用过氧化物酶快速测定果蔬中维生素C含量

× × × × × × )( × 无谒轻工业学院 译 爻 × × × × × × × × × × × × × × × × ×× × × × )(× × × × × × × × × × ×× ×× 摘 要 本文报道了用过氧化物酶在过氧化氢存在下测定果蔬中维生素c含量的 一种新的酶法测 定。该方法的原理在于比色测定 1，4一一二氨基苯 (作为合成底物而加入，可作为维生 素C氧化的终点 )的氧化深色产物，而果蔬中其他生化物质无干扰。该方法与采用抗 坏血酸 氧化商的传统方法一样准确和快速，并且所需的酶价格低廉，不需要昂贵仪器。 前 宦 酶法含量滟I定比传统方法具有更多的优点，酶法由于不需要预先纯化被分析样品， 放费用憾，努析速度快；另外目前常规分析方法限制了酶法台量钡l定的广泛应用。因此酶法 和常规法还必须同时并举。 在果蔬的商品生产中，维生素c含量是一个鉴定果蔬商业价值的重要客观指标．嚣此， 分析这种重要化台物必须要有快速和可供广泛使用的方法。 维生索c彳 容易被过氧化物酶氧化，这种酶广泛分布予植物界中，在过氧化氢存在下， 催化含酚基或氨基的复杂分子的各种生物合成和阵解过程。本研究的目的是一种新的酶 法，用过氧化物酶快速、准确测定市售果蔬中的维生素c含量，并与 目前常用的其他 方法进 籽对比。 材料和方法 新鲜和市售果蔬直接从果蔬国采摘或从当地市场购买，西红栉样品有试验品种和普i茜品 种，所有试剂是最纯级。过氧化酶呈无盐粉末状，比话力150红措静单位／mg固体。从绿西 葫芦中得到抗坏血酸氧化酶 (L一抗坏血酸：0z氧化还原 酶，根 据Marcbesini和Kro~eck报 道舶方法进行纯化 ，芳 根据Case]]a等人的方法进行鉴定。 对于每1 00g能食果蔬中维生素c含量大于1 0mg的果蔬，在所有实验中，都 采 用 ENZIT? 比色仪 (先进产品，Mi Jao)在32Ohm波长她读数，池3 d，若维生素C含量较低刚必须 用1Oral池在相同波 长下读数。 维普资讯 http://www.cqvip.com 分析样品制鲁 每份样品从果蔬可食部分混合取样1 0cg，对每份样品在4℃下加1 Oc 13％偏磷酸和20c g EDTA钠盐，J~Brown均质机以最大速度均质 1分钟，样品于 4 oC下用Beckmann离心机 (型号 T 2--21)~J．4o，000xg离 G,3o：9-~l,，在整个分析过程中上清液用铝箔 包裹避 光并 保存于冰 水中。 维生素c含量溯定 取维生素c含量在0．1一!．Omg的提取 液一份， 固 体Na 3po d调PH5．3装入 ENZ177比 色仪的光学 池中，对维生素C含量高的样品，只需取少量体积的提取液，在这些情况下，用 微电极可方便地控制PH，相反，则可能要取大量提取液调PH，仅取其中部分进行比色测定 在样品中加入looulo．olrng／ml过氧化物酶溶液和 l mlmg／rol1．4一二氨基 苯的染 料溶液 ) 酶和染料分别溶于0．1MPH5．3的磷酸盐缓冲液中 )，在充分混合 (将磁搅拌 装 置与 比色仪 相连进行连续搅拌 )后，加入10~ml0．1M过氧化氢，测定立即开始。当一加入过氧化氢时， 立即用计时器 (精密度0．1秒 )记录反应过程时间，并在ENZI77比色仪上320nm处读出吸收 值。由于在接近终点时指针上升非常快，因而选择维生索C被完垒氧化的反应时间应与吸收 值读数达到末端刻度值 2的位置相当。 · 在一些实验中，提取液首先用抗坏血酸氧化酶处理。即在每份样品中加入i0Oug抗坏 血 酸氧化酶( 总蛋白计)并使之反应1 O分钟，用 3 低磷酸使酶失活，样品用固体Na aPO·调至 PH5．3，若 要 时，可 加入过氧化物酶和抗坏血酸。总抗坏血酸含量 (抗 血酸作了和脱氢抗 坏血酸含量的总和)的测定根据Marchesini等人的操作过程用HugeS的同型半胱氨酸方法进行。 本酶法与男一酶法(用抗坏血酸氧化酶)和氧化还原化学法(用2．6一 一 二氯 吲哚爵，对 比。 。 镶计分析 三个分析方法的实验数据用二向方差分析法(two--way analysis of v~riance)和逐步 多范围检验法 (successire Duncan s multiple range test)进行处理。 结果和讨论 众所周知，过氧化物酶催化抗坏血酸氧化的速率比l， 4一一二氨基苯氧化速率要快得 多。因此，可以认为当这些化合物的混台物在过氧化氢存在下用催化量的 过氧 化 物 酶处理 时，过氧化氢深色产物的出现， l， 4一一二氨基苯的氧化深色产 物的出现可作为 维生素C 氧化的终点，事宴上，根据材料和方法中所述的操作过程，用纯抗坏血酸样品所测得的标准 瞳线在0．