【doc】2、Caspase-3mRNA水平表达与大脑皮层及纹状体区炎性细胞浸润的影响
2、Caspase-3mRNA水平表达与大脑皮层及
纹状体区炎性细胞浸润的影响 ?252?NervousDiseasesandMentalHealth,2004,Vo1.4,No.4
大鼠脑缺血再灌流后Bcl一2,Caspase--3mRNA 水平表达与大脑皮层及纹状体区炎性细胞浸润
的影响
刘广义付志新郝娟芝姜素玲
【摘要】目的探讨大鼠脑缺血再灌流后Bcl一2蛋白,Caspase--3mRNA的表达及炎性细胞浸
润与神经细胞凋亡的关系.方法将54只Wistar大鼠随机分为二组:假手术组,缺血再灌流组.采用
原位末端标记(TUNEL),免疫组化和原位杂交技术分别观察脑缺血再灌流后不同时间点神经细胞凋亡
及损伤的变化与Bcl一2,Caspase--3mRNA表达.结果Bcl一2表达于缺血再灌流12,24h迭高峰,
再灌流2,4d呈下降趋势,至16d略高于假手术组;Caspase--3tuRNA于缺血再灌流12,24h迭高
峰,2,4d呈降低趋势,至16d略高于假手术组.结论脑缺血再灌流后细胞凋亡介导神经细胞损伤,
坏死是一个渐进的动态演变过程.Bcl一2蛋白,Caspase--3tuRNA表达在押制细胞凋亡和介导神经细
胞损伤等方面起非常重要的作用.
【关键词】缺血再灌流细胞凋亡炎性细胞浸润Bcl一2Caspase--3mRNA TheLevelExpressionofBcl一2andCaspase--3mRNAandInfluenceoftheRelationshipoftheInfiltration
ofInflammationCellsandinCerebralCortexandinCorpusStriatumRegionafterCerebralIsc
hemiaReper'
fnssioninRats""Guangyi,Zhixin.HaoJuqnzhi,a1.(InstituteofCerebrovacularDiseases, theHospitalAffiliatedtOtheMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266003) [Abstract]0bjectiveToexplorerelationshipoftheexpressionofBcl一
2proteinandCaspase--3
mRNAandtheinfiltrationofinflammationcellsandtheneuronapoptosisaftercerebralischemiareper-
fussioninrats.Methods54ratsweredividedrandomlyintotwogroups:sham—
operativegroupandis—
chemiareperfusiongroup.Thevariationsofneuronapoptosisandneuroninjuryonthedifferenttime
pointsaftercerebralischemiareperfussioninratswereobservedwiththemethodofdeoxynucleotidy1
tranferasemediateddUTP—flouresceinnickend—
labelig(TUNEL)assay.TheexpressionofBcl一2
proteinwiththemethodofimmunchiochemistryandtheexpressionofCaspase--3mRNAwiththemeth—
odofinsituhybridization.ResultsItshowedthatexpressionofBcl一
2proteinreachedapeakat12,
24hafterreperfussionandbegintOdecreaseat2,
4d.butthenumbersofthepositivecellswerestillin
highlevelafter16dcomparedwiththesham—operatedgroup.TheexpressionofCaspase一
3mRNA
reachedapeakat12,24hafterreperfusionanddecreasedat2,
4d.butthenumberofthepositivecells
wasstillinhighlevelafter16dcomparedwiththesham—
operatedgroup.ConclusionsTheneuronap—
optosisguideininjuryandnecrosiswasadynamicongoingdevelopmentprocessaftercerebralischemia
reperfussioninrats.TheexpressionofBcl一2proteinshouldinhibitapoptosis.Caspase一
3mRNA
shouldguideinneuroninjuryplayanveryimportantrole.
[Keywords]IischemiareperfusionNeuronapoptosisInfiltrationofinflammationcellsBcl
——2
proleinsCaspase——3mRNA
中圈分类号:R741文献标识码:A文章编号:1009—6574(2004)04—0252—04
脑缺血再灌流后细胞凋亡介导神经细胞损伤,
坏死,引起脑组织炎症性侵润,从而导致炎性细胞浸 润,即白细胞浸润,目前已引起高度重视.对抑凋亡
作者简介:刘广义(1958一),男,中级实验师,大专,研究方向:脑 血管,细胞培养
作者单位:266003青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所(刘 广义),青岛市疾病控制中心(付志新)I青岛市中心医院(郝娟芝,姜索玲) ?
论着?
