低聚木糖产生菌的选育研究

④ 14 广州食品工业科技 Guangehou Food Science and Technology vo1．16 No．3(总 63) 一 f 6 低聚木糖产生菌的选育研究 ．要堕鎏 (淮阴工业专科学校生物系 淮阴 223001) T 2。／、 摘 要 黑曲霉能分解玉米蕊木聚糖并产生低聚糖， 黑陆霉 HGll为出发菌株，经紫外线 ，亚硝基胍处理 ， 获得一高产低聚木糖菌株 HGll一培一8 。该菌株具有稳定遗传性能，在最适发酵条件下 ，木二糖相对於木聚糖转 化率为 68_8％，比原菌株提高了 161．5％。 关键词题 ； ；垂直 玉牛 ，苗 牛．宦品 Abstract Aspergillus nlge~can decom~ the corn cob xy【 and pmdudng xylo—oligosoocharides Take ．As— 【Ius nigerHGll as fungus．Itwastreated byfluka rtad ultraviolet W e can gettheWodf,angatsHGII一 培 一 8 of high yielding xylo—oligesaccharides．It has stabilise heredity~．rformamce e maximal cottvel~Olq rate ol the xyliobk~e to xylan was 68曙 ％ ．raised to 161 5％ thaD_the original fungus in the stultable fermtmtation Key word xylo—oligosaccharide；．~'pergillus niger；seed．selection and breeding 低聚木糖通常由2～7个木糖通过 B1．4一 糖苷键连接而成，它具有低甜昧 ，难消化，加之 它耐热、耐酸 ，稳定性好，显示肠内乳酸菌选择 增殖活性摄取量仅为 0 7g／d．这些 良好特性决 定了它在今后各种健康食 品的应用前景乐观。 作为生产低聚木糖 的原料，如玉米蕊，甘蔗渣、 棉壳等 ，它们含有丰富的木聚糖半纤维，且来源 广泛，价格低廉 ；合理开发，充分利用可以减少 污染，变废为宝。本研究利用 曲霉分解玉米蕊 木聚糖产生低聚木糖，就提高黑曲霉分解木聚 糖能力上作了一些探讨。 1 材料与方法 1．1 菌种 黑曲霉 HG1l(Aspergillus niger HGl1)本 校微生物室保藏菌种 1．2 培养基 1．2 1 斜面培养基：PDA培养基 1．2 2 平板培养基：以木聚糖粗提物 5％作为 碳源，取代察氏培养基中蔗糖。 1 2 3 摇瓶培养基(％)：木聚糖粗提物 l0，尿 素 0．3，k2H2304，KC1 0．05，MgSO4 7t-I20 0．05， FeSO4 71-12O 0．001，pH值自然。 l 2．4 培养条件 斜面得平板培养条件：32℃ ，3天 摇瓶条 件：500ml三角瓶装 50 m1，32℃摇 床转速 200rpm培养 84h，pH值自然。 1．3 原材料 玉米蕊市售 ，其它试剂为纯 1．4 分析方 法 1．4 1 木聚糖粗提物制取l2J 1．4．2 低聚木糖测定 ：取发酵液调 pH值至中 性 ，滤去不溶物，清液以3 5一二硝基水杨酸法 测木糖含量。再另取清液用 6N HCl水解，经 中和后以同样方法测木糖含量 将水解前后木 糖含量的差值乘以低聚木糖聚合度系数即得低 聚术糖含量。 l 4．3 低聚木糖种类分析：取澄清发酵液经适 当稀释后在层析滤纸上点样，用溶剂展开(正丁 醇 ：乙酸：水)再用显色剂(苯胺一邻苯二甲酸溶 液)喷雾 ，于 105℃加热 5～10rnin．烘干后与标 准对照，确定发酵液中低聚木糖的种类和相对 浓 度。 