[doc] 蓝氏贾第鞭毛虫病毒研究进展

[doc] 蓝氏贾第鞭毛虫病毒研究进展 蓝氏贾第鞭毛虫病毒研究进展 ? 464? 中国寄生虫痛防治杂志 ChinJParasitDis( 2005年12月第l8卷第6期 December2005.Vo1.18,No.6 蓝氏贾第鞭毛虫病毒研究进展 刘全’综述,张西臣审校 (1.军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130062;2.吉林大学畜牧兽医学院) 【中圈分类号】R382.2【文献标识码】A【文章编号】10016627(2005)06—0464—04 自从1972年Mattern等I1]首次在溶组织阿米巴的某些 虫株中发现病毒样粒子后,人们相继在阴道毛滴虫?I,蓝氏贾 第鞭毛虫(简称贾第虫)[4],艾美尔球虫ra],巴贝斯虫_6及利什 曼原虫_7]等原虫中发现特异性双链RNA病毒,目前原虫病毒 已成为寄生虫学研究的热点.蓝氏贾第虫病毒(Giardialain— bliavirus,GLV)是继阴道毛滴虫病毒发现后确认的第2个原 虫病毒,GLV的发现为贾第虫病的诊断与防治,原虫与病毒及 宿主间相互关系的研究提供了新的方向. 1GLV生物学特征 1990年国际病毒分类命名委员会将GLV芷式归人单组分 双链RNA球状真菌病毒科(Totiviridae),贾第鞭毛虫病毒属 (Gn口”).GLV外观呈球形,2O面体,对称,无包膜,直 径为33nm,浮力密度为1.368g/ml].该病毒见于感染的滋 养体核内及胞质,最终释放至培养基,可以感染某些无病毒贾 第虫的虫株.大量病毒感染不会溶解滋养体,但可终止其生 长.病毒抗血清与100ku病毒蛋白反应强烈,对体外培养的贾 第虫感染并不起保护作用,但可以清除虫体内的病毒l】. Wang等_1检查了76株贾第虫滋养体及其分离物,其中 28株含GLV,大多数无病毒虫株对GLV易感.Johan等l】胡从 牛贾第虫(G.bovis)滋养体和猫贾第虫(G.cati)滋养体中分离 到约7.0kb的dsRNA病毒.Tai等l】3]从贾第虫WB株(依据 贾第虫磷酸丙糖异构酶基因序列,将来源于北美的不同地 理/宿主的贾第虫分成3个不同的基因型,即1型,2型,3型.1 型代表株为WB株,2型代表株为JH株,3型代表株为GS株) 分离到2种不同的6.2kbdsRNA病毒,表明在贾第虫虫体内 存在多种不同的dsRNA病毒.原位杂交检测感染全过程中 GLV的亚细胞分布主要在细胞浆及2个核中,感染初期,病毒 RNA限定在细胞浆中;感染后72h出现在核内,同时观察到1 个恶化的空核,表明感染早期病毒在细胞浆中复制,对数生长 期是在细胞核中_1.病毒进入细胞的确切机制尚不清楚,胞饮 作用可能介导GLV的内化l1.在贾第虫WB株感染GIV过 程中,发现在病毒复制早期,感染细胞内出现1种为7kb的单 链RNA,在GLV的对数生长期持续较高水平,一旦GLV增殖 停滞即迅速减少l1. 贾第虫中相当一部分虫株对GLV感染耐受,这与虫体表 面缺少病毒受体有关[z.但经电穿孔感染,在细胞中出现病毒 蛋白和病毒RNA,病毒颗粒被释放到培养基,能够感染GIV 敏感虫株,当贾第虫WB株与GIV在4?条件下共同孵育,并 用琥珀二酸试剂处理,免疫荧光几乎检测不到病毒蛋白,但在 细胞膜上可以出现荧光,表明病毒与膜组分相连.用类似方法 处理Ac和JH株,无论细胞内还是细胞外都无荧光.胎儿毛滴 虫和阴道毛滴虫不能感染GLV或其RNA转染.贾第虫WB, Ac和JH株Tritonx_l14抽提蛋白用半胱氨酸标记比较,WB ? 综述? 株明显不同于Ac和JH株,这可能与GIV易感性有关. 0ng等”曾分离到2种GIV,用免疫组化检测受染细胞 病毒抗原分布,细胞质中出现大量信号,提示GLV的一部分在 细胞表面,而细胞核内信号较弱.