蛋白Bcl一2的实验研究已得到肯定,而且促凋亡基 因Caspase--3的研究也已是目前研究的热点问
. 据BuemiM[1等研究证实,脑缺血时存在着缺血性
再灌注损伤,并与炎症密切相关.许多研究者表明, Bcl一2及Caspase--3tuRNA被认为分别具有抑制 和促进细胞凋亡的作用.本研究采用大脑中动脉线
栓阻塞法(MCAO)制备脑缺血再灌流动物模型,采
神经疾病与精神卫生2004塞4卷筮塑
用原位末端标记(TUNEL),免疫组化和原位杂交技
术分别观察缺血再灌流侧大脑半球额顶叶皮层与纹 状体区神经细胞凋亡和损伤的变化与Bcl一2蛋白和 Caspase--3tuRNA的表达,探讨Bcl一2,Caspase一
3mRNA水平表达及炎性细胞浸润与神经细胞凋亡 关系的影响.
1材料和方法
1.1动物模型的建立选用成年健康Wistar大鼠 54只,体重在200~240g,由青岛市药物检验所动物 中心提供,随机分为缺血1h再灌流后2h,6h,12h,
24h,2d,4d,8d,16d,假手术组,每组6只.参照 Zea—Longa等]的颈外动物线栓法建立MCAO动 物模型.假手术组除不插线外其余步骤同实验组. 1.2标本采集实验组动物在规定的时间点取材,
)经心脏灌注固定,断头取脑 使用4多聚甲醛(4?
备用.假手术组缺血再灌流24h取材.取材范围为 额极6mm处,连续冠状切片,切片厚度5m,间隔 100m,取8张.置于4多聚甲醛(含DEPC, 1/5000)后固定2h,酒精脱水,二甲苯透明,浸腊,包 埋.分别进行HE染色,TUNEL染色检测,Bcl一2 免疫组化及Caspse--3mRNA原位杂交染色. 1.3实验方法
1.3.1细胞凋亡检测细胞凋亡检测试剂盒,DAB 显色试剂盒,均由武汉博士德生物工程有限公司. 按试剂盒提供的实验步骤进行,DAB显色,苏木精轻 度复染,细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性 细胞,即凋亡细胞.
1.3.2Bcl一2免疫组化与染色浓缩型SABC免 疫组化染色试剂盒与Bc1—2单克隆抗体均购自武汉 博士德生物有限公司,实验步骤按试剂盒提供的进 行,DAB显色.胞浆出现棕黄色颗粒,也有部分胞膜 着色为阳性细胞.
1.3.3Caspase--3mRNA原位杂交染色Caspase 一
3mRNA原位杂交试剂盒,DAB显色试剂盒均由
武汉博士德生物有限公司提供.实验步骤按试剂盒 提供的进行,DAB显色.在高倍光镜下观察,胞浆呈 棕黄染色为阳性细胞.
1.4统计学处理结果以?s表示,各相邻时间点 相同脑区间的比较,缺血周围区与缺血中心区间的 比较,均采用t检验.
2结果
2.1TUNEL细胞凋亡检测结果假手术组可见到
.在缺血再灌流周围区,再 少数TUNEL阳性细胞
灌流2h即出现凋亡细胞,随着再灌流时间的延长逐 渐增多,阳性细胞核呈棕黄色颗粒(即损伤,死亡细 胞),至24h达高峰,2d开始下降,至16d时仍高于 假手术组,各相邻时间点比较差异显着.缺血中心 区凋亡细胞数量较少,其变化规律与缺血周围区相 似,除再灌流2h,8d,16d外,其余各时间点无显着 性差异.同一时间点相比较,除2h,8d,16d外,缺 血周围区凋亡细胞数均显着高于缺血中心区,见 表1.
表1脑缺血再灌流后凋亡细胞的定量观察(个/视野】 注:相邻时间点比较:*P<0.05I与同一时间点周围区比较 #P<0.05.
2.2Bcl一2蛋白表达及图象分析结果假手术组 脑组织仅见Bc1,2微弱表达;缺血周围区再灌流2h 可见Bc1—2开始表达,再灌流12,24h,表达达高 峰,再灌流2d表达逐渐下降,至16dBc1—2仍有表 达,略高于假手术组.各相邻时间点间的比较差异 显着;缺血中心区的阳性细胞明显低于缺血周围区, 其变化规律与缺血周围区相似,除再灌流2h,8d, 16d#b其余各组相邻时间点无显着差异,见表2.
