李斯特菌及其快速检测

《广州食品工业科技> Vo1．18 No．3(总 72) 李 斯 特 菌 及 其 ，陕 速 检 测 李干红 丁晓雯 (西南农业大学食品科学学院 重庆 400716) 摘 要 李斯特菌是一种能引起人兽共 患性食源性致病菌之一。近年来 ，在许多 国家，它被列 为卫生部 门重点检测的几种食 源性致病菌之一 。本文综述了李斯特菌的生理生化特征及运用免疫学和分子生物学对其快速检测的方法。 关键词 李斯特菌 ，快速检测 ，ELISA，DNA分子杂交，PCR Listaria and its rapid Detections Li Gan Hong，Ding Xiao W en (Food Sceince Southwest Agricultural University，ChongQing 4007 1 6) Abstract Listeria is one of the foodbom disease bacteria that can be found in human and aDilnals．Recently，in many coun tries，it has been listed as one of foodbom disease bacteria by Sanitation Department for hygiemc detections．This article summarizes the physiological and bio— chemical character of listena and the rapid detections basmg on immunology and molecular biology to detect it． Key words listetia，rapid detections，ELISA，Oligomemucleic aid DAN —hybrid，PCR 1 前言 李斯特菌 是 一 种 能 引起 人畜 共 患 的 食源 性 疾 病 的致病菌 之一 ，最 近几年在 发 达 国家食 用李斯 特菌 污 染的食品而导致患病率不断上升的报道颇多 ，在欧 洲 ，因其引起 的死亡人数 也在 不 断的上 升 ；在美 国 ，李 斯特菌被 列为 7种 主要 的食 源 性致病 之一 ，其 导致 的 住院率是最高的致病菌，仅从 1998年 8月到 1999年 1 月 ，短 短的几个 月 内就发 生 了 101起 由李斯 特 菌 引起 的疾病的报道 ，其导致 15人死亡。李斯特菌 曾被列 为 WHO食品安全(2000—2001年)重点检测 的食源性疾病菌之一。在我国香港、福建、辽 宁等地 也见有此 菌 引起 发 病 的 报道 。鉴 于李 斯 特 菌能 引 发 人畜共患的疾病 ，且其致死率高达 20％ ～30％，所 以 有必要对其进行 了解并建立快速的检测方法。 2 李斯特菌生理生化特征 2．1 形态 本菌早期被划归为棒状杆菌科 ，但后来又划为乳 杆菌科 ，但均有不符之处 ，在伯杰手册 中归为规则无 芽孢革兰氏阳性杆菌 ，其光滑型培养物呈短杆状 ，两 收稿 日期 ：20O2—05—07 作者简介 ：李干红，女，1979生，硕士研究生，研究方向为食品质量控制。 67 端稍尖 细 ，长 1～3胁 ，宽 0．5tim，成 单 个 、v或 Y形 或 短链排列，幼龄培养物呈球杆状 ，老龄培养物常带有 长丝杆 菌状 ，部 分或全部 细菌 可 变为 革 兰 氏阴性 。在 20℃ ～25℃培养 易见到运动 ，具 1～3根或 更多 的周鞭 毛 ，在 37℃培养 则不易见到 运动和 鞭毛 。不 产生 芽孢 和荚膜 。 2．2 耐力 和抗性 李斯特菌 生长 温度 在 3℃ ～45℃ ，最适 温 度 30℃ ～ 37℃，在 4℃下能形成菌落 ，这是本菌 的特征，在 一 20℃下可保存一年。本菌耐碱 不耐酸 ，生长 pH范围 在 5．6～9．