蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的不同提取方法及含量测定

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的不同 提取方法及含量测定 陈秋生 ,梁淑轩 3 ,李　科 ,孙汉文 (河北大学 化学与环境科学学院 ,河北省分析科学与技术重点实验室 ,河北 保定 　071002) 　　摘 　要 :对超声提取、振荡提取、热水提取等不同的样品提取技术进行比较 ,选择用简便高效的超声提取 技术提取蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐. 用 N - (1 - 萘基) - 乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐含量 ,用镉柱还 原法测定硝酸盐含量. NO2 - 和 NO3 - 的回收率分别为 97. 5 %～100. 2 %和 96. 8 %～103. 7 % ,RSD 分别为 6. 05 %和 0. 24 %. 关键词 :蔬菜 ;硝酸盐 ;亚硝酸盐 ;提取 中图分类号 :O 652. 4 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :1000 - 1565 (2007) 02 - 0174 - 05 Comparison of Several Extraction Methods for the Spectrophotometric Determination of Nitrate and Nitrite in Vegetables CHEN QiuΟsheng , LIANG ShuΟxuan , LI Ke , SUN HanΟwen ( Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province , College of Chemistry and Environmental Science , Hebei University , Baoding 071002 , China) Abstract :A comparative study on three pretreatment methods , ult rasonic extraction method , shaking ex2 t raction method , and hot water stationary soaking extraction method , for the spectrophotometric determination of nit rate and nit rite in vegetable has been carried out in this paper. The results suggested ult rasonic extraction was fast and efficient . Nit rite reacts with NΟ(1Οnaphthyl) ethylenediamine to form water soluble reddish violent dye whose maximum absorptive wavelength is 540nm. Nitrate was reduced by a cadmium column , then deter2 mined by the same method as nit rite. The recovery of NO2 - and NO3 - was 97. 5 %～100. 2 % and 96. 8 %～ 103. 7 % respectively. RSD was 6. 05 % for nit rate and 0. 24 % for nit rite. The contents of NO2 - and NO3 - in different kinds of vegetables were determined by the suggested method. Key words :ult rasonic extraction ; nit rate ; nit rite ; vegetables 随着人们生活水平的不断提高和保健意识的增强 ,消费者对蔬菜的品质越来越关注. 蔬菜是人们日常生 活中不可缺少的重要副食品 ,它可提供丰富的维生素、矿物质、碳水化合物、蛋白质、脂肪、纤维素和糖酸等物 质 ,但蔬菜又是一种容易富集硝酸盐的作物. 研究表明 ,人体摄入的硝酸盐 81. 2 % 来自蔬菜 [1 ] . 虽然 　收稿日期 :2006 - 05 - 24 　基金项目 :河北大学博士基金资助项目 (NO. 026) 　作者简介 :陈秋生 (1979 - ) ,男 ,河北泊头人 ,河北大学在读硕士研究生. 　　　　　 