草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

华北农学报 # 2010, 2 5 ( 6 ) : 7 1-73 收稿日期: 2010- 09- 27 基金项目:河北农业大学博士基金项目 ( 2009- B- 02 ) 作者简介:宋春丽 ( 1975- ),女,河北沧县人,讲师,博士,主要从事果蔬生物技术研究工作。 通讯作者:马俊莲 ( 1964- ),女,山西太原人,教授,博士,博士生导师,主要从事果蔬贮运和生物技术研究。 草莓乙烯受体 FaE tr2基因植物达载体构建 宋春丽 1,赵丛枝2,马俊莲2 ( 1.河北农业大学 中兽医学院,河北 定州 073000; 2.河北农业大学 食品科技学院,河北 保定 071001) 摘要: 为通过转基因技术改善草莓的贮运性能, 以全明星草莓为试材, 克隆了与草莓成熟有关的 FaE tr2 基因的 2 个片段, 并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体 FaE tr2 基因序列及表达载体 pB I221上的酶切位点设计 2对带限制性内切酶位点的特异性引物, 以测序质粒为模板, PCR扩增到 2个全明星草莓 FaE tr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体 pB I221的 35 S启动子和 NOS 终止子之间, 分别构建成 A ll Star-FaE tr2基因的正、反义植物表达载体。 关键词: 草莓;乙烯受体; FaE tr2基因; 植物表达载体 中图分类号: Q78 文献标识码: A 文章编号: 1000- 7091( 2010) 06- 0071- 03 Expression Vector Construction of Strawberry FaEtr2 Gene SONG Chun-li 1 , ZHAO Cong-zhi 2 , MA Jun-lian 2 ( 1. College of ChineseVeterinary, AgriculturalUniversity ofHebe,i D ingzhou 073000, China; 2. College of Food Science and Technology, AgriculturalUniversity ofHebe,i Baoding 071001, China) Abstract: Tw o fragments of A l-l star straw berryFaE tr2 gene w ere cloned using A l-l star strawberry as materials. Sense and antisense expression vector w ere constructed for improv ing storage and transport varieties of straw berry through transgenic techno logy. A ccording to the restriction enzyme sites o f expression vector and c loning sequence of strawberry FaE tr2 gene, two pa irs of primers contain ing restriction enzyme sitesw ere designed and used to amplify se- quenced plasm id. PCR products and the plasm id pB I221 w ere digested by the correspond ing restricted enzymes re- spectively, and linked directiona lly. Then the sense and antisense expression vector can be designed. The constructed expression vector was transformed intoAgrobacterium LBA4404 for the fo llow ing-up research. Key words: Straw berry; Ethylene receptor; FaE tr2 gene; P lant expression vector 草莓 (Fragaria ananassa Duch. ) 是蔷薇科 ( Ro- saceae)草莓属 (F ragaria)多年生草本植物, 素有 /水 果皇后 0之称,但草莓果实采后难以保鲜, 极大地影 响了其商业价值。草莓属非跃变型果实, 但它也可 以产生少量乙烯。与跃变型果实相比, 非跃变型果 实乙烯及乙烯受体方面的研究甚少。应用 PCR技 术三种乙烯受体基因 ( FaE tr1, FaE rs1, FaE tr2 )被克 隆出来 [ 1]。其中 FaE tr2是属于系统 Ò [ 2]的乙烯受 体。成熟会影响各种乙烯受体自身的表达, 表明可 能存在一种乙烯控制成熟过程的机制。 3种乙烯受 体的表达受乙烯诱导,并且在果实成熟过程中,与Ò (FaE tr2 )型受体比较, Ñ (FaE tr 1 和 FaE rs 1 )型受 体的相对比例降低 [ 1]。笔者解释这可能是乙烯介 导的对成熟的影响机制,但未见进一步的研究报道。 正、反义 RNA技术均可引起基因沉默,是目前用于 基因功能研究的重要手段 [ 3 ]。为此,本研究构建了 全明星草莓 FaE tr2基因的正、反义植物表达载体, 为进一步研究 FaE tr2 基因功能, 探明非跃变型果 实 ) 草莓的成熟机理, 从而采用生物技术方法改良 草莓品种奠定基础。 