通过电镜直接观察贾第虫体 内GIV的分布发现,病毒样颗粒可存在于细胞质中,在感染后 期出现于细胞核中,病毒相关性小泡和一些电子密度较高的核 结构只能在感染病毒的细胞中发现,这表明病毒感染可以导致 贾第虫亚细胞结构改变. 俞建军等_2在犬贾第虫包囊中观察到病毒样粒子,该病毒 粒子位于犬贾第虫包囊的胞质中,呈球形,直径约为33nm,有 1个电子密度较高的核被包裹在1个厚度约为5,6nm的核衣 壳内.经生化分子生物学鉴定犬贾第虫病毒为dsRNA病毒, 病毒核酸大小约为7.0kb,具有RNA依赖RNA聚合酶活性. 犬贾第虫dsRNA病毒核酸序列经BLAST对GenBank数据库 进行同源性分析,该序列只与Wang等[233报道的蓝氏贾第虫病 毒序列具有较高同源性,证实在贾第虫虫体内确实存在多种 dsRNA病毒.田宗成等对人源贾第虫北京株总核酸电泳, 在电泳图谱上观察到约7.0kb的核酸片段,该核酸不能被 DNA酶(】00~g/m1)降解,但可被RNA酶(10t~g/m1)降解.贾 第虫北京株体外纯培养经超薄切片和电镜负染观察到GLV粒 子,该病毒位于感染早期的细胞质和感染晚期的细胞核中.我 国人源GLV基因组全长为6273bp.与国外报道的GLV序列 同源性为95,编码的氨基酸同源性为9O]. 2GLV基因组结构与功能 GLV的基因组为单节段的双链RNA,由约6270bp核苷 酸组成,含有2个ORF,分别编码Gag和Pol蛋白,2个ORF有 220bp的重叠区域,Pol是通过一1核糖体移码以Gag—Pol融合 蛋白的形式表达.基因组dsRNA5非编码区(UTR)含367 bp,5末端无帽状结构,其确切结构尚不清楚,在正链RNA5端 发现5个AUG,后面有3,46个氨基酸残基的ORF,这些小的 ORF有的互相重叠,但都不表达,其确切功能尚不清楚.3 UTR含300bp,3末端有游离的3OH(羟基). GIV的转录即以dsRNA为模板在转录酶的作用下以全 保留的方式合成正链RNA研究表明,GLV负链RNA3端1 , 27bp与转录起始有关,能形成茎一环(stem—loop)结构,它对 于正链RNA的合成具有重要意义当1,27bp碱基发生缺失 * 【基金项目】国家自然科学基金资助项目(No.30300960) 【作者简介】刘全(1973),男(汉族).四JI1人,1997年毕业于 解放军农牧大学兽医专业,博士.现为军事医学科学院军事兽医 研究所助理研究员,主要从事分了:寄生虫学研究. Email:cchdz@sohu.0ore 【通迅作者】Email:zhangxic@public.CC.j1.crl 中国寄生虫病防治杂志 ChinJParasitDisCon 2005年l2月第18卷第6期 December2005,Vo1.18,No.6?465? 或突变时,茎结构被破坏,GLV转录终止,当碱基突变但保持原 有的二级结构,GIV仍然可以转录,说明该结构与GIV的转录 密切相关,被认为是GIV的转录起始位点[. GLVmRNA能被TRNA连接酶环化,与荧光素酶基因 (1ue)的嵌合体体外转录体加上帽状结构类似物,luc表达水平 下降,表明GIV正链RNA5端没有帽状结构,显示GlV正链 RNA和贾第虫细胞mRNA存在相同的翻译机制.研究发现贾 第虫蛋白质合成是通过16S样rRNA与mRNA碱基配对起 始,与原核生物类似..原核生物蛋白质合成起始需要mR— NA与16SrRNA间的碱基配对关系,mRNAAUG上游3,12 个碱基处有一段富含嘌呤的保守序列,其一致序列为AG— GAGGG,称为SD序列,它与16SrRNA3端互补,该序列的突 变可抑制翻译的进行.SD序列与AUG的距离也影响蛋白质 的翻译效率,最理想距离为7,9bp,贾第虫mRNA的5端 mRNA非翻译区非常短,只有1,6bp,无法满足SD序列与 AUG之间理想距离.