工厂中环境和海产品加工前后的微生物学检验

第 22卷第 5期 2003年 9月 无 锡 轻 工 大 学 学 报 Journal of W uxi University of Light Industry V01．22 No．5 Sep． 2003 文章编号 ：1009—038Xl2003)05—0086—05 工厂中环境和海产品加工前后的微生物学检验 卢红梅， 张义 明 (贵州工业大学 化学与生物工程学院，贵州 贵阳 550003) 摘 要：检测了2个海产品加工厂的环境及加工前后海产品样品的菌落总数(个／cm2，个／g或个／ mL)、李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌数(每 100 cm2，100 g或 100 mL样品的 MPN数)。其结 果如下：2个工厂对应样品的菌落总数及其分布规律相接近，但李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌 的出现率和数量却相差很大；单核细胞增生李氏菌数都低于或远低于李斯特 氏菌，且单核细胞增 生李氏菌与李斯特氏菌的数量和分布呈正相关；加工后海产品中的李斯特氏菌和单核细胞增生李 氏菌可能来自原料和加工过程 ；环境中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌主要来 自原料． 关键词：菌落总数；李斯特氏菌；单核细胞增生李氏菌；微生物学检验 中图分类号：TS 201，3 文献标识码 ：A M icrobiological Test of Environment and Seafood Samples before and after Processing LU Hong-mei， ZHANG Yi—ming (Chemical and Biological Engineering CoUege，Guizhou University of Technology，Guizhou 550003) Abstract：The environment samples and seafood samples before and after the starting of tWO seafood processing plants were tested in terms of aerobic bacterial count(CFU／cm2，CFU／g or CFU／mL)， Listeria spp， and Listeria monocytogenes (per 100cm2， lOOg or 100ml sample’8 MPN determ ination)。 and the results showed the followings：The aerobic bacterial counts and the distribution in the samples obtained from the two plants were similar with each other，but the M PN determ inations and distribution of Listeria spp，and Listeria monocytogenes were obviously different with each other；The amount of Listeria monocytogenes increased with the amount of Listeria spp，； The MPN determ inations of Listeria monocytogenes were less or much less than those of Listeria spp．；The Listeria spp， and Listeria monocytogenes in the seafoo d product might come from the production process and the materials， and the materials resulted the higher MPN determinations in environment samples． Key words：aerobic bacterial count；Listeria spp，；Listeria monocytogenes；microbiological test 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocyto— genes)，又名单核细胞增生李氏菌，广泛地存在于各 收稿日期：2003—04—05； 修回日期：2003—05—20． 作者简介：卢红梅(1967一)。女。重庆人，副教授。工学硕士 种食品和环境 中．