1 和方法 1. 1 材料 TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、胶回收试剂 盒、pGEM-T克隆试剂盒为北京 T IANGEN公司产 品, 购自保定赛尔克生物技术有限公司; 各种限制 72 华 北 农 学 报 25卷 性内切酶购自大连宝生物公司。大肠杆菌 DH5A及 pB I221植物表达载体由本实验室保存。引物合成 及测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。根 癌农杆菌菌株 LBA4404由中国农业科学院生物技 术研究所王磊博士惠赠。 1. 2 方法 1. 2. 1 正、反向片段的扩增 根据测序序列及 pB I221载体上的限制性内切酶位点, 设计 2对带有 相应酶切位点的引物。扩增反向片段的引物对为: 5c-TGGATCCAGTGGTGATTCTGGTGAG-3c/5c-CCAC TATCCTTGTCTAGATTATCCA-3c(含XbaÑ /BamHÑ酶 切位点 )。扩增正向片段的引物对为: 5c-GGGATCCA- CATTCTTCGGCCAG-3c/ 5c-TATCCCGGGCTGGATTAT CCAT-3c(BamHÑ/ SmaÑ酶切位点 )。以测序质粒为 模板, 进行 PCR扩增。PCR产物经 1%的琼脂糖凝 胶电泳检测后,切下目的条带, 用琼脂糖凝胶回收试 剂盒回收。 1. 2. 2 植物表达载体的构建 用 XbaÑ和 BamHÑ 分别双酶切 pB I221表达载体和回收的反向扩增片 段,电泳检测酶切产物并回收目的片段, T4 DNA连 接酶 16e 进行定向连接 16 h。连接产物转化大肠 杆菌 DH 5A感受态细胞, 在含有卡那霉素 ( 100 Lg /mL)的 LB固体培养基上筛选阳性菌落, 碱法提 取质粒, 酶切鉴定阳性克隆,所得载体记为 pBI221- Ant-iETR2。用 BamH Ñ 和 Sma Ñ 分别双酶切 pB I221表达载体和回收的正向扩增片段, 并定向连 接,构建成 pB I121-Sense-ETR2表达载体。 2 结果与 2. 1 FaEtr2基因正、反向片段的 PCR扩增 以稀释的测序质粒为模板, 用设计的带酶切位 点的引物 PCR扩增正、反向片段, 其扩增产物的大 小应分别为 550 bp和 516 bp。电泳检测扩增产物, 得到预期大小的泳带,证明扩增正确 (图 1)。 M. 1 kb ladderM arker; 1, 2.正义 PCR产物; 3, 4.反义 PCR 产物; CK-.为正、反义 PCR阴性对照。 M. 1 kb ladderM arker; 1, 2. PCR produ cts of sense; 3, 4. PCR produ cts of an tisense; CK-. Negative comparison of PCR products. 图 1 PCR产物电泳图谱 F ig. 1 Agrose ge l electrophoretogram of PCR produc ts 2. 2 反义植物表达载体的构建及鉴定 利用 XbaÑ和 BamHÑ双酶切反向 PCR回收产 物及 pB I221植物表达载体, 回收目的片段进行定向 连接。提取阳性克隆质粒进行酶切鉴定。 反义表达载体经 XbaÑ和 SacÑ酶切后应得到 约 2. 4 kb的小片段,包括反向片段和 GusA;经 H ind Ó和 BamHÑ酶切后应得到约 1. 4 kb的小片段, 包 括 35 S启动子和反向片段; 经 XbaÑ和 BamH Ñ酶 切后, 小片段的电泳谱带约为 500 bp(反向片段 ) (图 2)。电泳结果与预期一致。说明反义表达载体 构建成功。 M. 1 kb ladderM arker; 1. X baÑ /Sa cÑ 酶切质粒; 2.H ind Ó /B amH Ñ酶切质粒; 3. 酶切质粒 X baÑ /B amHÑ ; 4. pBI221质粒。 M. 1 kb ladderM arker; 1. Plasm id d igested by X baÑ + Sa cÑ ; 2. Plas- m id d igested by H indÓ + B amHÑ ; 3. Plasm id d igested by X baÑ + B amHÑ ; 4. C on tral p lasm id. 图 2 pBI221-an t-i E tr2表达载体酶切检测电泳图谱 Fig. 2 D etection of the an ti expression vector d igested by enzymat ic M. 1 kb ladderM arker; 1. BamHÑ /SacÑ酶切质粒; 2. H ind Ó / X ba Ñ酶切质粒; 3. BamHÑ /E coRÑ酶切质粒; 4.H ind Ó /E coRÑ酶切质 粒; 5. X baÑ /E coRÑ酶切质粒; 6. H ind Ó /SmaÑ酶切质粒; 7. B amH Ñ /SmaÑ酶切质粒; 8. PB I221-sense-E tr2质粒。 M. 1 kb ladderM arker; 1. P lasm id d igested by BamHÑ /Sa cÑ ; 2. Plas- m id d igested by H ind Ó /BamHÑ ; 3. Plasm id d igested by B amHÑ / E coRÑ ; 4. H ind Ó /E coRÑ ; 5. P lasm id d igested by X baÑ /EcoRÑ ; 6. P lasm id digested by H ind Ó /SmaÑ ; 7. P lasm id d igested by BamHÑ / SmaÑ ; 8. C ontral p lasm id. 