l 5 菌种诱变 出发菌株一新鲜斜面菌种一孢子悬液调 整至 5× l06个 I^1l一 紫外线、亚硝基服复合处理一稀释涂粗术 维普资讯 http://www.cqvip.com 广州食品工业科技 Gtkqngg~ll Food Scienc~andT~hnology vol 16No 3(总 63) 巧 聚糖平板一挑取透明圈大的菌落一摇瓶初筛一复筛一 传代试验一高产菌株 2 结果与讨论 2．1 菌种选育研究 2．1 1 菌种的分离筛选 对黑曲霉 HG1l菌株活化 ，进行平板分离， 挑取透明圈直径大的菌落到斜面，共得到 50支 斜面菌种 ，编号为 HGll—l 到 HGll一50 进 行摇瓶试验 ，发现 HG11—18 较好，但分解能 力低(42．6％)，发酵时间 108 h，经分析检测分 解产物主要为木二糖，因此 ，必须对菌种进行选 育，以缩短发酵时间，提高分解能力。 2 1．2 孢子悬液制备 以 HGll—l8 为出发菌株 ，用无菌生理盐 水洗下斜面上的孢子，置於有 20粒小玻珠的 250ml三角瓶中於 32℃，振荡 30min，用脱脂棉 滤去菌丝片段，血球计数并调整孢子浓度至 5 × 10 。 2 1．3 紫外线 亚硝基胍复台处理 取 5ml制备好的孢子悬液置於培养皿中放 于一 无菌磁力 搅拌 棒，於 磁力搅 拌机 上，在 15W 紫外线下30em处照射 4min后 ，保持黑暗 3h。分析天平称 6rag亚硝基胍溶於 6m10 1M 磷酸缓冲液中於暗处 振荡溶解 ，吸取该液 4ml 加人照射后的孢子悬液 中，32℃振荡 30min，立 即稀释到 loo0倍 ，停止作用，从上面所制液 中 吸取 l ml稀释至 l0 稀释度再吸此稀释度溶 液 0．1ml在平板上涂布均匀，置於 32℃恒温培 养 3天 ，选得 8o支菌株 即 HGll—l8一l 至 HGll—l8—80 ，对其进行摇瓶初筛和复筛， 得到 HGll一18—8 ，分解木聚糖能力大大提 高，使木二糖相对於粗木聚糖转化率得到 68． 8％，发酵时间为 84h 2 1．4 传代试验 通过对选育的菌株 HG11一l8—8#进行 传代试验，结果如 l所示，以分解木聚糖粗提 物能力为评判指标。 表 1 传代试验结果 传代数 2 4 6 8 10 12 HG11—18—8# 68 6 68 6 68 4 68 1 67 8 64 6 注：(1)50o~ 三角瓶中装发酵液 50 发酵。 (2)表中数据低术聚糖 木二糖计(mg／m1) 由此可知，菌株传代次数在 10代以内分解 能力稳定。 2．2 培养方法确定 经过固态和液态培养对粗木聚糖分解能力 对比试验发现固态发酵，虽然操 作简便，成本 低，但易染菌不利于控制 ，转化率较低，故以液 态作为试验方法。 2 3 发酵条件试验 2 3 1 尿素用量对分解木聚糖粗提物的影响 硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、尿 素均可作为发 酵液的氮源，但以尿素为好，故在其它条件不变 情况下，掭加不同用量尿素进行试验。结果如 表 2所示。 表 2 尿素用■对分解木聚糖粗提物的影响cmg／ml】 用量(％) 0 1 0 2 0 3 0 4 0．5 0 6 禾=糖 量 60 3 65 2 68 8 61 7 60 2 59 5 由此可见，尿素用量以0 3％为佳 2．3．2 培养温度对分解木聚糖粗提物的影响 黑曲霉培养温度在 3o℃左右，试验在 25～ 40"C条件下进行 ，结果见表 3。 表 3 不同培养温度对分解木聚糖租提物的影响(rT1g^ I11) 由表 3可见，发 酵以 32℃为最佳 ，如高于 此温度或低于此温度木二糖得率呈下降趋势。 2 3．3不同发 酵时间对分解木 聚糖粗提物影 响。 