其 中食品是最主要的传染源，菌 体是通过接触食物的表面而进入食物的I1t 2I，单核 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5期 卢红梅等：工厂中环境和海产品加工前后的微生物学检验 87 细胞增生李 氏菌的检测普遍采用增菌、分离、鉴定 等方法，目前已有多种方法对该菌进行分离、鉴定． 作者采用 ISO(International Standard Organization) 11290—1推荐的以 DFB(Demi．Fraser Broth)和 FB (Fraser Broth)为增菌液的二级增菌法 J。FB还是 USDA(United States Department of Agriculture)使 用的第二级增菌液．由于增菌液的选择性及七叶苷 被李斯特氏菌(Listeria spp．)利用后与铁离子产生 的颜色反应，使得该法被广泛地使用[ ．5】．PALCAM 琼脂被 IDF(International Dairy Federation)推荐为 单核细胞增生李氏菌的检测平板 ．PALCAM 中的化 学药品和抗菌剂能抑制非李斯特 氏菌的生长[61．由 于菌体的溶血作用。可将单核细胞增生李 氏菌、西 尔李氏菌(L．seeligeri)在 EHA(Enhanced haemoly． sis agar)上与其它李斯特氏菌区分开[ ．然后再通 过对鼠李糖和木糖的不同利用，而将单核细胞增生 李氏菌和西尔李氏菌区分开IS J． 本试验的目的在于检测海 产品加工前后及加 工环境的菌落总数(Aerobic bacterial count)、单核细 胞增生李氏菌、李斯特 氏菌的数量及分布规律． 1 材料与方法 1．1 对照菌株 试验 所用 对照 菌株为 单核 细胞 增生 李 氏菌 (Listeria monocytogenes)，Scott A，血清型 4b，菌株 为美国马萨诸塞州大学食品科学系 Dr．R．E Levin 所藏． 1．2 样品 从 2000年 11月到 2001年 5月。共了 2个 海产品加工厂的 104个环境样品，50个海产品和 12 个解冻冰冻虾仁的盐水样品．其中环境样品用无菌 海绵取样法，海 产品样品则是取加工前后 的海 产 品，这 2个工 厂一个是取打捞上岸 的海鱼腹部 的 肉，再将鱼皮剥去(1号工厂)；另一个则是将冰冻虾 仁用盐水解冻、沥干后上浆、裹 粉即可包装 (2号 工 厂)． 1．3 增菌液与增菌培养 根据 Is011290—1的两级增菌法，采用 DFB和 FB为增菌液【31．对于环境和海产品样品，采用 3管 最大可能数法(3管 MPN法)将每个样品与 DFB按 1：10、1：100和 1：1 000的稀释度准备 3组 9个试样 (若染菌程度较高，可增加稀释倍数)，放入 37℃恒 温室内培养 24，48 h，分别将颜色变黑 的玻璃瓶或 试管内的溶液混匀，吸取 0．1 mL加入灭菌调配好 的 9．9 mL FB试管中，37℃恒温培养 48 h，对颜色 变黑的试管(阳性)进行下一步的分离操作． 1．4 选择性分离平板 将二级增菌液 FB中的阳性样品(溶液变黑的 试管)混匀，用划线法在 EHA[’】和 PALCAM 琼脂平 板[ ]上分离 ．在 37℃下培养 48 h，单核细胞增生李 氏菌和西尔李氏菌都在血红色的 EHA上呈 0．5— 1．5 mm左右的淡黄色菌落，菌落周围有透明圈，同 时在紫外灯(366 nm)下所有李斯特氏菌呈现荧光． 在 PALCAM 琼脂平板上，单核细胞增生李 氏菌的 菌落则呈直径为 0．5～1．5 mm、带灰绿色中心凹陷 的黑色菌落，且菌落周围有较大的黑色区域． 1．5 菌株鉴定 参照对 比菌株在各培养基上的特征。从 EHA 和 PALCAM 上分别挑选 5个典型菌落按划线法在 含 0．6 g／dL酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSAYE)[8】 上再次分离．经过 37℃、24 h的培养，菌落应呈现 均匀的半透明、微凸起、直径为 1．0—2．0 mm 的纯 菌落，从 45。倾角观察呈现淡蓝至蓝灰色．若菌落不 纯，应挑选典型菌落再次分离．将 TSAYE上的纯菌 落再次接种到 EHA(来 自 PAI CAM)和 PALCAM (来 自EHA)以检查在不同培养基上菌落的典型性； 利用 TSAYE上的纯 菌落可分析血清学类型(应为 1型或 4型)、革兰 氏类型(应呈阳性)、有过氧化氢 酶活性 镜检应呈短杆状和带翻转的运动性；同时 将 TSAYE上的菌体接种于 TSBYE试管 内，培养过 夜，再接入紫色的碳水化合物肉汤Is】中，37℃培养 5—7 d，单核细胞增生李 氏菌由于可利用 鼠李糖而 使试管内的溶液从紫色变成黄色，由于不能利用木 糖而使该试管紫色不变 ；西尔李 氏菌对鼠李糖、木 糖的利用则相反． 1．6 计数 1．6．1 琼脂平板计数 菌落总数的测定采用琼脂 平板 计 数 法，将 0．1 mL不 同稀 释 度 的样 品 在 TSAIs】上均匀涂布，20℃培养 3 d后，在菌落计数 机上计数，由平板菌落数和稀释度可算出样品的菌 落总数(个／cm2、个／g或个／mL)． 