8之 间 ，中 性 或 微 碱 条 件 下 生 长 最 好 ， pH5．6以下则死亡 。可在 10％的 NaC1培 养基 中生长 ， 能抵抗 25％的 NaC1；能在 10％胆汁、0．025％醋酸亚 沱、0．04％钛酸钾中生长 ，但在 0．02％叠氮钠 中不能 生长 ，而 且 此 菌 耐 热 较 强 ，在 60℃ 下 需 20min或 在 70℃下需 5min才能把它杀死 ，可耐受巴氏消毒温度。 对抗生素大都敏感，依次为氨苄青霉素 +庆大青 霉素 >氨苄青霉素 >利福霉素 >青霉素 >四环素 > 氯霉素，对黄胺 、枯草杆菌素有抵抗力 ，对链霉素很快 产生抗药性。治疗李斯特菌首选氨苄青霉素。 2．3 培养基的选择 本菌在 普通 的 肉汤 中生 长不 良，在 1950年时 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 Guangzhou Food Science and Technology Vo1．18 No．3(总72) Cray首次发现亚碲酸对李斯特菌和革兰氏阳性菌没 有抑 制作用 ，从 此 ，碲 盐 作 为选 择 因 子被 用 在 选择 培 养基。Mcbride等在肉汤中加入呋哺西林作为抑制剂 进行增菌 ，然后 转种在 苯 乙醇血 平板 中，培养基 以LiC1 和甘氨酸作为选择 因子 ；1988年 Lee等对 Mcbride— Girade琼脂进行改 良，使用头孢菌素，将 LiC1的含量 增加 10倍 ，并用甘氨酸酐代替甘氨酸 ，制成了 LPM 培 养基 ；1987年 Jay等在培养基 中加入啶奈酸、苯乙醇和 环乙烷 二酮 得 到 对 于食 品标 本 强选 择 性 的培 养 基 PN；1988年 Banerman等人以哥伦比亚琼脂为基质 ，加 入 、r啶黄和头 孢氨噻 啶制得 AC培养 基 ；Curtis也在哥 伦比亚琼脂中加入七叶苷 、LiC1、多粘菌和甲噻吩头孢 菌素制得 MOX培养基；Tiwari对 AC、MOX和 LPM 进 行 比较 ，发 现 MOX对 本 菌 的选择 性最 强 ，LPM 次 之 ， AC最 弱 。通 常在快速检测 中常用 EB或 LEB肉汤进 行预增 菌 ，选择 增菌 。 2．4 致病 性 本菌是一种细胞 内宿主寄生菌 ，引起的是属于细 菌型感染性疾病 ，主要是吸附在肠 内大量繁殖引起 的 病症。由其导致 的病 型有腹泻型和侵袭型两种。腹 泻型的潜伏期是 8～24h，有腹泻、腹痛、发热 、恶心、呕 吐等症状 ；侵袭型潜伏期是 2～6周，初为 胃肠炎 ， 现为败血症、脑膜炎等。 2．5 污染来 源 本菌在土壤、江河、蔬菜、水果、肉制品、牛奶 ，饲 料等都存在 ，这些都可 以成为污染来源 ，但对最初传 播者是 人还是 土壤 ，还是 有争 议。在食 品 中，依 据 WHO检验食品得到的数据报道 ：奶制品的污染 5％ ～ 10％，肉及其制品污染为 30％，家禽为 15％，水产品为 4％～8％。因本菌能在低温下(4℃)生长，故普通冰 箱中此菌仍能够繁殖 ，且还会可发生交叉污染。 3 李斯特菌快速检测法 3．1 以免疫学为基础的检测法 3．1．1 单克隆抗体酶联免疫法 在 1992年 ，Besson等人首次发现一株能稳定分泌 抗单核细胞增生性李斯特菌 的特异单克隆抗体的细 胞株 EM —TG1，以此 特异单 克 隆抗体 建立 的夹 心 ELISA方法 能 20～24h内检 出含 8～10个／g的样 品。 这是病原性李斯特菌检测 中重大 突破 ，第一次利用酶 联免疫方法把单核细胞增生性李斯特菌和非致病性 李斯特菌分 开 。 以后陆续的有利用单克隆抗体 ELISA检测的报 道 ，有李斯特菌属特异表位单克隆抗体，它们所针对的是 表位为菌体表面蛋白质分子量为 3000—3800KD，用此 表位单克隆抗体构成的夹心 ELISA检测技术能在预 增菌后 24h报告结果 ，且最低检测 浓度为 5xlo5个／ ml。 