2.3Caspase--3mRNA表达及图像分析结果假
手术组仅见Caspase--3mRNA微量表达;缺血再灌
流组Caspase一3mRNA阳性神经细胞主要位于缺
血周围区,缺血再灌流2h表达逐渐增加,至24h达
高峰,再灌流2d表达逐渐减少,至16d仍有表达,略
高于假手术组,各组相邻时间点间比较差异显着.
缺血中心区的阳性细胞明显低于缺血周围区,其变
化规律与缺血周围区相似,除再灌流2h,8d,16d外
其余各组相邻时间点无显着差异,见表2.
2.4脑缺血再灌流后炎性区域白细胞浸润与细胞
形态学变化见表3.假手术组大鼠脑组织未见炎
性细胞浸润与神经细胞凋亡;缺血再灌流组,缺血周
围区凋亡,损伤,坏死的神经细胞与炎性细胞浸润高
于缺血中心区,再灌流6,12h,在大脑皮层及纹状
体区可见少量凋亡的神经细胞;再灌流24h后,出现
较多凋亡,损伤的神经细胞,可见核深染的神经细胞
出现;再灌流2d后,缺血坏死区的界限明显,缺血性
NervousDiseasesandMentalHealth.2004,Vo1.4,No.4
损伤较严重,神经细胞核出现严重的核坏死与核碎胞浸润逐渐减低,坏死组织区逐渐扩大,以后形成斑
裂,炎性细胞浸润达到高峰;再灌流4,16d,炎性细痕组织. 裹2脑缺血再灌流各组Bcl--2和Caspase--3mRNA表达图象分析结果 注:各相邻组时间点比较:1)P<O.05;与同一时间点周围区比较:2)P<O.05.
裹3缺血再灌流后不同时间点白细胞浸润及神经细胞损伤的变化 组别6h12h24h2d4d8d16d
3讨论
3.1病理学变化脑缺血再灌流损伤后,引起大脑
皮层及纹状体区脑组织的病理学变化,介导神经元
细胞凋亡,引起细胞损伤,坏死,导致炎性细胞浸润. 由于缺血性再灌流性细胞损伤,使白细胞浸润在炎 性区域中发挥着重要的抗炎作用,可能会引起机体 内源性保护机制的触发,对缺血再灌流后细胞损伤 的保护和修复起到一定的作用,并能够有效地抵御 细胞凋亡,损伤,坏死的进程.Bcl一2蛋白及 Caspase一3mRNA对抑制细胞凋亡和促进细胞损 伤起着重要的作用.本实验结果显示,缺血再灌流 后凋亡细胞主要位于缺血周围区,损伤,坏死细胞主 要位于缺血中心区,随着缺血再灌流时间的不断延 长,缺血周围区细胞损伤,坏死逐渐加重,是一个动 态渐进的演变过程.缺血再灌流后细胞凋亡,损伤, 坏死由6h开始逐渐增加,至24h达到高峰,2d后逐 渐减少.这与Marlangue等报道l_3],"温和的脑缺血 以细胞凋亡为主,严重的脑缺血以坏死为主"的结论 相一致.因此,在脑缺血的早期进行抗凋亡治疗将 会成为脑缺血治疗的主要内容.本文认为缺血性脑 神经细胞损伤与DNA损伤和蛋白质合成程序的启 动以及相关基因的表达有关.有关研究显示l_4],脑 缺血后引起的缺血性脑损伤是一种损伤级联反应, 这种级联反应涉及4个阶段:兴奋性毒性,梗死周围 的细胞去极化,炎症,程序性细胞死亡.其中兴奋性 毒性在损伤级联反应中起重要作用.本研究神经细 胞对缺血比较敏感,缺血周围区早期以细胞凋亡为 主,如能及时给予有效的治疗,凋亡细胞可能恢复正 常,使损伤,坏死神经细胞得以挽救和修复;反之,随 时间的逐渐延长,凋亡神经细胞未能得到有效的治 疗而趋于死亡.据报道[5],在缺血再灌注后产生的 大量自由基,引起脂质过氧化瀑布效应,使蛋白质变
性失活,DNA多核苷酸主链断裂;兴奋性氨基酸与 自由基可激活磷脂酶A2,导致细胞膜降解,转运功 能,屏障功能受影响,导致细胞死亡.