在大肠埃希菌mRNA中存在另一种翻 译起始信号,它位于起始密码子下游,并且与16SrRNA的3端 互补,称为DB(Downstreambox),它含有13bp,在没有SD序 列时能起始蛋白质翻译.研究发现GLV壳蛋白编码区前264 bp能提高翻译效率近5000倍,通过序列分析发现在该区域 432,444bp含有一嘌呤区(5r_CCGGGGGGGGCUU,3),与 rRNA序列的1382,1396bp的15个碱基互补,在不改变阅 读框的情况下通过缺失或点突变证实GLV的432,444bp为 大肠埃希菌类似的DB,它的序列及与AuG的距离影响蛋白质 的表达水平.序列分析发现贾第虫tuRNA的AUG下游也存 在DB序列,这种现象正是贾第虫原始特性的表现,体现了在生 物进化过程中贾第虫的特殊地位. 在原核生物或真核生物中蛋白质翻译时,核糖体移码是核 糖体在mRNA特异序列处从一可译框架移至另一可译框架的 作用,是某些RNA病毒在翻译水平上调控蛋白质的合成,核糖 体移码包括+l核糖体移码和一l核糖体移码,许多小RNA病 毒利用一l核糖体移码,以Gag—Pol融合蛋白的形式合成RNA 聚合酶诱导一1核糖体移码的产生包括2种结构,1种是存 在不稳定序列(Slipperysequence)结构,使氨基酰tRNA与密码 于配对,然后向前或向后移动1个碱基,移动后密码子仍可和 反密码子配对,一般不稳定序列有XXXYYYZ样结构,3个碱 基表示Gag的阅读框,该序列允许tRNA在mRNA上把XXY 和YYz返回1个碱基,并且仍能正确配对.其中X可以是任 何碱基,但Y只能是A或U,Z可以是除G外的任意碱基;另一 种结构是不稳定序列下游的二级结构,即茎一环结构或RNA假 结,该结构使核糖体在移码位点暂停,使氨基酰tRNA有充足 的时间完成碱基配对的调整,引起核核糖体暂停的原因是相邻 的密码子所需的氨基酰tRNA为稀有tRNA,或是由释放因子 缓慢识别终止密码子,或是mRNA结构(如假结)的抑制作用, 假结比简单的茎一环结构更能有效地促进移码.这种机制不仅 能确保Gag和GagPol融合蛋白在翻译过程中以固定的比例 合成,而且Gag—Pol融合蛋白中Gag结构域为RNA聚合酶提 供了识别信号,以便其以固定的比例插入新装配的病毒粒子. GLV也是利用了这种机制合成Gag—Pol融合蛋白,其中Gag— I.l融合蛋白和Gag蛋白的比例为l:6o,即GLV,1核糖体移 码频率为1.7其基本结构包括不稳定序列ccCUUUA,以 及下游的茎一环结构l2. 壳蛋白5端编码区的264bp能提高翻译效率,使蛋白质的 表达量提高近5000倍,该264bp编码区中含有内部核糖体进 入位点(Internalribosomalentrysite,IRES),其功能是在病毒 蛋白翻译过程中与宿主细胞核糖体40S亚基结合EZo.ao].核糖 体在进行肽键合成前必须沿RNA分子进行识别并与之结合, 通常是由mRNA的帽状结构完成的,但是其正链RNA作为 mRNA时并无帽状结构供核糖体识别.GLV为核糖体识别提 供了另外一种形式的识别和结合位点,即被称之为核糖体进入 位点,也称为内部核糖体进入位点.研究表明,GIV的IRES 位于壳蛋白编码区5端的264bp,包括基本结构有与16S样 rRNA的3端互补的DB(66,78nt),茎一环结构I(11,35 bp),II(144,164bp),HI(166,182bp,IVA(193,214bp)及 茎一环?A下游的五核酸(216,220bp)5一UCUUC3.通过 定点突变五核苷酸中的任意2个,GLV转录体的翻译水平大大 降低,但是这两段序列互补改变,翻译水平叉会恢复到原来的 水平,证实该五核苷酸的作用是与茎一环?