3 通讯联系人 第 27 卷 　第 2 期 2007 年 　3 月 河北大学学报 (自然科学版) Journal of Hebei University (Natural Science Edition) Vol. 27 No. 2 Mar. 2007 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 硝酸盐本身对人体无害或毒害性相对较低 ,但现代医学证明人体摄入的硝酸盐在细菌的作用下可还原成亚 硝酸盐 ,亚硝酸盐可使血液的载氧能力下降 ,从而导致高铁血红蛋白血症 ,婴幼儿尤为如此 ;另一方面 ,亚硝 酸盐可与人类摄取的其他食品、医药品、残留农药等成分中的次级胺 (仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸) 反应 ,在胃 腔中 (p H = 3)形成强力致癌物 ———亚硝胺 ,从而诱发消化系统癌变 ,这对人类的健康构成了潜在的威胁[2 ] . 由于蔬菜中积累过量硝酸盐会对人体健康造成潜在危害 ,因此必须使蔬菜中的硝酸盐含量控制在安全 范围内. 根据我国《农产品安全质量无公害蔬菜安全要求》( GB18406. 1 —2001)的相关 ,新鲜食用蔬菜中 硝酸盐含量不超过的允许标准一般控制在 432μg/ g 以下[3 ] . 由此可以看出 ,加强对蔬菜中硝酸盐和亚硝酸 盐含量的监测、调查评价具有极其重要的意义. 其中蔬菜中硝酸盐及亚硝酸盐的简便高效提取技术和测定方 法的研究是关键的环节. 1 　材料与方法 1. 1 　仪器与试剂 UVΟ265 型分光光度计 (日本岛津) ; KQ200B 型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ; XGJΟ30 型高 纯水机 (北京永成水净化技术有限公司) ;小型绞肉机 ;恒温水浴锅 ;镉还原柱. 硝酸钾标准储备液 (相当于 200 mg/ L NaNO2) ;硝酸钾标准使用液 (相当于 5 mg/ L NaNO2) ,临用前现 配 ;亚硝酸钠标准储备液 200 mg/ L ;亚硝酸钠标准使用液 5 mg/ L ,临用前现配 ;对氨基苯磺酰胺溶液 ; N - (1 - 萘基) - 乙二胺盐酸盐溶液 ;氨缓冲溶液 (p H = 9. 6) ;0. 1 mol/ L 盐酸溶液 ;饱和硼砂溶液 ;质量分数为 10. 6 %亚铁氰化钾 ;质量分数为 4 % ,22 %乙酸锌 ;2 mol/ L NaOH ;活性炭粉末 ,以上均为分析纯试剂 ,实验过 程中均使用电阻率小于 18. 2 MΩ/ cm2 的超纯水. 蔬菜样品为市售. 1. 2 　实验方法 1. 2. 1 　样品的制备与提取 将于当天市购的新鲜蔬菜依次用自来水、蒸馏水、纯水洗净 ,切碎 ,于小型绞肉机中绞成匀浆. 准确称取 20. 00 g 匀浆样品于 250 mL 锥形瓶中 ,加入氨缓冲溶液 5 mL ,纯水 90 mL ,活性炭粉末 2 g ,70 ℃下超声提 取 10 min ,然后将试液转入 250 mL 容量瓶中 ,加入 2 mL 亚铁氰化钾溶液和 2 mL 质量分数为 22 %的乙酸 锌溶液沉淀蛋白质 ,用纯水定容至刻度 ,摇匀. 静置 10 min 后过滤 ,得清亮待测液. 1. 2. 2 　测定方法 亚硝酸盐含量的测定采用 N - (1 - 萘基) - 乙二胺分光光度法[4 ] . 准确吸取待测液 20 mL 于 25 mL 比 色管中 ,加 2 mL 对氨基苯磺酰胺溶液 ,摇匀 ,5 min 后加 2 mL N - (1 - 萘基) - 乙二胺盐酸盐溶液 ,用水稀 释至刻度 ,混匀 ,静置 10 min 后用 1 cm 比色皿以纯水为参比 ,于 540 nm 处测吸光度. 根据吸光度计算亚硝 酸盐含量. 硝酸盐含量的测定采用镉柱还原法 ( GB/ T5009. 33 —2003) . 准确吸取待测液 20 mL 于 50 mL 烧杯中 , 加入 5 mL 氨缓冲液 ,混匀后注入镉柱还原 2 次 ,还原液收集于 100 mL 容量瓶中 ,用少量水置换柱内残存样 液 ,加水定容至刻度 ,摇匀. 取适量还原液于 25 mL 比色管中 ,按上述方法测定亚硝酸盐含量 ,根据吸光度折 合计算硝酸盐含量. 2 　结果与讨论 2. 1 　吸收峰的选择 亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺反应生成重氮盐 ,再与 N - (1 - 萘基) - 乙二胺偶联生成紫红色染料. 取 2 mL 5 mg/ L NaNO2 标准使用液于 25 mL 比色管中 ,按“1. 2. 2 节”方法显色 ,在 400 ～700 nm 内不断改变 波长 ,测定其吸光度. 吸光度随波长的变化见图 1. ·571·第 2 期 陈秋生等 :蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的不同提取方法及含量测定 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 图 1 表明最大吸收波长为 540 nm. 