1一1．0rag范围内时间 (秒 )对维生索C(mg)呈线性关系。在该范围内，对10个平 均数据 (每个数据是从 5个单独测定中得到进行最小二乘分析，得到斜率l0．05(±0．01) 和截距0．02(±0．01)(相关系数0．998) 平均值曲标准谈差都是0．04秒 (相应于A-0．05秒的9s％置信 区问 )。I【{于 计时器 受 常 规误差影响，显然髓着维生素c含量的增加而百分误差碱小，因此，用☆ o．4— 1．o g维 生素c的提日，油来删定川比较台适。然而，把臣力法推广’到测定果蔬中维生素c的主要 问 34 维普资讯 http://www.cqvip.com 是可能存在干扰测定的天然物质。 为了证明生物化合物没有干扰，果蔬提取物的样 品首先甩抗坏血酸氧化酶进行处理，这 种酶利用分子氧，在特定方法所采用的条件下，刘扰坏血酸的氧化是专一的，在氧化后用酸 处理提取液可使酶l戋活J把 己知量的抗坏血酸加到这种处理过的提取液中，以划定这种过氧 化物酶的方法的专一性，这些初步试验盹一些代表数据见表1。在其他实验巾，发现用过氧 化 物酶来测定维生素C含量。则不受各种酚类化合物如氯原酸、咖啡酸，阿魏酸耵J儿 茶索 ( 班超过抗坏血酸的 5倍量加入 )的干扰。泼过程的重要特点是测定时的PH值，在PH5．3时， 精确度高、重复性好和速度快。随着提取 物的 PH降低，酶促反应渐渐变慢，因为作为指 示 剂的芳胺质子化增加。事实上，在PH4．5时，反应太慢以致于不能快速测定。此外，降低PH 对于减少磷酸盐的缓冲能力是不方便的J另一方面，当PH升高剐，反应变快，生化物质会产 生某些干扰 在PH6．0时，反应时间太短以致于不能得到可靠的垫点测定时间。 表 1 用过氧化物 酶测 定维 生素C含量时的干扰 研究 a，每十熬据墨4十测量值的平均值(最大误差士 i笳] ‘ b A O代表抗 血酸氧化酶 c 括号中的数值是用A．O 处理后所蠹加维生索c的量【mg，1 0 0 g千重蔬菜) 对过氧化物酶方法的精确度与化学法和另一种酶法进行了划比。这两种方法目前都用于 测定维生索C，对予某些经热处理后酶蔬菜，用化学法有一定的局限性。用三种方法所得 到 的果蔬样品中维生素c测定值的对比见表 2。就所有的数据而言，经二向方差分析和连续 多 范围检验法处理后曲结果表明，只有在化学法 (A)和酶法 (B和c)之间有较大的差别 (在 5 水平上 )。事实上，前者测定结果大大高于后两者。如果仅考虑新鲜水果的数据，化学 法和酶法之间能差 很大 (1％或 5 承平 )，丽弼种酶法之间的差别在统计上仍然不显著 。 用方法A测定经热处理过的蔬菜其结果明显倔 高，而用方法B和c这现象似乎不会出现，在 这些情况中， 2， 6一 二氯吲哚酚方法不准确主要是由于被加热处理巾产生的一些还原性 的干扰而引起的， r 总抗坏血酸含量是鉴定果蔬维生索值的另一有J 参考值。眭j为这两种化台锚都是市售产 品中维生索的来源。这种过氧化物酶方法也能用于测定总抗坏血酸古釜，该操作过程的主要 原理是 l 酶促反应中脱氢抗坏血酸缺乏抑制剥脱氢抗坏血酸可被刷型半胱氰酸还原成抗坏血 酸。对测定西红柿所得到的有关数据 (见表 3)表州；在这些水果中维生索c构还 原 总是 占主要的 35 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 2 用化学法和碡法谢定果蔬样品法维生素c含量的比较‘ a．结果量 ●个 宅值的平均值：最大误差：方法A在± 5 ．．方法B和c在± 1笳． A，用2，6一=氯嗡哚酚氧化还原法；B：抗环血曦氧化酶法；C：过氧化物酶往 b，c，相同品种的平均值澄有很盘的差别P>o．os d．新鲜样品 衰 3 用过■化物■法测定每100 辫西红柿中维生毒C(vltc或AA)和 聪 氯 抗坏血t (DHA)的含量 -．TA：总抗琢血暾，I班 A：脱氢抗坷：血酸，是TA~AA两者之差 b．实验品种 c．机柱收获的普通品种 结 论 虽然用抗坏血酿氧化酶的方法测定抗坏血酸是准确的，但该酶需要一个在非常恒定的温 度 (±o．O1℃ )下具有高精密度和重复校准的克拉克电极，这就限制了该法在常定分析中的 广泛应甩性。相反，过氧化物酶的方法灵滔I容易操作，不需要昂贵仪器，另外，过氧化 物 酶价格相对较低，并窬易买到。 译自《T． Food Sci))S4， 2，37 4，]989 维普资讯 http://www.cqvip.com