的5GGAGA一3形 成碱基配对,因此IRES的3个基本元件就形成1个假结 (Pseudoknot),位于起始密码子下游143bp处,该假结的碱基 突变使其结构受到破坏,GLV转录体的翻译水平下降,说明该 假结能形成严格的复合体,以利于核糖体的识别并与之结合. 在GLV转录体IRES的5端中有1个AUG,通过点突变使其 变为CUG,结果其翻译水平仅为原来的0.5,当把AuG移至 原来位置上游或下游1个或2个密码子处,其翻译水平仍然不 能恢复,表明病毒IRES对于GLV转录体的翻译起始具有准确 的定位.有许多病毒的IRES位于病毒转录体AUG下游,使翻 译水平提高,如甲型肝炎病毒的IRES位于壳蛋白编码区5端 约114bp处,使翻译水平提高3,4倍,辛德毕斯病毒IRES位 于蛋白编码区前266bp处,能使其转录体翻译水平提高1O倍. GLV内部核糖体进入位点也反映了其宿主贾第虫蛋白质 翻译的原始特性,贾第虫细胞mRNA没有帽状结构,5端翻译 区非常短,一般为1,6bp,核糖体40S亚基如何识别mRNA分 子促使翻译起始还不清楚.GIV转录体与贾第虫细胞mRNA 具有相同的翻译机制,GLV转录体IRES结构与功能关系的研 究对于阐明贾第虫细胞mRNA的AUG下游是否存在类似的 元件具有重要意义,它可以作为贾第虫细胞mRNA翻译起始 研究的实验模型. GLV正链RNA在细胞质中被包装成病毒粒子,包装位点 位于正链RNA587o,5912bp,形成一茎一环结构,研究证实其 茎结构,环序列及突出碱基A都是其包装所必需的,正链RNA 被包装成病毒粒子,以正链RNA为模板合成负链RNA,形成 双链RNA,负链RNA合成需要正链RNA3端提供复制位点, 通过序列分析发现正链RNA3端624O,6277bp之间能形成 茎一环结构,可能为其复制位点. 3GLV基因组编码产物 GLV编码2种蛋白,其中壳蛋白(gag)由ORF1编码,分子 质量单位为100ku,称为pl00;RNA依赖的RNA聚合酶(pod 由ORF2编码,通过一1核糖体移码(Ribosomalframeshifting) 以融合蛋白(gal—pod的形式表达,分子质量单位为19oku,称为 p190,pl00为主要的编码蛋白,p190约为plO0的2.蛋白质 序列分析表明,在p100和p19O的N端已经缺失了ORF1的前 ? 466? 中国寄生虫病防治杂志 ChinJParasitDisCon 2005年12月第l8卷第6期 December2005,Vo1.18,No.6 32个氨基酸,但在兔网织红细胞裂解物的体外翻译系统和重组 杆状病毒表达系统中合成的蛋白质却保留了前32个氨基酸, 表明pl00和p190本身不存在自我酶解作用,冈此GLV壳蛋 白的成熟可能存在由半胱氨酸蛋白酶参与的翻译后加工过程. 研究表明,贾第虫感染GLV后,半胱氨酸蛋白酶表达的活性升 高,病毒蛋白翻译后加工可能有宿主半胱氨酸蛋白酶参与, GLV壳蛋白翻译后加工对于病毒的组装及成熟具有重要作 用Eaz3.在自然界中有许多宿主因子参与病毒复制过程的例子, 如细胞蛋白酶参与冠状病毒的复制,披膜病毒蛋白E-和Ez的 糖基化需要细胞信号蛋白酶的参与等.对于这种细胞蛋白酶 的具体情况尚不清楚,需要进一步分离鉴定,GLV壳蛋白N端 修饰对病毒包装及成熟的生物学意义也需进一步研究. GLV的RNA依赖RNA聚合酶在病毒的增殖过程中起重 要作用,它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因,另 一 方面也将病毒增殖所需的蛋白质和酶类的基因转录成mR NA,也就是说它担负了复制酶和转录酶的双重功能.Routhier 等口比较了几种真菌病毒科的病毒发现,GLV的RDRP至少 有8个保守区域,其中区域4高度保守,对RNA的聚合功能具 有重要作用,区域1,2,8可能并不是聚合酶的活性位点,但是 区域8中高度保守的精氨酸在RDRP三级结构的形成中起重 要作用.