在此波长处灵敏度最高 ,因此选择 540 nm 作为测量波长. 图 1 　吸光度随波长的变化 Fig. 1 　Change of absorbence with wavelength 图 2 　显色后生成络合物的稳定性 Fig. 2 　Stability of complexing compound after diazotization 2. 2 　显色后生成络合物的稳定性 样品中加入显色剂后所生成的络合物的稳定性随时间延长而发生变化. 取与“2. 1 节”相同浓度的亚硝 酸盐进行显色 ,显色后在 5～45 min 每隔 5 min 测定 1 次吸光度. 不同显色时间下的吸光度测定结果见图 2. 由图 2 可看出 ,在观测时间内显色反应稳定. 2. 3 　镉柱还原率的测定和镉柱的保存 2. 3. 1 　镉柱还原率的测定 测还原率之前先用稀氨缓冲溶液 25 mL 冲洗镉柱 ,然后测定 :取 20 mL 硝酸钾标准使用液于 50 mL 烧 杯中 ,加入 5 mL 氨缓冲液 ,混匀后注入镉柱还原 ,原烧杯接收流出液. 样液流完后用适量水置换柱内残存样 液. 将全部样液经镉柱再还原 1 次 ,第 2 次流出液收集于 100 mL 容量瓶中 ,再用少量水置换柱内残存样液 , 亦收集于容量瓶中 ,然后加水定容至刻度 ,混匀. 取 10 mL 还原后的溶液 (相当于 10μg NaNO2) 于 25 mL 比 色管中 ,加 2 mL 对氨基苯磺酰胺溶液 ,摇匀 ,5 min 后加 2 mL N - (1 - 萘基) - 乙二胺盐酸盐溶液 ,用水稀 释至刻度 ,摇匀. 静置 10 min 后用 1 cm 比色皿以纯水为参比 ,于 540 nm 处测吸光度. 根据标准曲线结果计 算还原率. 实验测得吸光度为 0. 314 ,计算得镉柱还原率为 99. 8 %. 2. 3. 2 　镉柱的保存 镉柱每次使用完后 ,先用 25 mL 0. 1 mol/ L 盐酸溶液冲洗 ,然后再用 25 mL 纯水冲洗 2 次 ,最后加入 25 mL 质量分数为 5 %氯化铵溶液浸泡柱子用以保护. 2. 4 　不同提取方法的比较 选择黄瓜作为供试蔬菜 ,对不同的样品提取技术进行比较. 2. 4. 1 　热水提取法 称取匀浆样品 20. 00 g 于 200 mL 烧杯中 ,加入 25 mL 质量分数为 4 %的乙酸锌溶液 ,用 2 mol/ L NaOH 溶液调 p H 为 7. 2～7. 5. 再加 1 g 活性炭粉末 ,混匀 ,于 70 ℃水浴中加热 30 min ,冷至室温. 然后将试样转入 250 mL 容量瓶中 ,定容 ,摇匀 ,静置 10 min 后过滤 ,滤液待测. 2. 4. 2 　振荡提取法 称取匀浆样品 20. 00 g 于 250 mL 锥形瓶中 ,加入氨缓冲溶液 5 mL ,70 ℃纯水 90 mL ,粉末状活性炭 2 g ,置于振荡器上振荡 30 min. 再将试样转移到 250 mL 容量瓶中 ,加入 2 mL 亚铁氰化钾溶液和 2 mL 质量 分数为 22 %的乙酸锌溶液沉淀蛋白质 ,定容 ,摇匀. 静置 10 min 后过滤 ,滤液待测. ·671· 河北大学学报 (自然科学版) 2007 年 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 2. 4. 3 　超声提取法 准确称取 20. 00 g 匀浆样品于 250 mL 锥形瓶中 ,加入氨缓冲溶液 5 mL ,70 ℃纯水 90 mL ,活性炭粉末 2 g ,70 ℃下超声提取 10 min ,然后将试液转入 250 mL 容量瓶中 ,加入 2 mL 亚铁氰化钾溶液和 2 mL 质量分 数为 22 %的乙酸锌溶液沉淀蛋白质 ,定容 ,摇匀. 静置 10 min 后过滤 ,滤液待测. 过滤液分别显色后测定硝酸盐和亚硝酸盐含量 ,结果见表 1. 表 1 　黄瓜样品用 3 种提取方法测定结果及回收率 3 Tab. 1 　Concentrations and recoveries of cucumber using three pretreatment methods 提取方法 NO2 - NO3 - 质量分数/ (μg·g - 1) 回收率/ % 质量分数/ (μg·g - 1) 回收率/ % 热水提取 0. 446 1 68. 9 148. 6 63. 5 振荡提取 0. 526 0 88. 2 151. 5 73. 1 超声提取 0. 466 1 99. 4 163. 9 98. 0 　　3 黄瓜样品加标量 : 硝酸钾标准储备液 (相当于 200 mg/ L NaNO2) 1 mL ,5 mg/ L 亚硝酸钠标准使用液 5 mL 由表 1 的结果可以看出 ,热水提取法的亚硝酸盐回收率和硝酸盐回收率最低 ,振荡提取法的亚硝酸盐回 收率和硝酸盐回收率较低 ,而超声提取法的亚硝酸盐回收率和硝酸盐回收率都很高 ,均在 98 %以上 ,并且热 水提取和振荡提取所需时间均较长 ,而超声提取所需时间较短且操作简便易行. 