在其它条件不变情况下，经过 108h培养 ， 测定木二糖得率 ，结果见表 4 表 4 不同发酵 时间对分解木聚糖租 提物的影响 crag／ ) 发酵时问(h) 48 60 72 84 96 108 禾 ：糖 量 47 2 50 4 61 3 68．8 68 5 68 5 维普资讯 http://www.cqvip.com 16 广州食品工业科技 01aI1商 】Food Science and Technology vo[16 No．3(总 63) 由表 4可知：发酵时间为 84h时，木二糖量 不再升高，所以84h为最佳发酵时问。 在其它条件不变情况下，用 500ml三角烧 瓶，分装数量不等的发酵液进行摇瓶试验 ，测定 2．3 4 不同通风量对分解木聚糖粗提物影响 术二糖得率 ，其结果如表 5所示。 表5 不同通风■对分解木聚糖粗提钧的影响crag／m]J 由表 5可知，装液量少 ，通风量就大，木二 糖得率高 ，但考虑到蒸发量对结果影响，因此以 500ml瓶中装 50ml摇瓶最佳。 2．3．5 不同摇瓶转速对分解木聚糖粗提物影 响 其它条件不变，在不同的摇瓶转速下，测其 木二糖得率如表 6所示。 表 6 不同摇瓶转速对分解木聚糖粗提物影响(rag／m]) 摇瓶转速(r口m) 140 160 180 2OO 220 240 木： 糖 量 64 2 66．5 6"7 3 68．8 68．4 68 4 由表 6可知，摇瓶转速在 200rpm 以上时 ， 木二糖产量未见增加，所以以200rpm为佳。 2．4 讨论 2．4 1 黑曲霉 HGl1经紫外线 ，亚硝基胍复合 处理 ，可显著提高分解玉米蕊木聚糖粗提物，使 得木二糖得率大大提高。通过以上试验研究表 明：尿素为最适氮源，用量以O．3％为宜 。最佳 发酵温度为 32℃ ，时间为 84h，通风量 以500ml 三角瓶装 50ml发酵液为宜 ，转速在 200rpm 为 最佳。在 以上最佳条件下，使木 二糖得率 为 68．8mg／ml。 2．4 2 由于玉米蕊在我国有广泛来源，它作为 低聚糖加工原料 ，早 已引起国内外有关学者的 关注。利用黑曲霉分解玉米蕊生产低聚木糖也 偶有报道，但存在着转化率低，缺乏对发酵条件 详细探讨的问题，本研究利用利用微生物菌种 选育技术，使黑曲霉分解木聚糖能力有 了显著 提高，对发酵条件做了较为详细的探讨 。从研 究结果来看 ，对于亚硝基胍处理黑曲霉最佳条 件还待进一步试验 ，以提高其诱变效果，使黑曲 霉分解能力再提高一步。 参 考 文 献 l 陈天寿 微生物培养基制造与应用 北京 ：中国农业 出版社．1995 2 Bastawde k B Wodd J Mierob Biotech，1992．8：353 ～ 368 3 诸葛健．发酵微生物学宴验技术 南京：江苏省调味 品副食品科技情报站 ，1984。 4 无韫轻工业学院编．工业发 酵分析，北京：轻工业出 版社 ，1986。 5 宁正祥 食 品成份分析手册 北 京：轻工业 出版社， 1998 牧蒜 日期 ：2 3 8 (上接第 11页) 絮凝剂和助凝剂均为纯天然物质，安全无毒，很 适合在果蔬汁澄清中使用。 参 考 文 献 1 肖家捷等编译 果汁和蔬菜汁生产工艺学．北京 ：轻 工业出版社 ，1987：281 2 天津轻工业学 院，无韫轻工业学院合编 ．食 品工艺 学(中册) 北京：轻工业出版社 ，1982：l07～109 3 晋艳曦等 食品工业 ，1999，2：12～13 4 陈元彩、肖锦．工业水处理 ，1999，19(4)：l1～13 5 周祖康等编著．胶体化学基础，北京：北京大学出版 社 1987 290--291．． 作者简介 ：侯曼 玲(1956～)，女 ，副教授：现主要从事 食 品工程、环保及化学工程与工艺方面的教学和研究 牧稿 日期 ： ㈣ 3 24 维普资讯 http://www.cqvip.com