademyofMedicalSclmzce, IthasbeenobservedinhumanTcellsactivtedwith0.15ggtmlofPHAthatbo幽 TI (5~g/m1)andBheAMP(5OO~M)inhibitcstheentranceofTcellsfromGointoG”phaseand fromG,.intoG,~phase,and/nhihitestheexpressionofactivationantigensTac,IaLand4F2. BothTIandBT2cAMPalsosuppresstheentranceofactivatedTcellsintoSandG{/Mphase inresponsetoexogenousIL一2,andsuppressIL一 2productionofTcellsstimulatdewith1. 5gg/mlofPHA.ThesuppressiveeffectofTIandBt2cAMPisquitesimilar.Interestingly,TI caninducecAMPincreaseinTcellsinadose—dependentmanner.Thedata~u ggeststhatthe suppressiveeffectofTIonTcellproliferationmightbe(stleastpartially)medi atdebycAMP. KeyWords,TriperygiumwilfordiiHOOK,f(TI);cAMPTcellproliferation CabOoseJournal口,Immudagy,1992,8(3)276] ? 免疫学名词? CD名词注释(4)一一CD3 CD3由5条跨膜多驮链C/&B或他竹I)组成,伥和l诸条链的分子量分别为21,2525,船和16KD. 和0为糖置自,不合糖.90l链以同二幕体形式(t1)存在,另10I链与寸链搀成异二幕体.针对CD3的 McAb有T3,Leu4,OKT3,381,UCHTI,Nu—T3和RW2--8C8等.CD3是鉴定和分离T细胞的重要表面 标志之一.100外闻T细胞表选CD3,10的胸腺细胞表达少量CD3INK细胞表面有I链.?CD3以非共价 键与丁j连接成为Ti/CD3复合雉即丁细胞受体复合体(Tcellrecept~cornp1ex)Ti是由针对抗壤物异性的 单位个T细胞系韵McAb鉴定出来韵T细胞表面成分.由音锗的两条跨膜多放链(矗链和链)组成.两条链 中都有可变区-一个T细胞系有其特定的Ti可变区结构,抗Ti的McAb是识剐特定的T细胞系表面的 口和口链可变区的抗体.Ti/CD3复合体的功能是识别和接收挠擐信 号导致T细胞激活.结合于颠垃的抗Ti 或抗CD3McAb可摸拟抗原作用于T细胞弓I起lL一2分泌,一2受体表达和细胞增殖.Ti以其可变区识别 抗原,Ti=链和目链的胞内区较大?古4D一104十氨基酸>,Ti识刷的抗原信号由CD3传递至细胞阿的信号系 统-其一是磷脂酶c话化使P1P2水解产生IP3.和DE-l其二是CD3的I链孢内区的酪氨酸磷酸化.选,过程 由Ti相关的蛋白质氨酸激酶P59fynTCD4/CD8相关的蛋白质酪氪酸激酶PS6kk催化,I链对丁细胞的 PIP2水解有重要的调节作用.