1．6．2 MPN计数法 单核细胞增生李氏菌、李斯 特氏菌的计数采用 3管 MPN法，样品按稀释度分 的 3组 9个样(每组 3个重复)中，海产品的量分别 为 10，1，0．1 g；环境样品分别代表 10，1，0．1 cm 的 面积；盐水量分别为 10，1，0．1 mI ．每个样品中只要 出现一个或几个 能被确定的单核细胞增生李 氏菌 就呈阳性，李斯特 氏菌则根据 FB试管呈阳性的个 数来计算．若样品的染菌程度较大，可加大稀释度， 使整个样品组中至少有一个为阴性，就可利用 3管 维普资讯 http://www.cqvip.com 88 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 22卷 MPN法的图表查出每 100 g、100 cm 或 100 mL样 品的微生物数量． 2 结果与讨论 2．1 菌落总数 从表 1，2可得出海产 品加工厂环境与海产品 加工前后的菌落总数及其分布规律 ． 2．1．1 对环境样品 从 1号工厂的 E4远低于 E1． E2，E3；2号工厂的 E3远低于 E1，E2，E4．说 明墙壁 样品的菌落总数较其它样品低得多．从 1号工厂的 E3远高于 E1，E2，E4；2号工厂的 E1远 高于 E2． E3，E4．说明无论温度的高低如何，一直处于潮湿状 态的排水沟样的菌落总数较其它样(包括干燥的排 水沟)高得多． 2．1．2 对海产品样 1号工 厂和 2号工厂海产品 加工前后的菌落总数介于环境样品之间．1号工厂 海产品加工前后的菌落总数变化不大，2号工厂除 少数样外，冰冻虾仁原料的菌落总数都高于加工后 的样品，解冻盐水的菌落总数与原料接近 ．另外。2 号工厂原料加工前 的菌落总数高于 1号工厂的原 料，2个工厂产品的菌落总数很接近．这说明原料经 过加工后，若加工前菌落总数不高，加工后变化就 不大；若加工前菌落总数较高，加工后有所降低。也 说明加工过程不会导致菌落总数的增加． 表 1 1号工厂各样品的菌落总数 Tab·1 Aerobic bacterial count in plant# 1 个／cnI2，个／g或个／mL 注 ：El指螃蟹加工线前的排水沟(干燥)；E2指鱼肉加工线旁的排水沟(干燥)；E3指原料冷藏间内排水沟(潮湿)；E4通风道下 螃蟹加工线旁的墙壁 ；NP指无样品． 表 2 2号工厂各样品的菌落总数 Tab．2 Aerobic bacterial count in plant# 2 个／锄 ，个／g或个／mL 注 ：El指解冻罐旁的排水沟(潮湿 )；E2指包装机旁 的排水 沟(干 燥)：E3指裹粉机旁 的墙壁 ；E4指裹粉机的底座；NP指无 样品． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5期 卢红梅等：工厂中环境和海产品加工前后的微生物学检验 89 2．2 李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌 由表3和表 4可得出海产品加工厂的环境与海 产品加工前后的李斯特 氏菌和单核细胞增生李 氏 菌的数量及分布规律． 表 3 1号工厂每 100锄 ，100 g或 100 mL样品中李斯特氏菌／单核细胞增生李氏菌的 MPN数 Tab·3 MPN determinations for Listeria spp．／Listeria monocytogenes in 100 cm2，100 g or 100 mL sample in plant#1 注：E1指螃蟹加工线前的排水沟(干燥)；E2指鱼肉加工线旁的排水沟(干燥)；E3指原料冷藏间内排水沟(潮湿)；E4通风道下 螃蟹加工线旁的墙壁 ；NP指无样品． 表 4 2号工厂每 100锄 ，100 g或 100 mL样品中李斯特氏菌／单核细胞增生李氏菌的 MPN数 Tab．2 MPN determinations for Listeria spp．／Listeria monocytogenes in 100 cm2，100 g or 100 mL sample in plant#2 注：E1指解冻罐旁的排水沟(潮湿)；E2指包 装机 旁的排水沟(干燥 )：E3指裹 粉机 旁的墙壁 ；FA指裹粉机 的底座 ；NP指无 样品 2．2．1 对环境样品 与菌落总数的分布规律一 致。2个工厂墙壁样的李斯特氏菌和单核细胞增生 李氏菌的出现率和数量都低于或远低于其它样品． 特别是 1号工厂，其 E4的李斯特 氏菌和单核细胞 增生李 氏菌的检出率为零 ．但 1号工厂与 2号工厂 一 直处于潮湿状态的排水沟样 的李斯特 氏菌和单 核细胞增生李 氏菌 的出现率和数量却相差很远．2 个工厂中李斯特 氏菌 的出现率和数量明显高于同 一 样品的单核细胞增生李氏菌，且单核细胞增生李 氏菌的数量随李斯特 氏菌数量的增加而增加． 2．2．