【doc】脱氢表雄酮对氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞表达VCAM-1的影响

【doc】脱氢雄酮对氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞表达VCAM-1的影响 脱氢表雄酮对氧化低密度脂蛋白诱导的人 脐静脉内皮细胞表达VCAM-1的影响 第34卷第4期第398页 2005年8月 华中科技大学:报(医学版) ActaMedUnivSciTechno|Huazhong Vo1.34No.4P.398 Aug.2005 脱氢表雄酮对氧化低密度脂蛋白诱导的人脐 静脉内皮细胞表达VCAM一1的影响 周英宋雪芳阮秋蓉? 华中科技大学同济医学院基础医学院病理学系,武汉430030 * 摘要目的探讨雄激素脱氢表雄酮(DHEA)对氧化低密度脂蛋白(OX—LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)表达血管细胞黏附分子一1(VCAM一1)的影响.方法体外培养HUVECs,采用免疫细胞化学,Western blot,原位杂交等方法,观察不同浓度DHEA(1,5,50p.mol/L)对OX—LDL诱导的HUVECs表达VCAM一1的影 响.结果OX—IDI诱导培养HUVECs后,HUVECsVCAM一1表达明显升高,预先用DHEA处理HUVECs可使 VCAM一1的表达降低(P<0.01),且这种降低呈浓度依赖性.结论DHEA能浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的 HUVECsVCAM一1的表达. 关键词脱氢表雄酮;氧化低密度脂蛋白;血管细胞黏附分子一1 中图法分类号R363.2 EffectsofDehydroepiandrosteroneonOx-LDL—inducedVCAM一1 ExpressioninHumanUmbilicalVenousEndothelialCells ZhouYing,SongXuefang,RuanQiurong? DepartrnentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,TongjiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectsofdehydroepiandrosterone(DHEA)onox— LDL—inducedVCAM一1expres— sioninhumanumbilicalvenousendothelialcells(HUVECS).MethodsHUVECswerecultur ednvitroandtheeffectsof DHEA(1,5,50umol/I)onox—IDL-inducedVCAM一 1expressioninHUVECSwereobservedbyimmunocytochemistry, Westernblot.nsituhybridization,ResultsOx-LDLstimulationsignificantlyinducedtheVC AM一1expressioninHUVECs. WhenHUVECswerepretreatedwithDHEA.ox-LDL—inducedVCAM一 1expressionwasobviouslydecreasedinadose-depend— entmanner(PdO.01).ConclusionDHEAcouldinhibittheOX-LDI一inducedVCAM一 1expressioninHUVECsinadose-de— pendentmanner. 1(eywordsdehydr0epiandr0ster0ne;oxidizedlOWdensitylipoprotein;vascularcelladhesi onmolecule-1 大量研究表明,氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,OX—IDI)引起内皮细胞损伤,诱导黏附分 子的表达而导致单核细胞的大量募集及泡沫细胞的 形成是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生 发展的主要机制之一l_l一.脱氢表雄酮(dehydroe— piandrosterone,DHEA)是存在于人体内的内源 性雄激素,近来的研究发现,DHEA具有抗AS的 作用],但其机制尚不清楚.本研究通过体外实验 观察DHEA对OX—IDI诱导的人脐静脉内皮细胞 VCAM一1表达的影响,探讨DHEA抗AS的可能 机制,为AS的防治提供新思路. 国家自然科学基金资助项目(No.30300l35) 周英,女,l977年生,硕士研究生 ?