3.2Bcl一2蛋白,Caspase--3mRNA水平表达及炎 性细胞浸润与神经细胞凋亡的关系缺血再灌流 后,炎症性脑组织损伤介导神经细胞凋亡,引起细胞 损伤,坏死,导致白细胞浸润.本实验结果表明:假 手术组Bcl一2,Caspase一3mRNA水平表达均呈微 弱表达;炎性细胞浸润分为I,V级,6,12h浸润 为I级,在大脑皮层及纹状体区可见少量凋亡的神 经细胞,Bcl,2,Caspase一3mRNA由轻度向增高表 达;24h浸润为?级,在炎症区可见核深染凋亡,损 伤的神经细胞,Bcl一2,Caspase一3mRNA达高峰; 2d浸润为?级,缺血坏死区的界限明显,缺血性损伤 较严重,神经细胞核出现严重的核坏死与核碎裂,白 细胞浸润达到高峰,Bcl一2,Caspase一3mRNA表达 逐渐降低;4,8d浸润为?极,坏死组织区逐渐扩 大,白细胞浸润的抗炎能力逐渐减弱,Bcl一2, Caspase--3tuRNA表达明显降低;16d浸润为V级, 坏死组织形成斑痕组织,Bcl一2,Caspase一3mRNA 仍有表达,均高于假手术组.
3.3Bcl一2蛋白表达与神经细胞凋亡的关系Bcl 一
2表达在细胞凋亡调控过程中起重要作用.据相 关报道_1],脑缺血时存在着缺血性与再灌注脑损伤.
神经疾病与精神卫生2004年第4卷第4期 本文结果表明:在缺血1h与再灌流2h后出现脑组 织损伤.假手术组见Bcl一2蛋白微弱表达,在缺血
周围区,缺血1h与再灌流后2h可见Bcl一2表达逐 渐增高,再灌流12,24h达高峰.再灌流2d表达逐 渐下降,至16d仍有表达,略高于假手术组,各组相 邻时间点比较差异显着,缺血周围区高于缺血中心 区,除再灌流2h,8d,16d外其余各组相邻时间点无 显着差异.Chen等^6]在大鼠局灶性脑缺血1,2h, 再灌注24h发现皮层有Bcl一2表达,并在缺血2h 神经细胞生存中起主要作用,即在存活的神经细胞 中Bcl一2蛋白表达增高,与本实验结果一致.Law— rence~等发现过度表达Bcl一2基因的转基因小鼠 中,Bcl一2蛋白能降低大脑中动脉阻塞的缺血性脑 损伤,缩小梗死体积,证明Bcl一2的表达能够抑制神 经元细胞的损伤.
经研究表明,脑缺血再灌流后Bcl一2蛋白表达 早期增高明显于后期,并随缺血再灌注时间延长表 达逐渐呈下降趋势.提示脑缺血再灌流随时间的延 迟,而Bcl一2表达减弱.缺血早期既有细胞凋亡,又 有Bcl一2的高表达,其在维持缺血神经细胞存活方 面起主要作用.本文认为脑缺血再灌流后Bcl一2蛋 白可抑制细胞凋亡,使濒临凋亡的细胞得以挽救和 修复,使其免于死亡.
3.4Caspase一3mRNA表达与细胞凋亡的关 系据研究报道],Caspase一3家族在细胞凋亡中 具有中心效应,其处于核心位置,凋亡的最后实施通 过Caspase--3激活而实现,是凋亡促动剂.本研究 结果显示,假手术组微量表达,缺血再灌流2h表达 逐渐增加,至24h达高峰;再灌流2d表达逐渐减少, 至16d仍有表达,略高于假手术组.各组相邻时间 点比较差异显着,缺血周围区高于缺血中心区,除再
灌流2h,8d,16d外其余各组相邻时间点无显着差
异.在短暂脑缺血后大脑皮层及纹状体区caspase--
3mRNA蛋白表达增高,进一步证实Caspase一3基
因在缺血性神经元细胞损伤过程中起重要作用.Ni
BE和Namura_1叩研究发现,脑缺血后神经元细胞
Caspase--3mRNA蛋白表达增加,酶的活性增强,均
定位于TUNEL阳性的神经元内,与本文献报道一
致.据有关报道_1,脑细胞缺血坏死与caspase一3
基因的活化有关.本实验结果证实,脑缺血再灌流
损伤后,引起迟发性神经细胞损伤,坏死有细胞凋亡
?
255?
因素存在,可通过抑制Caspase--3mRNA表达这一
途径来抑制缺血性神经细胞的凋亡,避免进一步发
生迟发性神经细胞的损伤和死亡.
本研究认为Bcl一2蛋白可防止或减少脑缺血性
损伤,Caspase--3mRNA过量表达可促进脑缺血性
损伤,二者与细胞凋亡所引起的神经细胞损伤,坏死
的发生和发展有密切的关系.
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(收稿日期:2004—05—11)