2 对海产品样品 2号工厂海产品在加工前 后及解冻盐水中李斯特 氏菌的出现率为 100％，1 号工厂的在 30％左右，且数量上也要低得多 ；1号 工厂海产 品在加工前单核细胞增生李 氏菌 的出现 维普资讯 http://www.cqvip.com 90 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 22卷 率为零，加工后有检出，但很低，说明原料未感染单 核细胞增生李氏菌，加工过程中有感染的可能但数 量不大；2号工厂海产品在加工前后及解冻盐水中 单核细胞增生李氏菌的出现率为 3O％左右，从其分 布来看。单核细胞增生李氏菌的来源 可能是原料、 解冻盐水或加工过程 ． 3 结 论 1)比较 2个工厂的所有样品，对应样品的菌落 总数相接近；李斯特氏菌和单核细胞增生李 氏菌的 出现 率和 数量 相 差非 常 大。这 主 要 来 自原 料 的 影响 ． 参考文献 ： 2)对环境样品，菌落总数、李斯特氏菌数量和 单核细胞增生李 氏菌数量的分布规律都是墙壁最 少，设备底座其次，干燥排水沟较多，而常常处于潮 湿状态的排水沟最多 ． 3)对海产品而言，其菌落总数、李斯特氏菌和 单核细胞增生李氏菌的数量介于环境样品之间。单 核细胞增生李氏菌的 出现率和数量都低于或远低 于李斯特氏菌． 4)从海产品与环境间的关系上，在菌落总数方 面相关性较小(可能未体现 出来)。但在李斯特氏菌 和单核细胞增生李氏菌方面存在相互影响，即环境 中的菌体在加工时可进入海产品。而海产品加工前 (原料)的菌体量较大时，也能在环境中大量检出． C1]Beresford M R，Andrew P M，Shama G．Listeria monocytogenes adheres to many materials found in food-processing environ． ments[J]．Journal of Applied Microbiology，2001，90：1000—1005． [2]Birte Fonneshech Vogel，Ham Henrik Huss，Bente Oieniyi，et a1．Elucidation of Listeria monocytogenes contamination roUtes in cold-smoked．salmon processing plants detected by DNA—based typing methods[J]．Applied And Environmental Microbiology． 2001。67(6)：2586—2595． [3]Johansson T。Ahola-Luttila H．Pirhonen T，et a1．Improved detection of Listeris monocytogenes in soft mould-ripened cheese [J]．Journal of Applied Microbiology，2000，88：870—876． [4]Judy A Fraser，William H Sperber．Rapid detection of Listeria spp．in food environmental samples by esculin hydrolysis[J]． Journal of Food Protection。1988，51(10)：762—765． [5]Frank T Poysky，Rohinee N Paranjpye，Laura C Lashbrook．et．a1．Selective and differential medium for isolation of Listeria monocytogenes from foods[J]．Journal of Food Protect~n，1993，56(4)：326—329． [6]G Vlaemynck．V Lafarge，S Seotter．Improvement of the detection of Listeria monocytogenes by the application of ALOA，a di— agnostic，chromogenic isolation medium[J]．Journal of Applied Microbiology，2000．88：430—441． [7]Beumer R R，M C Te 删 ，L J Cox．Optimization of haemolysis in enhanced haemolysis agar(EHA)一a selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes[J]．1etters in Applied Microbiology．1997，24：421—425． [8]苏世彦 ．食品微生物检验手册[J]．北京 ：中国轻工业出版社，1998．169—174． (责任编辑 ：李春丽) 维普资讯 http://www.cqvip.com