3．1．2 酶联免疫荧光检测 1985年，Mclaulin等人采用酶联荧光检测法，将异 硫酸荧光素结合到李斯特菌的两株单克隆抗体上 ，对 李斯特菌进行了直接的荧光检测 ，证实 了象软于酪等 动物性食 品 中李斯 特菌 的检 测 只需 2h可 完成 。焦新 安在 1994年研制了 3株具有特异表位 的单克隆抗体 C11、B18和 B5，建立 了快速检测李斯特菌的间接免疫 荧光和 ELISA，节省了检测的时间。 采用酶联荧光检测法制成的 VIDAS检测伐 ，可实 现全 自动检测 ，自动培养、选择菌 ，并 ，全部结果 都由机器 自动输 出。快速、简便、省时。翁文川等人 在 VIDAS自动检测仪联上 API listeria鉴定卡 ，不仅可 以快速 的检 测 出李斯 特 菌 而 且还 可 以分 类李 斯 特 菌 属。准确、快速 ，方便且具有广谱性。 3．2 以分子生物 学为基础 的检测 法 3．2．1 寡聚核苷酸 DNA探针杂交检测法 从 DNA水平上检测病原微生物，不受其纯度的 影响，能直接用于标本检测物，从而解决不易培养 的 微生物的检测鉴定问题。 对于血清型的李斯特菌在 已知其某一序列的保 守性 ，可设计出人工合成 的短聚核苷 酸。如 Datta等 人在 1988年克隆出单核细胞增生性李斯特菌 溶血 素基因，一个 50bp大小的基因片段 ，把此片段克隆进 M 3噬菌体载体并测定它的核苷酸序列 ，依其序列合 成它们的 4种寡聚核苷酸探针 ，以 P标记该探针，经 斑点杂交实验证实该探针只与单 核细胞增生性李斯 特菌反应 ，而与其他种的李斯 特菌反应呈阴性，表现 出 良好 的特异性 。 在 1990年时从单核细胞增生性李斯特菌 ScoTIA 的 DNA文库中克隆出 3．1kb的编码单核细胞增生性 李斯特菌溶血素 O基因。用 Hindm 对此基 因进行酶 切，克隆出位于溶血清 650bp的片段 ，以溶血素 O基 因和它的 650bp的 Hindm 消化片段作探针 ，对单核细 胞增生性李斯特菌进行检测 ，此基因对该菌表现出高 度的特异性 和敏 感性 。 3．2．2 运 用 PCR技术检测 自 1980年 PCR技术发明以来 ，已得了广泛运用 ， 其主要的原理是用一对寡聚 DNA作为引物。其步骤 (下转第 66页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 Guangzhou Food Science and Technology Vo1．18 No．3(总 72) 四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)、蔗糖、葡萄糖与果糖的混 合物。为了得到高纯度低聚糖，需除去原料蔗糖和另 一 产物葡萄糖。运用传统 的碳柱层析或碳柱层析与 制备性 HPLC串联 的方法，可得到 95％的低聚果糖 ， 但几种使用市售离子交换树脂分离过程的回收率都 很低而不适于大生产。现采用纳滤技术 ，控制供给液 的糖浓度 为 30wt％左 右 ，操 作 压力 为 2．94MPa。G10 复合膜和 NTR一7410膜(硫酰化聚砜系膜)的葡萄糖 透过率 约为 85％ ，1分子 葡萄 糖和 2分 子果 糖结 合 的 分 子量约 500的蔗果 三糖 的透 过率 为 5％，这意 味 ，对 葡萄糖透过 良好 ，而对 GF2却几乎不能透过，于是 两 者的分 离是可 能的 。 5．4 低聚木糖 的分离纯化 低聚木糖是指 由2～7个木糖以 p一1，4糖苷键结 合而的低聚糖。低聚木糖产品的主要成分为木糖、木 二糖、木三糖和三糖以上木寡糖，其 中以木二糖为主要 有效成分。而在酶法生产低聚木糖的过程中，低聚木 糖含量低(小于 2％)且含有 3％左右的 NaC1，采用传统 的离子交换脱盐及真空浓缩 ，需耗费大量的酸、碱 、再 生树脂 ，造成污染及耗费大量的蒸汽。