所以超声提取法为 3 种提取 方法中的最佳提取方法. 2. 5 　方法的精密度及回收率 2. 5. 1 　精密度实验 精确称取 20. 00 g 新鲜黄瓜样品 6 份 ,按实验方法超声提取 ,过滤 ,显色测定 ,考察方法的精密度 ,得到 其相对标准偏差为 NO2 - 6. 05 % ,NO3 - 为 0. 24 %. 表明本方法具有良好的重现性. 测定结果见表 2. 表 2 　方法的精密度( n = 6) Tab. 2 　RSD of the method ( n = 6) 样品编号 w (NO -2 ) / (μg·g - 1) w (NO -3 ) / (μg·g - 1) 样品编号 w (NO -2 ) / (μg·g - 1) w (NO -3 ) / (μg·g - 1) 1 0. 466 2 163. 9 5 0. 466 2 163. 5 2 0. 446 2 164. 0 6 0. 426 1 164. 5 3 0. 486 2 163. 4 平均值 0. 466 1 163. 9 4 0. 505 8 163. 9 RSD/ % 6. 05 0. 24 　　亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数为 - 1. 232 2. 5. 2 　准确度实验 以新鲜黄瓜作为样品本底加 3 个不同的混合标准溶液 ,按前述实验方法处理 ,每个样品平行测定 3 次 , 测定 NO2 - 和 NO3 - 的含量 ,计算方法的回收率 ,结果见表 3. ·771·第 2 期 陈秋生等 :蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的不同提取方法及含量测定 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表 3 　方法的回收率 Tab. 3 　Recoveries of the method 测定离子 本底值/ (μg·g - 1) 加标量/ (μg·g - 1) 　　测定值/ (μg·g - 1) 平均回收率/ % 1. 00 1. 448 　　1. 428 　　1. 448 97. 5 NO2 - 0. 466 1 1. 25 1. 708 　　1. 688 　　1. 728 99. 4 1. 50 1. 969 　　1. 949 　　1. 989 100. 2 10. 00 174. 4 　　173. 6 　　174. 8 103. 7 NO3 - 163. 9 15. 00 179. 6 　　177. 6 　　178. 0 96. 8 20. 00 183. 6 　　186. 3 　　171. 7 98. 3 2. 6 　蔬菜样品的测定 2. 6. 1 　标准曲线的绘制 吸取 0 ,0. 2 ,0. 4 ,0. 6 ,0. 8 ,1. 0 ,1. 5 ,2. 0 ,2. 5 ,3. 0 mL 5 mg/ L 亚硝酸钠标准使用液 ,分别置于 10 个 25 mL比色管中 ,加 2 mL 对氨基苯磺酰胺溶液 ,摇匀 ,5 min 后加 2 mL N - (1 - 萘基) - 乙二胺盐酸盐溶 液 ,用水定容至刻度 ,摇匀 ,静置 10 min 后用 1 cm 比色皿以纯水为参比 ,于 540 nm 处测吸光度. 经计算 ,其一元线性回归方程为 y = 0. 002 73 + 0. 031 20 x ( y 为吸光度 , x 为亚硝酸钠含量) ,线性相关 系数 R = 0. 999 97. 2. 6. 2 　实际样品用超声提取法提取的测定结果 利用建立的超声提取Ο镉柱还原法测定了不同品种的市售蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量 ,结果见表 4. 表 4 　蔬菜样品中硝酸盐和亚硝酸盐的含量 Tab. 4 　Concentrations of nitrate and nitrite in vegetables 样品 w (NO2 - ) / (μg·g - 1) w (NO3 - ) / (μg·g - 1) 黄 瓜 0. 466 1 163. 9 番 茄 0. 145 6 4. 576 油 菜 0. 987 0 4 555 　　 莴 苣 0. 386 0 1 044 　　 芹 菜 0. 506 2 5 198 　　 3 　结论 通过对热水提取法 ,振荡提取法和超声提取法 3 种蔬菜样品预处理方法进行比较 ,建立了蔬菜中硝酸盐、 亚硝酸盐的超声提取方法.超声提取法与国标方法相比准确度高、简便省时 ,可以用于大批量样品的处理检测. 参 　考 　文 　献 : [1 ] 任祖淦 ,邱孝煊 ,蔡元呈 ,等. 化学氮肥对蔬菜硝酸盐污染影响的研究[J ] . 中国环境科学 ,1997 ,17 (4) :326 - 329. 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