通讯作者,C0rresp0ndingauthor 1材料与方法 1.1买验材料 DHEA(Sigma公司产品);人血清低密度脂 蛋白(华中科技大学同济医学院基础医学院生物化 学与分子生物学系提供);M199培养基,新生小 牛血清(Gibco公司产品);羊抗人VCAM一1多克 隆抗体(北京中山公司产品);VCAM一1原位杂交 试剂盒购自武汉博士德公司. 1.2实验方法 1.2.1HUVECs的培养与分组:HUVECs(ECV一 304)用含1O新生牛血清,100U/ml青霉素,100 U/ml链霉素和3谷氨酰胺的M199培养液培养, 37?,5CO培养箱中孵育.将培养细胞分成5 组(每组3瓶),?正常对照组:培养液中不加任 周英等0氢表排酮对飘化1氍鞯崖脂蛋白诱的^脐静脉内皮细胞表达Vt'AM:的髟 响'399 何刺激因素?OXIDI刺激组:培养城中加人终 浓度为loo"g./m[OX—l_DI?DHEA加药组(按 DHEA浓度不同分为A,13【,3绀):先分别加入 终浓度为l,5,0umo1..1DHEA培养24h.然 后加人终浓度为10(?g.n1【的uxI_DI继续培养 24h 1.2.2OX—I,【]I_的制备签定:【I)I_的制备采用 密度梯度超速离心法=1DI的体外氧化修饰采用 CU'介导法.所用Cu浓度为30m0lI.37 C,5''()培养箱中孵育1411.并以5倍于Cu' 浓度的EIH'ANa终止氧化然后20倍体积的 10mmoL/1PBS(1]H.d)透析-18h以上,每8h 换液1次,击除('u和可溶性的过氧化产物. 用琼脂糖凝皎电泳和琉代巴比妥酸厦应物质的量测 定1.DI,的修饰程度. 1.2.3免疫细胞化学:收集各组细胞片.4C丙 酮固定10rain,自然风干后,L保存备用 使用山羊抗^VCAM—l多兜降抗体和相应的免疫 细胞化学捡测试剂盒避行细胞化学染色.各组细胞 VCAMl蛋白的含量用细胞厦棒黄色阳性颗粒的 平均吸光度(A)值表示 1.2.4Westernblot分析:提取并组HUVE('s的 蛋白.Lowry法测定蛋白的浓度.7.5SDS- PAGE凝胶}电泳仆离.再将蛋白转移至硝酸纤维 素(N膜上.室温振荡封闭后.加人山羊抗人 VCAM1多宛隆抗体4C孵育过傲充分洗涤后. 滴加辣根过氧化物酶标记的二抗.37C孵育lh 充分洗涤.加入EC].反碰体系.曝光,显影.用 英国UVP公司GDSS0,)(J型凝我成像系统及 HPIA,S-1I)00彩色图像分析系统检删NC膜七蛋向 质条带的吸光度(A)值 1.2.5原位杂交法:收集各组细胞.4多聚甲醛 率温固定10n!Jn.逐级乙醇脱水.风干.70? 保存备用采用经地高辛标记的VCAIvl1寡核苷 酸探针.按试剂盒说明书操作.进行各组人脐静脉 内1五细胞的VCAM一1mRNA表达水平的检测.各 组细胞VCAM1mRNA含量用细胞质拣黄色阳性 瓤牡的平均吸光度(^)值表示, 1.2+6图像分析与统计学处理:于200倍视野下. 每组随机选取j0个细胞,采用HP1AS2)00高清 晰度图像处理系统.埘各绀细胞片进行图像分析, 测定其平均吸光度值各组实验数据以?表示. 采用单因素.差分析(AN()VA)进行统汁学检 验.用SPSSl20软件处理数据;以P<0.05为 差异显着性意义. 2结果 2.I免疫细胞化学结果 各组V【'AM1蛋白表达均呈阳性.表现为胞 质棕黄色着染(图1):HUVECs经OXIDI诱导 培养后.VCAM一1蛋白表达明丝增强表现为细胞 的着色明显加深.平均吸光度值显着升高.OX I,Di.组平均A值(0.12l0二000-l1)与正常刘照组 (【).1088?0046)比较.差异有极显着性意义(P <1J_01)预先分别用】,5,50t,mol/lJDHEA诱导 培养HUVECs后.VCAM—的蛋白表达明显受到 抑制.表现为胞质着色变浅.平均A值降低.分别为 (0.0743?1I_01l5),(0.053l?0015),(0.0440 ?0.0802】,与OX—IDI刺激组平均A值进行两两 比较,差肄均有极显着性意义(均P<(.0?. A:正.对照蛆;B:l帅izg,,'mlox【D1驯敏蛆l【':S,mr)l/I.DHEA加药蛆 图lVLAMl蛋庄3组人噼静脉内点细胞内的表达(SP凌.×200】 2.2WesternI)lo|分析结果 正常对照组人脐静脉内皮细胞Hp有VCAM—l 蛋白的表达OXlD【J能明碾诱导VCAM一1蛋白的 表达,A值(173.0-t-.o28)明艇增大,与正常 对照组(1o0.o0]士】o.(》87)相比,差异有显着性 意义P<0.05);DHEA加药各组A值随着 DHEA浓度增加逐渐降低.分别为(8().778士 1.782),(41.420=2.878),(23.6】9土8.955).与 ?400?