图 3 pBI221-Sense-Etr2表达载体酶切检测电泳图谱 F ig. 3 D etect ion of the sense expression vec tor d igested by enzymat ic 2. 3 正义植物表达载体的构建及鉴定 用 BamHÑ和 SmaÑ双酶切正向 PCR回收产物 及 pBI221载体,回收目的片段定向连接构建正义植 物表达载体。 对阳性克隆的菌液进行质粒 DNA的小量提取, 酶切鉴定。若重组质粒构建正确, 则被 BamH Ñ和 6期 宋春丽等: 草莓乙烯受体 FaE tr2基因植物表达载体构建 73 SacÑ双酶切时应得到约 2. 3 kb的小片段, 含有正 向片段和 GusA; 被 H ind Ó和 X baÑ双酶切时应得 约 0. 9 kb的小片段, 即 35 S启动子; 被 BamH Ñ / E coRÑ双酶切时应得到约 2. 7 kb的小片段, 含有正 向片段、GusA和终止子; 被 H ind Ó和 E coRÑ双酶 切时应得到约 3. 6 kb的目的片段, 含启动子、正向 片段、GusA和终止子;被 XbaÑ /E coRÑ双酶切时应 得到约 2. 7 kb的小片段, 含正向片段、GusA和终止 子;被H ind Ó /SmaÑ双酶切时应得到约 1. 4 kb的 小片段,含启动子和正向片段; 被 BamH Ñ / SmaÑ 双酶切时应得到 0. 5 kb左右的正向片段。电泳酶 切产物, 与预期结果一致。各种酶切检测表明, FaE tr2基因的正义表达载体构建成功 (图 3)。 3 讨论 成熟是草莓重要的生理过程。草莓新鲜果实易 软化,且随成熟度增加果实硬度降低。在这个过程 中,硬度的变化、着色、糖分的积累直接影响果实的市 场价值。通过了解成熟过程伴随的基因表达的变化 可以更好地了解成熟这一过程,减少采后损失。许多 与草莓成熟有关的基因都先后被克隆出来,并研究了 其表达特性 [ 4]。B-1, 4葡聚糖酶基因家族的 2个基 因 (FaEG1和 FaEG3 )都用于产生反义转化植株,但 都对果实软化无效 [ 5]。 Jim enez-Bermudez等用 35 S 启动子驱动的果胶酶反义表达载体转化草莓植株, 果胶酶基因表达抑制的转基因植株表现出果实变 小,反义转基因果实比对照硬度高 [ 6]。 20世纪 80 年代以来,反义 RNA技术已经成为调控基因表达的 重要工具。正义和反义 RNA技术均可诱导基因的 表达沉默,已广泛的应用于基因的表达调控。 本研究拟通过构建 FaE tr2基因特定序列正、反 义 RNA载体,为进一步研究 FaE tr2基因功能及利 用生物技术方法调控果实成熟衰老进程, 从而改善 草莓果实的贮运性能奠定基础。目前构建好的正义 质粒和反义质粒已转入农杆菌 LBA4404中,转基因 试验正在进行中。 参考文献: [ 1] L iv io T, Anna P, G io rg io C. D ifferent e thy lene receptors show an increased express ion during the r ipen ing of straw be rries: Does such an increm ent im ply a ro le fo r e th- y lene in the r ipen ing o f these non-clim acter ic fruits[ J]. Journa l o f Exper im enta l Bo tany, 2005, 56 ( 418): 2037- 2046. [ 2] Cance l J D, Larsen P B. Lo ss-o-f function mu tations in the ethy lene recepto r ETR1 cause enhanced sens itiv ity and exaggerated response to ethy lene in A rabidop sis [ J]. P lant Physiology, 2002, 129: 1557- 1567. [ 3] K leeH J. Contro l of ethylene med iated processes in tom a- to at leve l of receptors[ J] . J Exp Bot, 2002, 53: 2057- 2063. [ 4] Fo lta K M, Dav is T M. Straw be rry genes and genom ics [ J]. P ro Quest Agr iculture Journa ls, 2006, 25( 5) : 399- 415. [ 5] Woo ly L C, Jam es D J, M ann ing K. Pu rifica tion and prop- erties of an endo-beta-1, 4 -g lucanase from strawberry and down-regu la tion o f the correspond ing gene[ J]. Ce ll P lan- ta, 2001, 214: 11- 21. [ 6] Jim enez-Berm udez S, Redondo-Nevado J, M unoz-B lanco J, et al. M anipulation of strawberry fruit so ftening by an t-i sense expression of pec tate lyase gene[ J]. P lant Physio ,l 2002, 128: 751- 759.