它们主要包括RNA聚合,三磷酸核苷酸结合及模板 与产物结合的RNA聚合酶等功能,典型的GDD三肽被认为是 RNA聚合酶的明显标志,在许多情况下GDD由酪氨酸领头定 位于疏水氨基酸的延伸处.Poeh等则认为RDRP由4个主 要的区域组成:A区D*****D为酸性区,B区G***T ***是核苷酸结合的核心区,C区GDD是催化功能的核心 区,D区LKR为碱性区,这些区域经常被易变的绞链结构有规 则地分隔并连成1个连锁区域.因此参与每一反应的功能区 域分析及复制酶与转录酶转换的分子机制将是RDRP研究的 两个方向. 4GLV载体 GLV具有高度宿主特异性,GIV及其cDNA体外转录体 具有感染性,小而稳定,易于纯化,感染效率高,每个细胞可感 染10个GLV,且不影响虫体正常形态,对细胞生长无毒性,壳 蛋白是病毒表达的主要蛋白,因此以GLV作为基因转染载体 或表达载体具有无可比拟的优点口.近年来反向遗传学技术 的兴起为GLV载体的构建提供了技术手段,解决了对RNA病 毒基因组难以操作的难题,为RNA病毒的分子生物学研究开 辟了新途径.Wang等口构建了GIV全长cDNA克隆,之后 制备了GLV和萤光紊酶基因的嵌合体,通过体外转录及电穿 孔技术在贾第虫中表达了荧光素酶基因,但其表达只能持续4 d.Yu等[36j通过优化GLV的顺式作用元件,使荧光素酶基因 的表达在没有选择压力时能持续到30d. GLV载体的建立为贾第虫分子生物学的研究提供了新的 途径,为GLV基因组复制与表达调控机理,GIV与宿主间相互 关系,贾第虫病的基因治疗,疫苗研制以及构建新型病毒载体 等研究奠定基础 5问题与展望 目前对GLV基因组复制与表达调控已有初步的r解,用 GLV作为载体在贾第虫中进行外源基因的稳定表达取得成 功[a73.但作为一种原虫病毒,GLV与宿主间的相互关系尚不 清楚.病毒的出现与某些致病性原虫的毒力成分有关,如阴道 毛滴虫存在表型抗原P270不同的两种群体,I型能低水平合 成P270,不表达表面的免疫原,?型存在有表面抗原阳性和阴 性的不同群体,只有?型含有病毒,表明表型变异与病毒感染 有关,病毒感染可导致虫体毒力降低,但GLV对贾第虫基因表 达及毒力的影响尚不清楚,仅发现GIV感染可影响细胞的生 长率.尽管如此,GLV为贾第虫的分子生物学研究,贾第虫病 的基因治疗及疫苗研制提供了新的途径,随着GLV研究的深 人,贾第虫病的防治必将出现一个新的局面. 【参考文献】 r1]MatternCFT,DiamondLS,DanielTL.VirusesofEntamoe乩 histolytica.II.Morphogenesisofthepolyhedralparticle (ABRAM2一HK9)HB一301andthefilamentousagent(ABRM)2? HK9[J].JVirol,1972,9:342—358. [2]DiamondLS,MatternCF.VirusofEntamoebahistolyticaIiden— tificationoftransmissiblevirus—likeagents~J].JVirol,1972.9: 326—341. [3]WangAI,WangCC.Thedouble-strandedRNAinTrlchomonoas vaginalismayoriginatefromviruslikeparticles[J].ProcNatl Acad,1986,83:7956—7960. 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