而采用纳滤加 (上接 第 68页 ) 使要扩增的 DNA在较高的温度下变性解链 ，在较低 温度下退火，然后升高温度复制延伸。如此重复 20— 30次 ，就 可以扩增 DNA，然后 检测 。 单用 PCR技术进行检测虽 比传统 的 GB478930— 94检测法快、灵敏。但 PCR技术仍受基质 、杂菌等的 干扰而呈假阳性。要得 出更理想的检测结果 ，不少学 者进行 了改进 ： ①把 PCR技术配合 SSCP(single strand configura— tion polymorphism)可 很 好 的解 决 此 干 扰 因 素。以 16rRNA保守区作引物 ，进行 PCR扩增后 ，然后对扩增 的产物进行 SSCP分析【m ； ②采用同步 PCR技术对单核细胞增生性李斯特 菌检测和分类也可解决 PCR受干扰的问题 ，同步 PCR 技术是在 RAPD(Random amplification of polymorphic DAN)分析 技术和 COGEDET(Conbined gene detection and epidemical typing)分析技术上发展而来 的。它是 采用任意带有特异基 因引物位点 RAPD，利用李斯特 菌的 4条已知引物 HLYA、PRFA、ISP和 FLIA和 6个 RAPD引物组合来检测单核细胞增生性李斯特菌。此 法可直接从受 污染的食品、强化 肉汤 中检测李斯特 菌 ，快速 ，灵敏 【l1 ； 洗滤的方法则可脱除 95％以上的NaC1，使低 聚木糖的 含量达到 80％以上，且大大降低了能耗和污染排放。 6 展 望 纳膜过滤的截留分子量介于超滤与反渗透之间， 选择不 同孔径 的纳 滤膜 ，可 将单 糖 、二 糖 、三 糖 以至 五 糖以上组分依次分开，因此对功能性低聚糖的分离可 以达到 很好 的效 果 ，并 具 有 不 影 响分 离 物 质 活 性 ，节 能 ，无公害等特点，是一个新兴的值得瞩 目的领域，必 将会有 广阔的应 用前 景 。但 由于制 膜技 术 的 限制 ，纳 滤 膜 的 截 留孔 径 不 是 绝 对 的 ，而 是 一 个 范 围的 平 均 值，因此要达到较高的分离度往往需要较长的柱膜长 度 ；而 且 由于无 机 污染 物 如 CaCO CaSO4等 结 垢 物 质 、有机污染物 如两性有 机物 、微生 物 污染物 如 杆菌 、 孢子等 在膜 表面 的浓 缩滞 留造 成纳 滤膜 的 污染 ，膜 需 要经常的杀菌、清洗等处理 ；生产操作 时截留组分和 透过组分对膜渗透率的差异等等 ，都在一定程度上制 约了该技术的广泛应用。因此，如何加大纳滤技术的 推广力度及妥善解决膜清洗等问题尚有待研究。 (参考文献略，共 20条) ③脉冲凝胶电泳法(Pulsed—Field gel electrophore— sis PFGE)，它引入 的 是 限制 性 的染 色 体 DNA分 子 水 平上进行鉴别，也得到了一定 的应用，缺 陷是操作 的 步骤烦琐 ，而且需专业的操作员ll2 ； @Fluit等建立的一种新型系统磁 免疫 PCR(MI— PA)检测法 ，此法以单核细胞增生性李斯特 菌和无 害 李斯特菌的单抗 Mab55包埋磁珠 ，直接从样品中分离 以上两种细菌 ，经裂解 ，李斯特菌释放 DNA，以溶血素 。基因和迟发变态反应 DTH基因来设计引物 ，经 3O 次循环 ，可得单核细胞增生李斯特菌 的 PCR产物，然 后检测。此法十分敏感 ，缩短了时间。 4 展望 目前对李斯特菌的所有检测方法 ，花费的时间都 较多 ，大都在 20～48h。因此 ，有必要改进或建立一些 新的检测法，如建立在分子水平上的无须增菌而直接 检测——流动细胞计的特异快速分析【B ；如在免疫学 上利用特异抗体敏化的免疫色谱，几滴样 品加到卡片 上 ，肉眼或普通放大镜就可看 出反应特征，得出结果 ， 且 时间不 超过 10min【14j。 (参考文献略，共 l6条) 66 维普资讯 http://www.cqvip.com