华一扣科技大学(医学版)2005年8月第34卷第4期 OX—IDI刺激组比较差异均有显着性意义(均P< 0.05),提示DHEA可明显抑制人脐静脉内皮细胞 VCAM一1蛋白表达(图2),且呈现浓度依赖性关 系. 4 1:正常对照组;2:ox—IDL刺激组;3:1t~mol/I DHEA加药组;4:5/lmol/IDHEA加药组;5: 50urnol/IDHEA加药组 图2各组人脐静脉内皮细胞VCAMl蛋白的表达 2.3原位杂交结果 各组人脐静脉内皮细胞均有VCAM一1mRNA 的表达.阳性信号为细胞质棕黄色粗细不均匀的颗 粒.OX-IDI刺激组的VCAM一1mRNA表达明显 增强,表现为细胞的着色明显加深,平均A值增 加,OX—IDI刺激组平均A值(0.0730?0.0020) 与正常对照组A值(0.0616?0.0011)相比,差 异有极显着性意义(P<0.01).DHEA加药各组 VCAM一1的mRNA表达明显受到抑制,表现为着 色明显变浅,平均A值随浓度增加而降低,分别 为(0.0531-+-0.0009),(0.0342?0.0028), (0.0249?0.0029),DHEA加药各组平均A值与 OX,IDI刺激组比较,差异均有显着性意义(均P <0.05) 3讨论 AS所致的心脑血管疾病是人类死亡的主要原 因之一.近年来的研究认为AS是由于动脉壁的内 皮细胞在各种危险因素的作用下受损,从而促使机 体产生的一种过度的炎症增生性反应过程.OX— IDL在致AS的病理过程中起着关键的作用,Ox— IDL通过与内皮细胞上的血凝素样OX—LDI受体1 (1ectin—likeoX_IDIreceptor一1,IOX一1)特异性结 合口],损伤血管内皮细胞,促使内皮黏附分子(如 ,使单核细胞募集,吞噬 血管细胞黏附分子)表达 脂质,导致泡沫细胞的形成,从而促进动脉粥样硬 化的发生. DHEA是存在于人体内的内源性雄激素,基 于DHEA水平随年龄的增加而递减的特点,其与 衰老,肿瘤及动脉粥样硬化等老年性疾病的关系引 起了人们的关注].流行病学研究已经发现,血中 低水平的DHEA与动脉粥样硬化及由此引发的心 脑血管意外的发生有关l_4.5].Mohan等还发现 DHEA可明显降低LDL引起的内皮细胞氧化损伤 (减少程度为5O,62),表明DHEA具有保护 内皮细胞的作用. 本研究以OX—LDL作为刺激因素,DHEA作 为干预因素,VCAM一1作为检测指标,制造AS的 体外模型,探讨DHEA抗动脉粥样硬化的机制. 结果显示:浓度为100/~g/ml的OX—LDL作用于人 脐静脉内皮细胞24h后,可以显着促进VCAM一1 mRNA和蛋白的表达;加入OX—LDL前24h在培 养基中加入DHEA可以显着降低VCAM一1mRNA 和蛋白的表达并呈现浓度依赖性的特点.由此我们 可以推断DHEA可能通过抑制血管壁内皮细胞 VCAM一1的表达而在AS的发生发展过程中起到一 定的保护作用. 本研究发现机体内源性激素DHEA能通过干 预AS发病的早期事件,即抑制OX—LDL诱导的 VCAM一1的表达,对AS的发生发展起到保护作 用,阐明了DHEA抗AS的新机制,同时也为AS 的防治提供了新思路.本实验只是对DHEA抑制 AS的发生发展的一个初步探讨,至于DHEA是否 也能影响AS发病过程中的其他因素尚需要进一步 的实验研究. 参考文献 1KitaT,KumeN,MinamiMeta1.Roleofoxidized1Dlinath. erosclerosis.AnnNYAcadSci,2001,947:199 2FurutamaD,FukuiR,AmakawaMet口f.Inhibitionofmigra— tionandproliferationofvascularsmoothmusclecellsbydehy— dr0epiandroster0nesulfate.BiochimBiophysActa,1998,1406: 1O7 3SawanuraT,KumeN,AoyamaTeta1.Anendothelialreceptor foroxidizedlow—densitylipoprotein.Nature,l997,386:73 4VatalaslA,Dionyssiou—AsteriouA.AdrenalC19steroidsand serumlipoproteinlevelsinhealthymen.NutrMetabCardiovasc Dis,2001,1:388 5GenazzaniAR.IngleseS.Lombardileta1.1ong—termlow—dose dehydr0epiandr0ster0nereplacementtherapyinagingmaleswith partialandrogendeficiency.AgingMale,2004,11:133 6MohanPF,BenghuzziH.Effectofdehydr0epiandr0ster0neon endothelialcellproliferation.BiomedSciInstrum,1997.33: 550 (2004一l0—28收稿)